制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Summary

ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング ライブにプロトコルを提案する.この方法は、多細胞系における動的遺伝子発現プログラムの機能的意義をテストするためのユニークなプラットフォームを提供します。

Abstract

セルは、一時的、変化する周囲のセルから様々 な要因によって影響を受けている環境に適切に対応する必要があります。ノッチ シグナル伝達経路は、胚の正常な発達に重要な役割を果たしている細胞間の通信にこのような重要な分子機械のひとつです。この経路を含むウルトラディアン リズムと振動情報のセルに転送が、振動遺伝子における多細胞間相互作用の影響を解明する分子生物学的手法の進歩にもかかわらずチャレンジしておりますダイナミクス。ここでは、光遺伝学的制御と正確な一時的な方法で遺伝子発現パターンのライブ監視を可能にするプロトコルを提案する.このメソッドは正常に、Notch シグナルの細胞内および細胞間の周期的な入力同調固有振動周波数と位相シフト単一セルの解像度であることを明らかにしました。この方法は、多細胞系における動的遺伝子発現プログラムの機能的意義をテストするためのユニークなプラットフォームを提供する、様々 なシグナル伝達経路の動的特徴の解析に適用されます。

Introduction

細胞間通信は、発達過程で胚のパターン形成に重要な役割を果たします。脊椎動物の胚は、体節と呼ばれる体節構造と身体前後軸に沿って分割クロック¹と呼ばれる計時時計の制御の下で一時的な精度で形成されています。このプロセス中に、presomitic 中胚葉 (PSM) セルのグループは、定期的に同期的な方法で体節に変換されます。このプロセスは、同期振動遺伝子発現と位相で振動 PSM 細胞同じ距離。振動遺伝子発現の期間は、約 2、3 時間マウス、ゼブラフィッシュでは約 30 分です。PSM 細胞は同期の^2,3を失う解離場合が、再集計が、彼らを自己組織化でき、回復、人口同調⁴細胞間結合が、同期のためのキーであることを示唆振動。

広範な努力では、デルタ Notch 経路のシグナル伝達分子がセグメンテーション時計遺伝子の同期した振動にしっかりと接続されていることを明らかにしました。薬理学的阻害剤や Notch シグナルの遺伝の突然変異は、発振器の人口を desynchronize します。ゼブラフィッシュ、Notch シグナル コンポーネント、DeltaC、DeltaD、Notch1a などの変異体は、非同期振動^5,6を表示します。ひよこやマウス胚では、ノッチ リガンド デルタ 1 に似た (Dll1) だけでなく、ノッチ変調器狂気フリンジ (Lfng) が同期した振動^7,8,9に必要です。しかし、それされているセルからセルに動的な情報転送のためのような分子の機能をテストすることは困難摂遺伝子調節動態の時空間解像度を調査するための不足のため、2-3 h (ウルトラディアン リズム) の時間スケールのプロセス。

最近、哺乳類細胞¹⁰の遺伝子の発現パターンを制御し、監視する統合的な手法を開発しました。この技術によりウルトラジアン リズムの時間スケールで定期的な照明、遺伝子式パルス誘導します。このプロトコルは、感光性細胞ラインを確立し、細胞間コミュニケーションの文脈で監視ライブ セル発光によるレポーター細胞の動的応答を観察する方法を表します。このメソッドは、他の多くのシグナル伝達経路の解析に適用されます。

Protocol

1. メダカ Tol2 システムによる安定したセルラインの世代

1. トランスポザーゼ (メダカ Tol2) 発現ベクター (pCAGGS mT2TP) とともにメダカ Tol2 ベース光モジュールのプラスミッドのベクトル (図 1 a) を transfect C2C12 細胞に。すべての手順 10% 牛胎児血清 (FBS) と 5% CO₂、そうでなければ示される存在下で 37 ° c (表 1)、ペニシリン ・ ストレプトマイシン DMEM 培と培養細胞で
   1. 細胞カウンターと細胞をトリプシンと/12 ウェル プレートのウェル プレート 5 × 10⁴ C2C12 細胞にトランスフェクション前日をカウントします。
   2. リポフェクション試薬を用いた transfect メダカ Tol2 ベース光遺伝学的ベクトル (pAI177 または pAI218)、薬物選択ベクトル (pAI170) の 0.125 μ g と 0.5 μ g pCAGGS mT2TP ベクトルの 0.375 μ g が共同。
   3. Trypsinize transfected セルやトランスフェクション後 1 日 100 mm 培養皿にそれらを板します。
   4. 100 mg/mL hygromycin 添加培養液中に transfected セルの培養液を交換します。
   5. 非 transfected セルを除去するために 3 日間の培養細胞。中型の変更は必要ないことに注意してください。
2. Trypsinize transfected セルと選択のための蛍光タンパク質を発現する細胞の人口を浄化します。受信機電池 pAI177 を運ぶ、グリーン PE チャネル mCherry 陽性細胞の人口の浄化のために並べ替えのゲートを設定します。送信者感光性細胞 pAI218 を運ぶ、APC チャネル iRFP713 陽性細胞の人口の浄化のために並べ替えのゲートを設定します。
3. (省略可能)限られた希釈または単一細胞の FACS によるソートなどの標準的な方法によって栄養系セル人口を確立します。

2. 人口レベルで設計された細胞の写真感度の評価

注: この部分では、生化学的な試金、qPCR など西部にしみが付くことによって青色光照明に Dll1 ligand 蛋白質の動的誘導を確認するプロトコルについて説明します。

1. 光誘起条件あるいは暗条件のためのインキュベーター光源の有無の 2 種類をそれぞれ設定します。青色 LED トランス-照明、図 1 bに示すように光メーターを使用しての光強度をセットアップします。プログラムのタイミングと、シングル ボード マイクロ コント ローラー照明 (図 1) のプログラム可能なスケジュールを可能に制御スクリプトをロードすることによって光照射の期間。
2. 細胞カウンターと細胞をトリプシンと pAI218 と 35 mm 径プラスチック文化料理 (光条件の以上 12 の料理、暗条件の 1 皿) に pAI170 を運ぶ板 1.0 x 10⁵感光性送信者セルをカウントし、料理闇/光の条件のためのインキュベーターを区切ります。料理の設定後、セル lysates の収集まで閉鎖インキュベーターのドアを保ちます。
3. めっき後, 1 日開始光照射 (電池は 80% 以上に期待されて合流)。望ましくない光刺激を避けるために光に細胞を公開しないでください。
   注: 照明用スケジュールは、実験の目的によって異なります。注意持続的な照明条件 (e.g。 光強度 40 µmol/m²/s で 1 分持続時間と 10 分間隔) は十分な写真誘導とその強い光の簡単なチェックは細胞に有害であります。したがって、照明のための無害なパラメーターが選択されていることを確認します。
4. メッキ後、約 2 日間を 30 分間隔で細胞ライセート準備します。氷に、さらなる分析のためのセル lysates の準備を開始、インキュベーターから料理を移動します。

3. 動的送信者-受信者人口レベルの試金: 光電子増倍管による光刺激に応じて細胞応答のリアルタイム モニタ リング

1. Trypsinize し、標準的な方法で送信者と受信機のセルの数をカウントします。⁵送信者細胞 (比率 1:5) 10⁴受信機と 1.25 x 10 x 2.5 の懸濁液を混合の 1 mL の容量を準備します。
   注意: 2:1、1:1 または 1:2 送信者と受信者間の比も動作 1.5 x 10 の総細胞数⁵。¹⁰
2. 板 1 mM ルシフェリンを含む培養液中で 24 ウェル ブラック プレートの各ウェルに細胞を混合します。
3. ルシフェラーゼ アッセイ用のプレート リーダーの細胞を分析し、出力信号が記録システムのあまり高くはないことを確認します。
   注: 出力信号は 1 x 10⁶光子数/秒より高い場合は、彼らを飽和可能性があります。出力信号が 1 x 10⁶光子数/秒よりも低い場合、最適な値にルシフェリンの濃度を低減します。
4. 記録システムのプレートを設定し、録画プログラム (図 1) を開始します。たとえば、記録を設定した後 18 時間で光照射を開始します。
   注: トレンド除去信号平均化とサビツキー ・ ゴーレイ フィルター、移動などの時間フィルタ リングは、ウェーブ フォームの可視化に役立ちます、ピークが検出されました。

4. 単一細胞レベル動的に送信者と受信者間の試金: リアルタイム光遺伝学的摂動の制御の下で単一細胞応答のイメージング

1. プレート 0.5 x 10⁵受信機と 2.5 倍の 27 mm 径ガラス基 35 mm 直径の皿に 10⁵送信者細胞。その混合の割合と総細胞数 (セル密度) が正しく調整されことを確認します。
2. めっき後の 1 日は記録媒体の 2 mL の培地を交換 (- フェノールレッド フリー DMEM 培 5 %fbs、ペニシリン ・ ストレプトマイシンと 1 mM ルシフェリン)、し、顕微鏡のガラス ベース料理を設定。必要に応じて、PBS (-) で死んだ細胞の残骸を洗い流します。
   注: それは暗い状態でこの手順を実行することが望ましいです。
3. 37 ° C、5% CO₂環境チャンバーを搭載した倒立顕微鏡を設定します。
4. 冷却 CCD カメラを設定します。CCD センサーの温度が送信先の値 (通常は、-90 ° C) まで冷却されることを確認します。
5. 288 以上と 5 分間隔で画像をキャプチャする自動獲得ソフトウェアで「多次元タイムラプス」ウィンドウ パラメーターを設定 (1 つ以上一晩記録) 回。
   1. 「多次元タイムラプス」ウィンドウを開き発光チャンネルと遅い 50 kHz 読み出しモード プルダウン ・ メニューから選択 4 × 4 の 4 分露出でビニング設定。読み出しモードが弱く発光生物発光を検出する読み出しノイズを減らすために不可欠な 50 kHz の低速モードに設定されているを確認します。
   2. 「多次元タイムラプス」ウィンドウを開き蛍光チャンネル、高速の 1 MHz 読み出しモードをプルダウン ・ メニューから選択 2 × 2 の 400 ms 露出とビニングします設定。読み出しモードは、蛍光イメージングに必要な時間を短縮する高速の 1 MHz モードに設定されていることを確認します。
   3. 時間経過「取得」ボタンをクリックして録音を開始します。
6. コマ撮り映画からの発光チャンネルの単一セルのトレースを画像解析ソフトで、次のとおり抽出します。まず、発光と蛍光画像をスタックを画像解析ソフトに画像データをインポートしてください。発光イメージ (「SpikeNoise フィルター」として実装)、前と次のフレームの時間のなかにピクセル値を置き換える、一時的に隣接する画像のピクセルの強度を比較することにより宇宙線由来のホット ピクセルを削除します。これらの加工イメージを空間的に平滑化フィルターに適用し、各フレームから out-field ビューの背景のピクセル値を減算します。その後、「関心領域」を決定 (ROI) 各時点で蛍光画像をセルごとに発光画像に ROI を適用し、各 ROI の発光強度を測定。

Results

我々 は、ライトン システム^11,12, 2-3 h の周期性をもつ遺伝的発振器の研究の哺乳類細胞における光誘起遺伝子発現を可能にする適応。このシステムは 2 つの部分の構成: 写真誘導性の転写活性化因子 hGAVPO および興味の任意の遺伝子の転写をドライブする UA プロモーター カセット。光誘起遺伝子発現の拍動の速度を加速するには、UA プロモーター カセットのポリア シーケンスはマウス Hes1 3' UTR 20 分マウス線維芽細胞で mRNA の半減期を短くと取替えられました。

安定したセルラインを確立、メダカ Tol2 転移システムに基づいて cistronic トライ ベクトルだった使用¹³ (図 1 a)。メダカ...

Discussion

我々 は 2-3 h の周期性と遺伝子発現ダイナミクスを制御する手法を示した。このタイム スケールはテトのシステムと元のライトン システムなどを含む他の従来のものよりもはるかに短い。ウルトラジアン リズムの時間スケールに到達するための重要なパラメーターは、光誘起分子製品、Mrna、タンパク質の半減です。これらの速度論的パラメーターは、セルタイプおよび種によって異なります。速度をチューニングするには、シーケンスおよびターゲット蛋白質の機能は変わりませんのでストレートな方法は、Hes1 3' UTR シーケンスを他の人と交換します。他 3' 望ましい拍動パターンに特に興味のセルを取得する UTRs を求めて、生細胞の誘導灯で dLuc の監視は良い出発点、審査と検証に使用します。

最もよく寄せられる質問の 1 つは光感受性細胞の毎日の処理についてです。Notch シグナルの動的な送信者と受信者間の試金、場合体制 (写真誘導 dLuc Dll1 セルおよび受信機細胞) は、細胞増殖を変更できず、すぐに休憩に戻るできないので部屋のライトの下で細胞の通路を毎日行うことができました暗い状態に細...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACS	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	FACSAriaII SORP
カメラ	Andor	iKon M-934
顕微鏡	オリンパス	IX-81 ZDC
PMT デバイス	中立電機	CL24B-LIC/B
青色LEDイルミネーター	OptoCode	LEDB-SBOXH
DMEM	Nacalai	08459-35
ペニシリン-ストレプトマイシン	Nacalai	26253-84
ウシ胎児血清	Sigma	172012
KRYSTAL24 (黒 24 ウェルプレート)	ハイテク	303012
D-ルシフェリンカリウム塩、	ナカライ	、20028-24
、露出計	LI-COR、バイオサイエンス、	LI-250A
、抗HA-ペルオキシダーゼ抗体	ロシュ	クローン3F10
抗アクチンペルオキシダーゼ抗体	、ワコー	クローン2F3