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方法論記事

生活家兎眼に新規光音響顕微鏡、光コヒーレンストモグラフィーのデュアル モダリティ網脈絡膜イメージング

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DOI:

10.3791/57135

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2018年2月8日

 ,  ,  ,  , 
1Kellogg Eye Center, Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 3Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 4Department of Radiology, University of Michigan

この記事について

サマリー

本稿では、新規のセットアップと光音響顕微鏡やウサギなどの大型動物の非侵襲的、ラベル無料網脈絡膜イメージング用光断層影像デュアル モダリティ装置の操作手順をについて説明します。

要約

音響眼球画像処理は、新たなイメージング技術音の波に光エネルギーを変換することによって眼の組織を視覚化できる非侵襲的、集中的な調査の下は、現在眼科です。ただし、ほとんどは、これまでの仕事は小さな眼球サイズによる臨床人間の翻訳のための課題がラットやマウスなどの小動物の目の後方のセグメントの画像に焦点を当てた報告。本稿では、新規光音響顕微鏡 (PAM) ウサギなどの大型動物の目の後部セグメント画像用光コヒーレンス断層法 (OCT) デュアル モダリティ システムをについて説明します。システム構成、システムの配置、動物の準備、およびin vivoウサギのイメージングの非侵襲的、ラベル無料網脈絡膜のデュアル モダリティ実験プロトコルの詳細します。PAM および OCT による網膜と脈絡膜の血管を含む、代表的な実験結果により、手法の有効性を実証する.この原稿は、ウサギの撮像結果の再現より大きい動物の光音響分光法眼を促進の実用的なガイドを提供します。

概要

最近数十年は、生体光音響イメージング1,2,3,4,5,6,7 のフィールドの爆発的な発展を目撃しています。 ,8。光の音へのエネルギー変換に基づく、新興の光音響イメージング縮尺が細胞内小器官、細胞、組織、器官から小動物全身に生体試料を可視化できるし、その解剖を明らかにすることができます、機能、分子、遺伝子、代謝情報1,2,9,10、11,12。光音響イメージング細胞生物学13,14, 血管生物学15,16, 神経17,18 などのバイオ分野の範囲のユニークなアプリケーションを見つけた、腫瘍19,20,21,22、皮膚23、薬理24、および血液25,26。眼科、眼は、光音響応用イメージング科学者や臨床医から実質的な興味を集めている、現在アクティブな調査中です。

対照的に定期的に使用される眼撮像技術27(FA) 血管造影とインドシアニン グリーン造影 (ICGA) (蛍光のコントラストに基づく)、光干渉断層計 (OCT) など (光散乱コントラストに基づく)、派生 10 月血管造影 (赤い血球の反対の動きに基づく)、コントラスト メカニズムとして使用して光吸収イメージング音響眼。従来眼イメージング技術とは異なる、眼組織の28の病態生理学的状態に通常関連付けられている目の光吸収特性を研究するためのユニークなツールを提供します。までに、かなり優秀な作品は、光音響イメージング29,30,31,32,33,34,35、眼で行われています。 36,37, しかし、これらの研究はラット、マウス等の小動物の目の後方のセグメントに焦点を当てます。先駆的な研究はよく眼科で光音響イメージングの可能性を示すが、ラットおよびマウスの眼球サイズ以来技術の臨床的翻訳の方に行くには長い道のりはまだははるかに小さい (1-3 未満) より人間。かなり長距離超音波の伝搬、により画像大きく目の後方のセグメントの技術を使用する場合非常に信号強度と画質が苦しみます。

この目標に向かって私たちは最近非侵襲的、報告を使用して生きているウサギのラベル無料網脈絡膜イメージング統合光音響顕微鏡 (PAM) と周波数領域 10 月 (SD 10 月)38。システムは、優れたパフォーマンス、網膜と脈絡膜内在性吸収と眼組織の散乱コントラストに基づいてより大きい動物の目を可視化することができます。家兎における予備的な結果を示す PAM がレーザー照射線量を使用して個々 の網膜と脈絡膜血管を区別して非侵襲的 (~ 80 ニュージャージー州) アメリカ規格協会 (ANSI) 安全限度以下大幅 (160 ニュージャージー) 570 でnm39;OCT は明らかに強膜、脈絡膜、網膜の異なるレイヤーを解決できます。PAM を使用してより大きい動物の後部セグメント イメージングの非常に最初のデモンストレーションで、ウサギ (18.1 mm)40の眼球のサイズがの軸の長さのほぼ 80% であることを考慮した技術の臨床的翻訳の方の主要なステップがあります。人間 (23.9 mm)。

この作品ではデュアル モダリティ イメージング システム ・生活家兎における非侵襲的、ラベル無料網脈絡膜イメージング用実験プロトコルの詳細な説明を提供し、代表的な網膜を介してシステムのパフォーマンスを示すと脈絡膜の撮像結果。

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プロトコル

ウサギは、アメリカ合衆国農務省 (USDA) に種が覆われています。生物医学研究での使用は厳しい規制に従う必要があります。すべてウサギ実験を行なった ARVO (視覚と眼科学研究協会) ステートメントに従って眼科と視覚に関する研究における動物の使用のため、大学による研究所動物プロトコルの承認後委員会委員の使用、ミシガン大学 (プロトコル PRO00006486、PI ヤニス Paulus) 動物 (UCUCA)。

1. システムの構成

  1. 光音響顕微鏡 (PAM)
    1. 光パラメトリック発振 (OPO) レーザーの使用は PAM. 選択の適切な技術仕様の光源としてダイオード励起固体レーザー励起パルス繰り返しレート 1 kHz、パルス期間 3-6 ns、および可変波長 405-2600 nm のよう。
    2. 570 でレーザーから発せられるビームを反映 (M1、M2)、2 つのミラーによって nm、電動回転ステージ、そして最後にフォーカス、フィルターにマウントされている半波長板の減衰器を通過し、ビーム コリメータ (図 1) によるコリメートします。ビーム コリメータのデザインを最適化します。ビーム コリメータの構成の例を含む焦点レンズ L1 (焦点距離 250 mm)、(直径 50 μ m)、ピンホールとコリメート レンズ L2 (焦点距離 30 mm)。
    3. 平行光ビームスプリッター (BS1) 90/10 (反射/透過) の分割比で除算します。パルス-パルス レーザー エネルギーを監視するためフォト ダイオード、透過部分を記録します。ミラー (M3) とダイクロイック ミラー (DM) とラスター スキャンによる反射部分をそらす二次元検流計を使用して連続して。ガルバノはスペクトル ドメイン (SD) と共有コンポーネント-OCT システム (後述)。
    4. 配信望遠鏡でスキャンしたビームから成るスキャン レンズ (焦点距離 36 mm) と眼のレンズ (OL、焦点距離 10 mm) 最後にウサギ目光学系による眼底に集中し、。
    5. 適切な技術仕様、例えば、中心周波数と針状の超音波トランスデューサーを選択 27 MHz、双方向 − 6 dB 帯域幅の 60%。励起光音響信号をキャプチャする中央の視軸を結膜との接触に配置します。
    6. 超音波増幅器を用いた信号を増幅する (たとえば、57 dB 利得) 低域通過フィルターによってフィルター処理 (たとえば、カットオフ周波数 32 MHz)、200 MS/秒のサンプリング レートでの高速デジタイザーがデジタル化して。
    7. 場所上記電源メーター、ウサギ目し、ANSI 安全に保つことは、角膜にレーザー パルス エネルギーを測定制限 160 570 nm38でニュージャージー州。Matlab から同期エレクトロニクスで制御レーザー シャッターを使用してレーザーの露出オーバーを避けるためにビームをブロックします。
    8. デジタイザーのデータ集録 (DAQ) ボードを介して、検流計、レーザーを同期します。プログラムは Matlab でシステム制御およびデータ取得用のソフトウェア。
  2. スペクトル領域光干渉断層法 (SD-10 月)
    1. 参照の腕 (図 1)、眼科 (OL) スキャン レンズ (SL) の後、一枚のレンズ分散補償ガラス (DCG) を追加して市販システムに基づく SD OCT システムを適応します。変更により、OCT システムがウサギの眼の後部セグメントをイメージすることができます。
    2. ズーム住宅管を使ってサンプル腕の光路長との一致を確保するための参照の腕の長さを調整します。アイリスを使用して、最大の画像のコントラストを達成するためにウサギ眼底から後方散乱光強度での一致を保証するためのレトロな反映参照光の強度を制御します。
    3. 発光ダイオード (LED) 外部光源として照明光とウサギ眼底のリアルタイム可視化のためのスキャン ヘッドにカプセル化電荷結合素子 (CCD) カメラを採用してください。

2. システムの配置

  1. ガルバノの位置の初期化、ファイバー コリメータ マウント、ビームスプリッター キューブのネジを調整することによって 10 月システムを合わせます。
    注: 手順市販の OCT システムのマニュアルで利用でき、ここでは説明しません。この手順は主にファイバー コリメータ、参照アーム、OCT システムのパフォーマンスを最大化するスキャン レンズの正しい配置を確保するためです。
  2. 空間的レーザー光をフィルターで除外し、最大限にレーザー エネルギーを送信または集光レンズの焦点の周りピンホールのx y、およびzの位置を調整します。高さ測定ツールを使用して、彼らが同じであることを確認するピンホールの前後には、レーザ光の高さを確認してください。
  3. チルト、偏心とコリメート レンズ フィルター処理されたビームをコリメートする L2 のz位置を調整します。ビームがおよそ同じであることを確認サイズと近傍界と遠方界で観測した時の高さ。
  4. Co 軸ミラーと DM の傾きを調整して PAM レーザービームと 10 月の光ビームを組み合わせます。この手順の後、PAM レーザーと 10 月の光が完全に一致する必要があり、ウサギ眼底をスキャン領域が同じ。
  5. 角度調整と光パスに合わせて正しく OL レンズの偏心。一度完了したら、デュアル モダリティ システムのイメージングの準備が。
    注: 自動視準メソッドをなど、これを達成するために使用し、入射光として同じ道を戻ることを確認するのに OL レンズ表面で反射する光を確認できます 1。

3. ウサギの準備

  1. 動物実験施設と体の重量と動物の数など、個人情報を記録からニュージーランド白ウサギを取る。
  2. ボディ サポートおよび光学イメージング システム表にヘッド サポートを含むウサギ プラットフォームをマウントします。ボディ サポートに水を循環させ暖房毛布を置くし、循環水の温度を実験的回復期間のウサギの体温を暖かい保つために 38 ° C に設定します。
  3. 前のプロシージャきゅうしょを記録全体的に動物の状態、粘膜色、心拍数、呼吸数、および直腸体温を含む。ケタミン (40 mg/kg) とキシラジン投与 (IM) 経由 (5 mg/kg) の混合物とウサギの麻酔し、ケタミン (スケジュール III 薬物) の使用率を記録します。心拍数、呼吸数、および全体的な状態を確認することによって麻酔レベルを確認します。
  4. トロピカミド 1% 眼とフェニレフリン塩酸塩 2.5% 眼の一滴を使用してウサギ瞳孔を広げます。
  5. 鏡を使用して、まぶたを保持する方法のうち、角膜を湿らせて目の潤滑剤の滴を適用します。局所テトラカインのドロップを植え付けるイメージ作成手順の前に目の 0.5%。
    注: 長いプロシージャまたはプロシージャ動物に可能な不快感を与えるウサギ動物の快適さを確保するための実験の前にメロキシカムの皮下注射。

4. SD OCT イメージング

  1. ウサギの臨床眼底カメラのイメージング プラットフォーム転送し、イメージング セッション 10 月前に 50 度の眼底、無料、フリー、赤、蛍光画像を取る。こう目の光透過性をチェックし、眼底血管形態と髄質光線網膜血管、視神経などのランドマークを認識できます。
  2. ウサギの OCT システムのプラットフォームに転送し、約 OL の下の目の 1 つの位置にその姿勢を調整します。LED ライトを使用して目を照らします。
    注: 技術の臨床の翻訳を容易にするウサギ目は安定、他のメソッドを使用して、ちょうど任意固定せずヘッド サポートにウサギの頭を置きます。
  3. 10 月ソフトウェアを開き、まず眼底の CCD カメラの画像を確認します。カメラの視野 (FOV) 内にある脈絡膜血管や網膜血管が興味 (ROIs) の領域を確保するため必要に応じてヘッド サポートの角度と高さを細かく調整します。
    注: ウサギが良い麻酔レベル下にある場合は、1 つの連続撮像セッションできますウサギの頭を再調整を必要とせず 10 分限りに最後。
  4. 興味の 10 月の B-スキャンを表し、スキャンを開始する直線を描画します。OCT 画像を視覚化し、鮮明な画像を取得する 10 月ソフトウェアの分散補償係数を最適化する参照のアームの長さを調整します。
    注: 参照のアームの長さを調整するとき、2 つのミラー化された 10 月画像 1 つ他の後で表示されます。適切なイメージは、眼底の解剖学の知識に基づいて識別できた。
  5. ピクセルの数と、平均値などのデータ集録パラメーターを設定し、画像を保存します。
  6. 呼吸と麻酔レベルと動物を推定するウサギの心拍数を観察の快適さ。長いセッションの補足ケタミン又はイソフルラン吸入の 3 分の 1 の線量と見なされる可能性気管内挿管、V-ゲル、または顔マスク麻酔の必要な場合の平面を維持するために。
  7. 角膜表面の脱水と角膜表層点状表層上皮性角膜症を防ぐために実験中に洗眼 2 分ごとに角膜をすすいでください。監視および記録の動物きゅうしょ 15 分毎。

5. PAM イメージング

  1. 適切なレーザー安全ゴーグルを着用、OPO レーザーを入れます。
  2. PAM 制御ソフトウェアを起動、ターゲット発色団を (例えば、 570 nm ヘモグロビン) の吸収ピークの 1 つにレーザーの波長を調整、検流計、ようにウサギ角膜前にレーザー エネルギーをモニターの位置の初期化ANSI 安全基準以下です。
  3. 三次元 (3 D) 翻訳段階に超音波探触子をマウントし、眼底を指しているウサギの結膜に接触探触子の先端位置します。良いカップル探触子の先端とウサギの結膜に目潤滑油をドロップを使用します。
  4. LED イルミネーション ライトをオンにし、Matlab ソフトウェアを介してウサギ眼底を可視化します。
  5. セット (網膜血管や脈絡膜血管) スキャンの ROI は、センター、物理サイズを含みます。レーザー シャッターを開き、ビームの B-スキャンを開始します。約探触子を配置は、1 つは検出光音響を見ることができるはず、オシロ スコープに信号。いない場合は、角膜の別の領域をスキャンまたは他の目に切り替え、上記のプロセスを繰り返すに目の位置をわずかに調整します。
  6. 検出光音響信号をオシロ スコープと B スキャン全体に沿って信号強度を最大化する探触子の位置を微調整を観察します。
    メモ: ため限られたビーム幅、超音波探触子通常が小さな FOV41。この手順では、PAM の最終のイメージの背景の変調を決定します。ミスアライメントが PAM 異種の背景を持つイメージにつながるし、画質を大きく劣化させます。
  7. データ集録パラメーターを設定します。これはピクセルの数が含まれています (e.g。、256 × 256 ピクセル)、サンプリング レート (e.g。、200 MS/秒)、遅延時間と。データ集録を開始します。Matlab ソフトウェアは自動的にレーザー光ビーム レーザー露出オーバーを避けるために完了をブロックするシャッターを閉じるし、起動を渡すためにシャッターを開きます。
    メモ: は、レーザーのパルス繰り返し周波数 (1 kHz) によって限定、256 × 256 ピクセルで画像のデータ収集を完了する約 1 分かかります。
  8. 生データを処理し、ボリュームレンダ リング38を介して最大強度の投射 (MIP)13を 2 次元 (2 D) や 3 D PAM 画像を視覚化します。
  9. 超音波探触子をアンマウント、脱イオン水を使用してヒントをすすぎ、それを収納ケースに入れてください。
  10. 眼底カメラにウサギを転送し、再眼底を調べます。この手順は、イメージング セッション後眼底のすべての形態の変化があるかどうかを確認するのに役立ちます。
  11. 角膜症、角膜表面の脱水を防ぐために実験中に点眼と角膜すべて 2 分を洗い流してください。監視および記録の動物きゅうしょ 15 分毎。
    注: パム、OCT と眼底イメージング セッション約 1 時間かかります。

6. 投稿画像

  1. 眼底再検査は眼底カメラを使用して後、V ゲルの場合は接続を切断します。目薬を使って目を洗う、デキサメサゾン眼軟膏ポリミキシン B 硫酸塩とネオマイシン フルルビプロフェン眼科を適用し、目を閉じます。
  2. 回復室に水循環毛布でウサギを転送します。シールド ボックスの光から、ウサギが自然に目覚めるまで待ちます。この期間の間に動物きゅうしょ 15 分毎に監視を記録しておくし、記録の動物施設にコピーを返します。
  3. ウサギは目覚めるし、アクティブな警告、歩行は、通常、動物施設に戻る転送します。急性実験が予定されている場合は、安楽死ソリューションを使用して動物を安楽死させる (e.g。、Beuthanasia、0.22 mL/kg、耳静脈に静脈注射) の死体の処分。
  4. ソフトウェアとレーザーをオフにします。光学ベンチをクリーンアップします。

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結果

デュアル モダリティ イメージング システムと実験的なプロトコルは、筆者らの研究室では 4 つのニュージーランド白ウサギを用いた正常にテストされています。次は、典型的な結果をいくつか紹介します。

パムと SD 10 月デュアル モダリティの画像処理システムの概略図を図 1に示します。次のモジュールで構成される: 音響光源、可変レーザー アッテネータ、ビーム コリメータ、エネルギー メーター、スキャン ヘッド、光音響検出および集録モジュール、10 月単位・同期エレクトロニクス。詳細なシステム構成は、セクション 1.1 で明細が。

デュアル モダリティの画像処理システムを用いてウサギ脈絡膜血管の典型的なイメージングの結果を図 2

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ディスカッション

高品質眼底画像はそのままで、通常の涙映画が欠かせません。不規則で劣化した涙膜が大幅イメージの質42に低下します。涙液膜の整合性を維持し、角膜の表在性点状表層角膜症を防ぐため、2 分に約非常に頻繁に目薬を使用して角膜を潤滑するが重要です。目の不透明度に関する問題がないか、細隙灯を使用し、フルオレセイン角膜の状態をチェックするストリップします。

いくつかの困難は、特に高周波成分、角膜の脱水および光学収差の距離と光音響信号の減衰を含むより大きい動物の目の後部セグメント用があるかもしれない。光音響信号振幅は通常、針形超音波振動子によって検出される前に大幅に減衰を経験します。眼球のサイズが大きいほど、大きい減衰。ウサギ (~18.1mm) の眼球のサイズはラットの約 3 倍となるウサギ目画像を特に挑戦的なマウスの 6 倍以上。達成するために画像の画質、合理的なレーザー小径 (本研究ではビーム コリメータ後 2 mm) と平行波面 (理想的な平面波面) は最寄りの組み込みの光学収差による最小影響はので、角膜や網膜にも集中することができます。この点...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、国立眼研究所 4K12EY022299 の寛大なサポートによって支えられた (ワイエムピー)、戦いの視力国際網膜研究財団 FFS GIA16002 (ワイエムピー)、失明を防ぐための研究から無制限の部門レベルのサポートとミシガン大学眼科学および視覚科学。この作品を利用するコア センターで、ビジョン研究国立眼研究所から P30 EY007003 によって資金を供給します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デュアルモダリティイメージングシステム
OPOレーザーEkspla(リトアニア、ビリニュス)NT-242
ビームアッテネーターThorlabs, Inc.(ニュートン、ニュージャージー州、米国)AHWP10M-600
電動回転ステージThorlabs、Inc.(ニュートン、ニュージャージー州、米国)PRM1/MZ8
電動回転ステージコントローラーThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)TDC001
フォーカシングレンズThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)AC254-250-B
ピンホールThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)P50S
コリメーティングレンズThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)AC127-030-B
フォトダイオードThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)PDA36A 
レーザーシャッターVincent Associates Inc.(カナダ、トロント)LS6S2T0
レーザーシャッタードライバーVincent Associates Inc.(カナダ、トロント)VCM-D1
ダイクロイックミラーSemrock, Inc.(米国ニューヨーク州ロチェスター)Di03-R785-t3-25×36
スキャンレンズThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)OCT-LK3-BB
眼科用レンズThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)AC080-010-B-ML
超音波トランスデューサOptosonic Inc. (アルカディア、カリフォルニア州、米国)カスタム
アンプL3 Narda-MITEQ (Hauppauge、NY、米国)AU-1647
バンドパスフィルターMini-Circuits(アメリカ・ニューヨーク州ブルックリン)BLP-30+
デジタイザーDynamicSignals LLC (米国イリノイ州ロックポート)PX1500-4 
同期エレクトロニクスNational Instruments Corporation (米国テキサス州オースティン)USB-6353
OCT moduleThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)Ganymede-II-HR
分散補償ガラスThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)LSM03DC
イルミネーション LED ライトThorlabs, Inc. (ニュートン、ニュージャージー州、米国)MCWHF2 
パワーメーターThorlabs、Inc.(ニュートン、ニュージャージー州、米国)S121C 
パワーメーターインターフェースThorlabs, Inc.(米国ニュージャージー州ニュートン)PM100USB 
高さ測定ツール Thorlabs, Inc.(米国ニュージャージー州ニュートン)BHM1
底カメラトプコン株式会社(東京) TRC 50EX
MatlabMathWorks (Natick, MA, USA)2017a
OscilloscopeTeledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA)WaveJet 354T
Animal experiment
Water-circulating blanketStryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA)TP-700
Ketamine hydrochloride注射Par pharmaceutical, Inc.(米国ニュージャージー州ウッドクリフレイク)NDCコード42023-115-10
塩酸キシラジンVetOne(米国アイダホ州ボイシ)NDCコード13985-704-10
Tropicamide ophthalmicAkorn Pharmaceuticals Inc.(米国イリノイ州レイクフォレスト)NDCコード17478-102-12
フェニレフリン塩酸塩眼科Paragon BioTeck, Inc.(米国オレゴン州ポートランド)NDCコード42702-102-15
アイ潤滑剤ハブ ファーマシューティカルズ LLC (カリフォルニア州ランチョクカモンガ、米国)NDC コード 17238-610-15
EyewashAltaire Pharmaceuticals, Inc. (ニューヨーク州アケボーグ、米国)NDC コード 59390-175-18
テトラカイン塩酸塩眼科用溶液Bausch&Lomb, Inc. (米国ニューヨーク州ロチェスター)NDCコード 24208-920-64
フルルビプロフェンナトリウム点眼液Bausch &Lomb, Inc. (米国ニューヨーク州ロチェスター)NDCコード 24208-314-25
ネオマイシンおよびポリミキシンB硫酸塩およびデキサメタゾン眼科軟膏Bausch&Lomb, Inc.(米国ニューヨーク州ロチェスター)NDCコード24208-795-35
Meloxicam injectionHenry Schein Inc.(米国ニューヨーク州クイーンズ)NDCコード11695-6925-1
ー 眼

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