異なる光質におけるシロイヌナズナ成長挙動の解析

シロイヌナズナは、二十年以上のための分子時代の植物研究者のモデル生物をされています。いくつかの特性を作るこの小さな代表アブラナ科の分子遺伝学のための理想的な候補者: 比較的小さいゲノムを有する唯一の 5 つの染色体 (例えばタバコと比較して、24 の染色体を持つ) とそのゲノムは完全に 2000年¹で配列されました。シロイヌナズナはアグロバクテリウム感染²で簡単に遺伝子組み換えできるも CRISPR/Ca³など最新の遺伝学的ツールを受けやすい。小さいながらも成長のサイクルが材料の高い金額が必要な生化学実験を可能にする十分な速度です。植物は、寒天や土壌を成長し、液体文化⁴として栽培されることも。シロイヌナズナは気候制御の戸棚には、例えば、パーシバルから育てることができる気候室や温室。成長挙動を比較して変異体の表現型を分析することができる再現性のある、同じ時間の柔軟な成長条件⁵を提供するが重要です。演説するべき科学的な問題によって 1 つは同じ温度で異なる光質多様な光強度や光の条件を一定温度の異なる必要があります。光は植物の成長に非常に重要なパラメーターとその影響は多様なアプローチ⁶でよく勉強しました。再現性と得られたデータの比較可能性を確保するため、安定した出力を確保してを同じ種類の光源を適用することが重要です。

温室および気候室で通常の光源は、ナトリウム蒸気や満足のいく植物の成長を促進するが、いくつかの欠点がある蛍光ランプで構成されます。最初に、彼らは強度だけでなく、品質 (自身の観察) でスペクトルの出力を変更する時間をかけて年齢します。しかし、光の質の変化が見過ごされるが、まだ重大な影響がある、強度だけが継続的に監視通常です。両方のタイプのランプが熱を生成する第二に、高い光強度自体は植物の成長の深遠な生理学的影響があるし、可能性があります任意の光依存効果をマスクします。第三に、これらの光源のスペクトルの出力はかなり自然な日光⁷とは異なり、不変です。Led の場合、これらのすべての欠点を克服されている)^8,9,10,11。彼らは長い寿命を持つ排出量のほとんどを変更、非常に高い輝度でも排熱を生成しない、彼らは非常に柔軟な彼らのスペクトル出力に関する。

ここで赤、青、白色光の別の LED ライトを備えた気象室を設定し、時間をかけて植物の成長のさまざまなパラメーターに従ってくださいする方法を示します。我々 は、新鮮重, 葉面積, 気孔密度および光合成能力を測定します。同時に、統計的評価を正しく設定の重要性を示す.

このプロトコルには、シロイヌナズナ植物の成長挙動を分析する方法のいくつかの例が含まれています。

1. 準備

1. 始める前に、どのように多くの植物実験の信頼性の高い統計分析を行うため必要となる、ポットの適切な量を準備しての慎重な計画を作る。
   注: は常にいくつかの種が発芽しない可能性を許可します。
2. 個別にプログラム可能な LED レベルが異なる気象室を使用して、同じ一般的な環境条件 (材料表) の下での植物の成長を比較します。

2. 植物の成長と LED 照明のセットアップ

1. 6 × 7 cm 鉢土の (異なる条件および/または分析する突然変異体) によって適切な数を準備し、それらのそれぞれの単一の種を植えます。
   注: この場合、条件ごとの 36 の植物は撒かれました。
2. 4 ° C で 2 日間 vernalize します。
3. 相対湿度 65%、温度に 22 ° 16 ° C 16 h 1 日/8 h 夜のサイクルを設定します。すべてのレベル 200 μ M/cm²/s¹の強度の光を調整します。気象室の前面のタッチ スクリーンを介してプログラムにそれぞれの値を入力することによってこれを行います。4 つの異なる光質を比較するための表 1 に定める Led を次のパラメーターに設定します。

表 1: Led から放出される光の強度の組成

4. 出力をモニターするスペクトル連続的に、例えば内蔵校正装置を用いた。
5. 異なるレベルの人工気候室で植物を置くし、透明な上覆われてよく発達した子葉が表示されるまでそれらを保ちます。十分に潅水を確認します。
6. モニターとドキュメント植物の目で、できるだけ頻繁にどのように高速植物は、例えば2 日に選択した条件下での成長に応じて、適切な写真。カメラとすべての図のオブジェクト間の等しい距離を確保し、比較が可能に、カメラ用の三脚を使用することを確認します。該当する場合は、スケール バーを使用します。
   注: 用語 DAS (播種後日) 春を含む種子の植栽を指します。

3. PSII 収率の定量

1. パルス変調蛍光を使用します。ライブ ウィンドウの完全なロゼットを見ることができるので、植物から適切な距離でカメラヘッドを設定します。
2. ソフトウェアを起動する時に「ユニットを選択」ウィンドウが表示されます。「ミニ」と次の"ok"をチェックします。次のポップアップ ウィンドウで「青」色を選択します。クリック「[ok]」
   注: パルス変調蛍光測定光が自動的に点灯します。モニターに画像ウィンドウは、フィートの蛍光パラメーターが表示されます。カメラの下に置かれた植物は、オレンジ色のイメージとして今見ることが。
3. イメージを集中させ、植物の特定の領域を選択するには、「ライブ映像」ボックスを刻 々 と過ぎて、生きているビデオに切り替えるし、対物レンズの調整リングを回します。ライブ ビデオ ウィンドウ右上隅の [終了時] ボックスをクリックして終了します。
4. 光合成パラメーターを測定するには、(aoi) の領域を定義します。これは、自動的に画面の中央に表示される円は、既定の設定を使用します。その横にある赤いボックスは、葵、内のすべてのピクセルの平均 Ft 値を表します。葵ボックス右のパネルでは、さまざまな形態がありますから選択することによって適切な葵を定義します。葵タブで「追加」をクリックし、、葉面積円を配置します。葉ごと 5 回を繰り返します。
5. (表 2) の製造元によって提供される既定値の設定 (右側のタブ) を維持します。

表 2: PAM 測定の製造元によって提供される既定の設定です。

6. 蛍光分析 (飽和パルス) を焼入れによって光合成パラメーターの測定を実行する飽和光フラッシュを適用します。その前に、低植物の最小と最大の蛍光収率を測定することにより焼入係数を決定します。このため、数分間 (例えば引き出しや暗箱) 暗闇の中で植物を配置します。Fo、画面の下部に Fm をカメラ ヘッドの下で植物を配置、チェック ボックス メジャーと ML (光の測定)、イメージ サークルに時間を計っている"Fv/Fm"を選択して、下の行のクリックします。
   注: Fo/Fm バクテリオロドプシン植物の PSII 収量を表します。したがって、それは光を適用した後の測定は、正規化された値です。現在の Fo/Fm の測定は、新しいレコードがアクティブ化されるまで残ります。すべての F と Fm' 飽和パルスにより決定される値 Fo/Fm に関連しているし、焼入パラメーターが計算されました。
7. [レポート] タブでこれらの結果を見つけるし、右手側 (e.g実験に関連するすべてのボックスをチェックします。Y(II)、qP、qN、等)。
8. 解析ソフトウェアなどに結果をエクスポートします。Excel の左上隅に [エクスポート] ボタンをクリックして、適切なファイル名で保存します。葉あたり少なくとも 5 AOIs を生成し、同じ植物の葉をいくつかの測定 (忘れずにすぐ暗い各測定後に再度植物の適応)、1 つの条件からいくつかの工場だけでなくを統計学的に評価できます。
9. 統計分析のためには、平均値と標準偏差を生成すべて AOIs から、すべての少なくとも 3 つの独立した植物ポイント/条件の時間しデータが重要な¹²の場合を評価するスチューデントの t 検定を実行します。データは、p 値が 0.05 以下と大幅に異なるとして評価されます。

4. 気孔密度の測定

1. 収集 3 完全に展開したロゼットの葉条件ごとの 3 つの個々 の植物から 70% エタノール ガラス シャーレと葉緑素を抽出するために。この溶剤は、部屋の温度や 4 ° C で店で一晩で孵化させなさい
2. 顔料から完全なクリアランス、抱水クロラール溶液間孵化させなさい (抱水クロラール: 水: グリセリン = 8: 2:1/v/w) の葉は完全に白くなるまで。
3. 40 倍の倍率で微分干渉顕微鏡 (DIC) 切断面の画像を取る。ビジョンのフィールドに気孔をカウント、² あたり気孔にスケール バーの助けを借りて推定します。条件あたり葉の少なくとも 4 にこの手順を繰り返します。1 つの条件のすべての葉の平均値を計算することによって統計分析を実行し、これから平均誤差を計算します。

5. 新鮮重の定量

1. かみそりの刃で条件ごとに六つの植物からのロゼットから葉柄を含むすべての葉を削除します。すぐにすべての葉の重量を量るし、前述の統計分析対象データ。

6. ロゼット葉面積の測定

1. 葉面積を視覚的に分析するのに条件ごとに 8 つの植物からの写真を使用します。単一のイメージでの 1 つの条件に画像を組み合わせるし、*.jpeg として保存または * .tiff。
2. 適切なソフトウェア (材料表) をダウンロードします。
   メモ: それは、もちろん、このタスクを実行することができる他のプログラムに適用することが可能です。
3. 画像ファイルを開きます。「自由選択」ツールを選択1 つのロゼット状の葉柄を含む葉を取り囲みます。「分析・測定」をクリック、「エリア」、「最小・最大のグレー値」をチェック「集積密度」と「平均グレー値」適切な 10 進数の場所、ベストは 2 つまたは 3 つを選択し、クリックして"ok"。
4. Mm を取得²ピクセルではなくは、「スケールを設定」コマンドを使用します。画像のスケール バーから計算し、縮尺の設定ダイアログを開き、この距離を定義と単位を入力しやすいまま直径など既知の距離に対応する行を選択しする直線選択ツールを適用します。測定。「分析」と「測定」をクリックしてに戻ります
5. 新しいウィンドウには、現在のロゼットに関連データが含まれている権利の「結果」が表示されます。この手順は、イメージのすべての植物とし、ctrl キーを押しながら M とすべての新しい植物の面積を初期化します。
   注: 非重複の葉より小さい植物のため「自動選択ツール」は簡単かつ迅速に行うため使用できます。葉は、お互いをカバーを開始、すぐに、このツールは信頼できる結果を与えない。
6. また、すべての葉を切断し、概要図を取ることができる杖ツールを使用して、方法でそれらを配置します。このメソッドを使用するより多くの植物が必要とする考慮に入れます。
7. -「ファイル」を選択「として保存」[結果] ウィンドウとコンピューターのディレクトリに適切なファイル名と場所を生成します。ファイルは Excel 形式で自動的に保存されます。

7. RNA の準備

1. すべての条件のための 10 の個々 の植物からの 3 つのサンプルを収穫します。植物の製造元の指示に従って RNA 抽出キットを使用して総 RNA を抽出します。バイオアナライザーを用いた RNA 濃度、純度、および整合性を確認します。RNA は、例えばRNASeq¹³で qRT PCR や遺伝子発現解析などの下流のアプリケーションに使用できます。

植物の成長、特に表現型変異植物からの観測と解析は、安定性と再現性のある環境条件に依存します。これらは、気候室で提供できます。光の量、特に品質は批判的に、本研究では LED ライトによって提供された採用光のソースによって異なります。

LED パネルを装備した気候チャンバーの例を図 1に示します。図 1 aは、すべての気候や光条件を調整ことができますコントロール パネルのスクリーン ショットを示しています。24 h 以内 20 別のタイム フレームを設定できます。この例では、16 の光/8 h 暗い長い一日条件がプログラムされています。この部屋では、全く同じ環境条件の下で 4 つの異なる光の設定で植物の成長を学ぶことができるように、個別にプログラムできる 4 つのレベルを備えています。レベルの左上が技術的に可能な限り多くの日光を模倣したスペクトル出力に設定されて、高架の上の正しいレベルを表す赤 (660 nm) と青色光 (440 nm) 白色光 (3 K) を抑えた。左下のレベルは、高架の青い光と低適切なレベル主に赤い光に設定されました。図 1 bは、概要 (中間パネル) とそれぞれズーム アドイン (外側の小さなパネル) として別の設定で Led を示しています。光質の違いが容易に目で見ることができます。

作り付けの分光計は常に測定、モニター、スペクトル出力を調整します。図 2は、太陽の光を模倣するように設定された上部左レベル 1.1 からのスペクトルを示しています。標準的な蛍光電球と比較して紫外線と青色光の部分は、多くの高い7です。

図 3 aの例の植物すべての 4 つの条件 10、13、17 日からそれぞれ後播種が描かれています。すべての植物は三脚にカメラをマウントすることによって同じ距離から撮影しました。スケール バーは、1 cm を表します。10 日後サイズまたは色のあまりの違いが分かるでしょうが、17 日後赤い光の下での速い成長は明らかです。この視覚的な分析に加えていくつかの生理学的解析を行った。

図 4は、例えば光合成能力を分析するを PAM 測定の別の手順に従います。図 4 aの測定値の最適な品質を確保するライブ ビデオのスクリーン ショットが表示フォーカスに植物をもたらすための設定であります。植物全体に着目し、代わりに分析する単一の葉を選択することも 1 つ。図 4 bは、実測が開始される前に現在蛍光収量低植物のフィートを示します。この場合、金利 (AOIs) の 5 つの円形領域が選ばれました。各葵の横にある赤いボックスの番号は直接テーブルの形で保存することも、数値の結果を与えます。光合成パラメーター Fo の測定を開始すると、Fm を設定する必要があります。これを行う後フィートのスクリーン ショットは、図 4で描かれています。"Fo、Fm"ボタンがもうアクティブでないことを確認します。新しい測定を開始するには、「新しいレコード」は以前の正規化を消去するときにクリックしてする必要があります。最後に、図 4は、飽和パルス光 (「土パルス」) を与えた後効果的な PSII 量子収率 Y(II) を示しています。模範的なデータの定量化を図 5に示します。200 μ M/cm2/s1 (図 5 a) で日光の下で育つ植物は、播種後 12、21、28 日をそれぞれ分析しました。我々 のデータは、PSII 収量は 12 日より 3 週間の栽培植物からの葉で有意に高値を示します。28 と 12 日間差がまだかなりが、p 値は高い。図 4 b、異なる光質から 2 週間栽培植物から PSII 収量を比較しました。興味深いことに、青い光の高い部分を含む光の下で永続的な成長は、PSII の大きく収量に します。同様の効果は、豊かな赤い光の下で栽培される植物の観察されたが、増加はやや低めだった。

異なる光質効果気孔開発14に示されていた。したがって、気孔の密度を調べた。図 6色素抽出後の葉がどのように見えるかを示しています。単一の表皮細胞がよく識別することができ、ストーマを簡単に数えることができます。図では、個々 の気孔は、アスタリスクで示されます。別のライトの設定からの植物の気孔密度に関する詳細なデータは9他の場所で見つけることができます。

目視検査 (図 3) に加えて、新鮮な重量は、成長の良い測定を提供します。この例では, 播種後 8、10、12 日後「日光」の下で育つ植物から葉を秤量しました。 されました図 7に、これらのデータの統計的評価を見ることができます。予想通り、新鮮な重量は時間とともに増加します。

新鮮な重量のほかに葉面積は成長の良い対策です。ここでは、植物の成長は、(図 8 a) を播種後 10、13、17 日から続いた。信頼できる統計データを取得する、少なくとも六つの個々 の植物を日常的に行った。高いサンプル サイズの重要性を示すためには、それぞれ 2 つと六つの植物の分析から、平均値のエラー率を求めた (図 8 b)。つまり、平均値に関して標準偏差の割合を求めた。小さなサンプル サイズの場合、エラーは 5-10% の高いサンプル サイズの場合よりも高い非常に明確です。評価される植物の数を増やすことによって、エラーを最小化できるより明確のデータの解釈になります。

図 1: 異なる光質が Led によって提供されます。A) LED 室内のコントロール パネルからのスクリーン ショット。16 h (右上隅) に日の長さを設定、光強度が 200 µmol cm-2の-1に設定されます。光の質はすべての 4 つのレベル別: 1.1 として技術的に可能な限りの太陽光に似たようなスペクトルを表します、1.2 を表す赤と青波長 (RB) 光の割合が高い、2.1 は主にセットする青 (B)、2.2 表す主に赤光 (R)。B)中央のパネルは、すべてのレベルの概要を示しています。外側のパネルより高いズームで個々 のレベルを表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 擬似太陽光設定から波長スペクトル。LED 室内の作り付けの分析計からのスクリーン ショットが表示されます、レベル 1.1 で置かれました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 植物の一週間以上発生します。10、13、17 の DAS からすべての 4 つの光条件から代表シロイヌナズナの植物します。植物は、三脚にデジタル一眼レフ カメラで撮影されました。スケール バーは、すべてのイメージの 1 cm を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: スクリーン ショットシロイヌナズナ植物の PAM 測定の代表的な手順を実行からします。A)イメージのフォーカスを調整することができます「ライブ映像」ビューからのスクリーン ショット。B)任意の光パルスのアプリケーションの前に現在の蛍光収率フィート。C) Fo/施設の設定後の現在の蛍光収率 Ft D)飽和パルス光を設定した後差押 PSII 量子収率。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 影響を及ぼす PSII 量子収率 (YII) のグラフィカルな表現です。A)データから植物の播種後 12、21、28 日、栽培下で 200 µmol/cm2/s1模擬太陽光の下で (「日光」) PAM 分析にさらされた統計的な評価。5 つの工場と 1 日あたり 5 AOIs の平均値は、示されています。1 つのアスタリスクを示す p 値と有意差 < 0.05 日 12、および 2 つのアスタリスクを示す p 値と非常に大きな違いと比較されたとき < 学生の t テストによると 0.02。B)ブルー 200 µmol/cm2 /s1模擬日光 (SL) の下で豊かに育つ植物 (B) または赤 (R) からのデータ光、それぞれ、統計学的に評価しました。5 つの工場と 1 日あたり 5 AOIs の平均値は、示されています。「日光」と比較して有意差を求めた

図 6:シロイヌナズナの葉の背軸側に気孔の代表的なイメージです。葉は上記のように準備、40 倍の倍率で DIC の設定で光学顕微鏡の下で視覚的に分析しました。気孔は、1 つの条件の少なくとも 4 葉の可視領域にカウントされます。顕微鏡 tubus に接続されたデジタル カメラで撮影されました。スケール バーの助けを借りて ² あたり気孔の数が計算されます。星を単一ストーマを示します。スケール バーを表します 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 7:シロイヌナズナの栽培で新鮮な重量のグラフィカルな表現をシミュレート日光/200 µmol/cm2/s1.ロゼット葉は播種後 10、そして 12 日 8、植物からカットされました。Mg の 1 日あたりの六つの植物からの平均値で表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 8:シロイヌナズナ葉面積異なる光条件下で栽培した植物からの統計的評価します。A)シロイヌナズナ 10、13、17 日の成長から葉面積は ImageJ とnからデータをグラフィカルに決定された 6 = 植物が統計学的に評価しました。各条件からすべての六つのロゼットから葉面積は総括され、平均値を取得する 6 で割った値します。この値は、標準偏差を求めたと誤差の範囲で表されます。B)葉面積は ImageJ といずれかのnからデータをグラフィカルに決定された 2 またはn = 6 の植物をそれぞれ = パネル A のとおり統計的に分析しました。平均値の % でエラーが計算し、グラフィカルに描かれているか。緑のバーにnの分析からパーセント エラー表示 = 6、 nからバーを青 = 2 つの植物。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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