交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

サマリー

これ以降のプロテオーム解析の架橋クロマチンのシーケンス固有のキャプチャに依存する特定のターゲット遺伝子の新規 DNA と相互作用する蛋白質を識別する方法です。潜在的な結合蛋白質、またセル変更についての事前知識も必要ありません。技術は、当初は酵母の開発、哺乳類細胞に対して適応を今されています。

要約

プロテオミクス (HyCCAPP) の技術のクロマチン蛋白の交配のキャプチャは、酵母の新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにするために開発されました。対象地域にバインドされている可能性が高いタンパク質についての事前知識を必要とせず興味のターゲット領域の解析をことができます。これは、理論では、関心の任意のゲノム領域を分析に使用する HyCCAPP ができ、異なる電池で動作するように十分な柔軟性を提供します。このメソッドは、クロマチン免疫沈降 (チップ) とチップのようなメソッドに適しているタスク、知られている転写因子の結合部位を研究するためのものではありません。HyCCAPP の強みは、その能力のある限られた DNA 領域を探索するのにバインドされて蛋白質についての知識。それは、抗体を用いたタンパク質ベース クロマチンの濃縮によって導入されたバイアス (チップのようなメソッドに存在) を避けるために便利な方法ことができます。潜在的に、HyCCAPP は本当に新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにする強力なツールをすることができます。これまでで、酵母、哺乳類細胞の系列を繰り返す高コピー技術は主に適用されています。我々 が思い描く強力なツールになる、HyCCAPP アプローチ哺乳類細胞における単一コピーの遺伝子座を効率的にキャプチャするように最適化する必要があります。HyCCAPP はひと細胞ラインにプロトコルをキャプチャし、シングル コピー クロマチン領域はこの修正されたプロトコルを効率的に分離することができますを表示最初の酵母の我々 の適応を紹介します。

概要

過去 10 年間に、シーケンス技術、大量のサンプルと驚異的な解像度にゲノムの広い範囲の研究の劇的な改善を見ています。百科事典の DNA 要素 (エンコード) コンソーシアムは、大規模な多施設共同努力、国立ヒトゲノム研究所国立衛生研究の主導がどのように個々 の転写因子に洞察力を提供しています。その他の規制の蛋白質にバインドし、ゲノムとの対話します。初期の努力は、100 以上知られている DNA 結合蛋白質¹のクロマチン免疫沈降 (チップ) により評価した特定の DNA 蛋白質の相互作用を特徴付けられます。DNase フット プリント²ホルムアルデヒド規制要素 (放任)³のアシストの分離は、タンパク質ではなく、明白な制限を操作するゲノムの特定の領域を検索する使用されているなどの代替方法をこれらの実験的アプローチは、相互作用の蛋白質を識別しません。過去年にわたって広範な努力にもかかわらず技術浮上しているない、クロマチンと同定蛋白質 DNA 相互作用の包括的な評価とクロマチン関連タンパク質の定量が効率的にできます。

この必要性に対処するため、我々 は Hybridization Capture of Chromatin-Associated タンパク質のプロテオミクス (HyCCAPP) と呼ばれる手法を開発しました。

プロトコル

1. キャプチャ オリゴヌクレオチド設計

1. 対象地域/s の交配キャプチャ中に使用するオリゴヌクレオチドのパネルをデザインします。
   1. 最低ではなく対象地域ごとに 4-8 オリゴヌクレオチドをデザイン、ターゲットにターゲット領域の各終わりに少なくとも 1 つのオリゴヌクレオチドのデザインを目指してください。
   2. ターゲット シーケンスが長い場合 (> 500 塩基対)、対象の地域全体にわたって効果的な濃縮クロマチンを保証するためにできるだけ広げてとしてオリゴヌクレオチドをデザインします。
      注: 我々 は 4-8 オリゴヌクレオチドと最適なキャプチャを観察しました。詳細オリゴヌクレオチドでうまく処理することができます、にもかかわらずあまりにも多くのオリゴヌクレオチドを使用する場合、濃縮収量の減少を観察することも珍しくはないです。
2. 同様の溶融温度とオリゴヌクレオチドを設計し、彼らはありません強力なヘアピンを形作るまた (交配は 42 ᵒC で実施される考慮して) 強い相互作用があるかどうかを確認します。
   注: 足掛かり溶出 (4.12.3) を選択する場合追加外部 8 塩基は、オリゴヌクレオチドに追加する必要があり、溶出¹⁷時 'リリース' の相補的なオリゴヌクレオチドが必要になります。オリゴヌクレオチドを分析し、いくつかの商用ソフトウェア ツ....

結果

クロマチンの入力量が多い HyCCAPP を成功させるために必要な細胞は密度の比較的高いレベルに成長してください。トリパン ブルー染色の細胞死亡率が中程度であることが確認される (< 10%)。シングル コピー実験、クロマチン コンテンツ交配キャプチャ フェムトモルの範囲である必要する前に少なくとも 10 の⁹セル開始材料として通常必要とします。実物大実験の前に、もっと小さいバッチでキャプチャ オリゴヌクレオチドのパフォーマンスをテストすることをお勧めします。滴定のオリゴヌクレオチドを使用して交配キャプチャは、図 1のとおりです。中濃度が一定、キャプチャ オリゴヌクレオチドの数が増加徐々 に。この実験は、明らかに 3 つの主要な側面を示しています。最初に、それはどのように多くのオリゴヌクレオチドは最適な (と最大) ハイブリダイゼーション効率に達するに必要な特定の地域の決定に役立ちます。第二に、それは特定のオリゴヌクレオチドのセットの任意の明白な有害な相互作用があるか明らかにします。最.......

ディスカッション

ここで説明した HyCCAPP メソッドには、とらえどころのないまま、ある DNA 相互作用を明らかにする強力なアプローチは、多くのユニークな機能があります。プロセスの性質は、HyCCAPP に異なった有機体とゲノムの領域で動作する柔軟性を与えます。メソッドは、しかし、いくつかの制限があると見なす。

HyCCAPP は、適用される初代培養細胞、細胞培養システム、またはも組織サンプルの場合は、任意のセルの変更を回避する方法です。そのため、ただし、それは架橋、プロテオーム解析の感度を低減、したがって大量入力を必要とするサンプルを必要です。CRISPR と周囲の架橋反応^12,13,14,18なしで機能することができます蛋白質のビオチン化に依存するアプローチが浮上しています。プラスミッド挿入制約を表さないが、細胞培養システムでのみ使用で.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PrimerQuestツール	IDT
OligoAnalyzer 3.1	IDT		Analyze、キャプチャ、オリゴヌクレオチド
、PairFold	UBC		相互作用の分析
RPMI 1640培地	、Thermo	Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine	サーモフィッシャー	25030081
ウシ胎児血清	サーモフィッシャー	26140079
カウンテス自動セルカウンター	サーモフィッシャー
850 cm2ローラーボトル	Greiner Bio-one	680058
ローラー システム	ウィートン	22-288-525
37 % ホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	F8775
グリシン	Sigma-Aldrich
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma-Aldrich	P4380
HEPES	サーモフィッシャー	15630080
ブランソン デジタルソニファイア SFX 150	エマーソン
Qubit 3.0蛍光光度計	Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit	Thermo Fisher	Q32850
Bioanalyzer 2100	Agilent
Agilent DNA 1000 kit	Agilent	5067-1504
MES ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	M3885
NaCl 5M	Thermo Fisher	AM9760G
EDTA	Sigma-Aldrich
DynaMag-2 マグネット	サーモフィッシャー	12321D
ダイナマグ-15 マグネット	サーモフィッシャー	12301D
ダイナビーズ M-280 アトレプトアビジン	サーモフィッシャー	60210
低結合チューブ	エッペンドルフ	22431081
ハイブリダイゼーションオーブン	SciGene
チューブシェーカーおよびローテーター	Thermo Fisher	415110Q
DNase I (RNase-free)	New England BioLabs	M0303
SSC buffer 20× concentrate	Sigma-Aldrich	S6639

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