Method Article

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

DOI:

10.3791/57139

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Mass General Institute of Neurodegenerative Disease, 2Department of Geriatric Neurology, Nanlou Clinical Division, PLA General Hospital

In This Article

Summary

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このプロトコルは当てて神経細胞樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) の定量分析、ショウジョウバエ、樹状突起の形態形成の研究に使用することができます。

Abstract

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樹状突起、ニューロンは、分岐予測、樹状突起の形態が神経系の開発の間にシナプス組織を反映しています。ショウジョウバエ幼虫の神経樹状パターン形成 (da) は、神経樹状突起、神経系の発達における遺伝子の機能の形態を研究するための理想的なモデルです。Da 細胞の 4 つのクラスがあります。クラス IV は larval ボディ壁のほぼ全領域をカバーする分岐パターンと最も複雑です。クラス IV の神経樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) 4 つのパラメーターを使用してSOX5のショウジョウバエ相同をサイレンシングの効果を特徴付けた以前: 樹状突起の長さ、デンドライト カバレッジの表面積、分岐、および分岐構造の合計数。このプロトコルは NDAC 定量分析、幼生解離、共焦点顕微鏡と ImageJ ソフトウェアを使用して画像解析手順で構成されるワークフローを示します。Da ニューロンの開発とその基になる機構にさらなる洞察力、神経機能の理解を改善し、神経の根本的な原因についての手がかりを提供して神経発達障害。

Introduction

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樹状突起、ニューロンの分岐予測であるは、他のニューロン1,2からニューロンの感覚およびシナプス入力を含むフィールドをカバーします。樹枝状結晶はシナプスの形成の重要なコンポーネントおよびニューロンに電気刺激の伝播し同様、シナプスの入力の統合において重要な役割を果たします。樹状分枝 (da) は、新しいシナプスを作成する新しい樹状分枝ニューロンを形成するプロセスです。Da 支店密度などグループ化パターンの形態と開発多段階の生物学的プロセスの結果、神経機能に相関の高い。このプロトコルの目的はの神経 dendritric 楔形の複雑さの定量分析のためのメソッドを提供するショウジョウバエ。

樹状突起の複雑さは、シナプスの種類、接続、およびパートナーのニューロンからの入力を決定します。分岐パターンおよび樹枝状結晶の密度は樹状フィールド3,4上に収束する信号処理に関与しています。樹状突起は、開発調整の柔軟性を持っています。例えば、シナプス合図では、体性感覚ニューロン発達段階と成熟した神経系5のデンドライト組織に影響を及ぼす。神経接続の確立は、形態形成と樹状突起の成熟に依存します。樹状突起の奇形....

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Protocol

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1. 実験準備

  1. 次の試薬の準備: ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (PBS);トリトン X-100;0.2 %pbst (PBS + 0.2% トリトン X-100);32% パラホルムアルデヒド (PFA) 4% 使用前に希釈シリコーンのエラストマー ベースと硬化剤;antifade マウント媒体 (例えば、延長金);指の爪のポーランド語。
  2. 次の機器を準備: 解剖顕微鏡 2 シャープな鉗子と顕微解剖、解剖皿、顕微鏡のスライドや coverslips、共焦点顕微鏡を作るためのシャーレ用ピン数顕微解剖用ハサミと、フィジー ImageJ ソフトウェアがインストールされたコンピューター。

2. 幼虫コレクション

  1. それぞれ W1118野生型ハエや ppk GAL4、UAS GFP と UA Sox102F RNAi ハエを仲間します。文化は、25 ° C で標準状態で飛ぶ
  2. 5 〜 6 日 UA Sox102F RNAi の 3 齢幼虫を収集/ppk GAL4 や UAS GFP、UAS GFP ppk GAL4/+ 解離ピンセットで慎重にコントロール。

3. 幼虫の郭清

注: このセクションのすべての手順は、顕微解剖顕微鏡の下で運営さ....

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Results

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Da ニューロンの樹状突起は、da 神経相馬と GFP 蛍光分析の樹状のアーバー (UA GFP; ppk GAL4) co 過剰発現の GFP でラベル付けされました。Da ニューロンの樹状突起の形態は、倒立共焦点顕微鏡 (図 2) でイメージしました。

Da ニューロンの樹状突起は、フィジー ImageJ ソフトウェアを使用して追跡しました。ファイルは、樹状突起長 (図 3) を推定する使用されました。Da ニューロン (N = 21) (UA-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4; Sox102FのサイレンシングUAS-GFP) コントロールと比較してシンプルな構造をもつ樹枝状結晶および短い枝の長さの数の大幅な削減につながった (N = 20) (UA GFP; ppk GAL4/+) 3 齢幼虫 (

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Discussion

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表皮を刺激する樹状突起、ニューロンの入力領域とどのように情報の受信を検出し、個々 のニューロンによって処理の形態を決定します。開発デンドライト形態は、デンドライト組織の遺伝子の調節を反映しています。末梢神経系のショウジョウバエ幼虫の da ニューロンは樹状突起の形成のための研究のための重要なモデル: 1) 哺乳類11,12; と機能の類似性2) 4 階級差別に基づいて樹状構造11,12;・ 3) の形態形成を調節する遺伝的要因。このプロトコルでは幼虫の準備からショウジョウバエda 細胞の画像解析までのワークフローを提案します。メソッドでは、分岐の構造、分岐数の合計表面積樹状突起の長さは、詳しくは、da ニューロンの樹状突起を分析するための 4 つの重要なパラメーターについて説明します。重要なステップは、幼虫の体壁から投射そして分析のための da ニューロンを完全に公開す.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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我々 はイメージングの技術援助のためウィリアム A. Eimer を感謝したいです。この作品は 【 R.E.T] を治療アルツハイマー病の資金によって支えられた、国立衛生研究所の 【 R01AG014713 ・ R.E.T; に R01MH60009R03AR063271、アダムローリーに R15EB019704] 国立科学財団 [アダムローリーに NSF1455613]。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
パラホルムアルデヒド(PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 シリコーンエラストマーベースおよび硬化剤Dow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold 退色防止マウンタントThermo Fisher ScientificP36931
フィンガー ネイル ポリッシュ CVS72180
実体顕微鏡ニコンSMZ800
共焦点顕微鏡ニコンエクリプス Ti-E
シャーファルコン353001
鉗子デュモン11255-20
はさみ Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
ピン Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
顕微鏡スライドとカバースリップフィッシャーサイエンティフィ15-188-52
レ 昆虫ック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K.,....

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