クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

Summary

多糖類のカプセルはクリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの主な病原性因子とそのサイズが株の病原性と相関します。カプセル径測定は、表現型のテストと治療効果を測定するために使用されます。カプセル誘導の標準的な方法の紹介、染色し、直径を測定の 2 つの方法が比較されます。

Abstract

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの多糖類のカプセルが主な病原性因子と最もよくこの病原性酵母の側面を検討しました。カプセル サイズ系統によって大きく異なります、ストレスや低栄養状態に導入されたとき、急速に成長する能力を持って、積極的に株の病原性と相関しています。これらの理由から、カプセルのサイズは、クリプトコッカスの研究者の関心です。クリプトコッカスカプセルの成長が表現型のテスト中に系統の酵母やサイズ違いのさまざまな治療法の効果を理解するために誘導されます。ここで述べるカプセル誘導と比較 2 つの受け入れられた方法の染色とカプセルの直径を測定の標準的な方法の 1 つ: (i) インドのインクと、従来の光学顕微鏡と組み合わせて・ (ii) 共同で染色、ネガティブ染色細胞壁と共焦点顕微鏡によるカプセルの両方の蛍光染料。最後に、どのようにインドのインク染色サンプルからカプセルの直径の測定をすることができますを示す計算イメージ分析を使用して自動化します。

Introduction

毎年 25万人に影響を与えると年間 180,000 以上の死の結果、クリプトコッカスは、細胞内病原性酵母やクリプトコッカス症^1,2,の病原³。 直撃鋭く病気^4,5,6に受けやすく抗レトロ ウイルス療法に準備ができてアクセスを持っていない貧しい国の HIV 陽性患者であります。CDC からのデータは、サハラ以南のアフリカで、クリプトコッカスを殺すこと結核より多くの人々 毎年、レコード¹に任意のエボラ出血熱流行より以上の毎月を示します。露出の最も一般的なルートは、⁷環境で一般的とされている乾燥の胞子を吸い込むから発生します。肺に入ると、クリプトコッカスの感染した個人内の成功に寄与するいくつかの病原因子があります。多糖類のカプセルは、acapsular 系統ではない病原性⁸と微生物の主な病原性因子と見なされます。

クリプトコッカスのカプセルは、3 つの主要なコンポーネントの成っている: glucuronoxylomannan (GXM)、galactoxylomannan (GalXM) とマンノタンパク質の利用 (MPs)⁹。MPs はカプセルの比較的マイナーな細胞壁関連コンポーネント、それらは免疫原性、ほとんどプロ炎症性応答^9,10を促進することができます。対照的に、GXM と GalXM カプセルの大部分を構成する (> 重量 90%)¹¹免疫抑制作用を持っていると。その免疫調節効果に加えて体内のカプセルの急速な拡大はホスト貪食細胞 (すなわち、好中球、マクロファージ)¹²で摂取する機械的な障壁を作成します。クリプトコッカスカプセルとその合成は、複雑ですが、全体的に、高められたカプセル直径増加病原性^6,13,14と相関しています。これを考えると、迅速かつ正確に定量化カプセル測定できなければクリプトコッカス研究者にとって重要です。

クリプトコッカスセルとその多糖類カプセル動的構造し、時間¹⁵間の変更を表示します。カプセルは、密度、サイズ、およびホスト環境^16,17,18の変化に対応したアセンブリに変更できます。低鉄または栄養レベル、血清、人間の生理学的 pH および増加の CO₂の露出は、カプセルの成長^16,18,19,20を開始する知られています。さらに、研究者は、^21,22クリプトコッカスにそのホスト上の優位性を融資感染中陽性で有意差で生じる構造変化を示しています。これは、クリプトコッカスカプセルのアーキテクチャは、さまざまな方法で分析されているために知られています。電子顕微鏡は、たとえば、外部より透過性層²³下内側の電子密度の高い層を持つ異種行列をカプセルには明らかにしました。光散乱と光ピンセットの使用は、その高分子プロパティ²⁴をさらに解明する研究者を許可しています。我々 は、多糖類のカプセルは、複雑な分岐構造²³知っている両方の静的および動的光散乱測定から結果を分析した。光ピンセットは、構造体の剛性をテストだけでなく、その抗体の反応性の²⁴の評価に使用されています。ただし、クリプトコッカスカプセルのこれまでで最もよく使われる分析のサイズの測定であります。

カプセル サイズを定量化する研究者は、単純な測定をする必要がありますどのようなを使用: カプセルの線径。デジタル マイクロ スコープは、インドのインクまたは蛍光染料で染色複数のクリプトコッカスセル (通常数百) の画像をキャプチャする使用されます。それぞれの細胞体と周囲のカプセルのサイズが測定されます。データがコンパイルされ、カプセルの平均粒径は、セル全体の直径 (セル本体 + カプセル) から細胞体直径を差し引いて計算されます。この時点まで、これらの測定は手動で行われています。一般的に正確にしながら、研究者の欠点があるこの方法。数日かかるまたは手で分析する数週間を大きなデータ セット。主観とヒューマン エラーが結果に影響を与えるこれらの測定は手動で行われるため。

自動計算画像解析生体画像^25,26,27のより速くより信頼性の高い分析を有効にする分子細胞生物学の多くの分野の研究者の必要不可欠なツールとなっています。精密な画像解析手法は、私のものは、複雑で膨大なデータ セットから定量的情報に必要です。しかし、いくつかの測定、特にクリプトコッカスカプセルの測定は、自動化が困難されています。正確に細胞壁とカプセルは、一般的に暗いリングの時に位相差顕微鏡を用いたイメージングとして表示されます、インターフェイスを識別することができますシンプルなしきい値を使用して解決するは面倒。さらに、クリプトコッカス培養細胞は一緒に群生する傾向があるし、細胞の正確な分割が正確な測定に必要です。

このプロジェクトの目的は、(i) カプセル誘導クリプトコッカス、 (ii) 比較とコントラスト墨標準プロトコルの 1 つを説明するためにだったし、蛍光染色直径計測をカプセルに関連する (iii) シンプルでインドのインク、画像解析ソフトウェア、(iv) を使用してセルをステンド グラスのイメージを使用してカプセルの直径を測定するための計算方法は、利点と手動でカプセルの直径を計測の自動化ソフトウェアを使用して制限を評価します。2 つの染色法、蛍光細胞壁とカプセルの標識のそれを見つけるより時間がかかる中、実験間の最も一貫した結果を提供します。ただし、両方のメソッドは、正常に区別するために私たちを有効に研究室と臨床クリプトコッカスの系統別展示カプセル サイズ。さらに、インドのインク染色画像からカプセルの直径の測定を自動化し、これはカプセルの手動計測を実行可能な代替であることがわかったことができました。

Protocol

注: は、クリプトコッカスがバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 病原体とそれを扱う研究者は適切な予防措置を取る必要があります。手続きの詳細な方法に安全に BSL 2 病原体で仕事見つけることができますセンター疾病管理 (CDC) のウェブサイトでは、それは処理のクリプトコッカスと接触しているすべての人はきちんと訓練されることに注意してくださいすることが重要病原体、適切な個人用保護具 (PPE) は、一般的にラテックスやニトリル手袋を常に着用する必要があります。さらに、遠心分離機のロータは、サンプルとすぐに 10% の漂白剤の解決策²⁸を使用してクリーンアップこぼれのエアロゾル化を防ぐために密封する必要があります。

1. カプセル誘導

注: すべての手順は特に断らない限り、室温で実行必要があります。

1. 酵母ペプトン ブドウ糖 (YPD) 液 (pH 6.5 ± 0.2) におけるクリプトコッカスを文化し、ログ段階 (約 18-36 時間) になるまでの揺れで 37 ° C で孵化させなさい。
2. 870 x g 21 ° C で 5 分間で細胞を遠心し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) にて 3 回洗浄します。
3. セルをカウントし、ダルベッコ最小限不可欠なメディア (DMEM) 2 x 10⁵セル/2 mL で再懸濁します診断 (または自動化された細胞カウンター) を使用します。
4. カプセルを誘導して、18 h の CO₂を 37 ° C、5% で孵化させなさい。
   注: メディアの栄養素の欠如と CO₂の存在の組み合わせは、クリプトコッカスカプセルの成長を刺激します。
5. 後の培養 (上記参照) 遠心、上清のすべてが 5-10 μ L を削除してセルを収穫します。同時に測定される各緊張に対応する非誘導細胞サンプルを収穫します。これらネガティブ コントロールとして使用します。
   注: 細胞ペレットが非常に小さくなるし、見づらい場合があります。上清を吸引するときは注意してください。
6. インドのインク (セクション 2.1) または蛍光染料 (セクション 2.2) を汚します。

2. 染色

1. インドのインクのみ染色
   1. インドのインクと酵母を染色する残りの上清でペレットを再懸濁し、4μL を追加 (約半分) の細胞懸濁液およびインドのインクをガラス顕微鏡スライドの 4μL。ゆっくり混ぜるし、泡を避けるため。
   2. 13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) 端を密封します。
2. 蛍光染料のみで染色
   1. 蛍光色素と酵母を染色するには、1% ウシ血清アルブミン (BSA) で 50 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
   2. カルコフ ホワイト (CFW) の等量と文化を孵化させなさい (1 μ g/mL) カプセル モノクローナル抗体 18B7 は AlexaFluor488 に共役 (材料の表を参照)、(AF488) (10 μ G/ml) 37 ° C で 30 分間
   3. 870 x g後の培養を 21 ° C で 5 分間で細胞を遠心し、上清を吸引します。
   4. 1% ウシ血清アルブミン (BSA) を 10 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
   5. ガラス顕微鏡スライド上に細胞を懸濁液 8 μ L をピペットします。
   6. 13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) 端を密封します。
3. インドのインクと蛍光染料染色
   1. 直接インドのインク蛍光染料の染色の有効性を比較するため汚れの両方の種類で同じセル人口を共同染色します。これを行うには、まず蛍光カプセルと 2.2.1 - 2.2.3 の手順に従って、細胞壁の汚れの両方で細胞を孵化させなさい。
   2. 次に、蛍光染色細胞懸濁液およびインドのインクをガラス スライドの平等なボリューム (4 μ L) のピペットします。優しく混ぜます。
   3. 13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) エッジをシールします。

3. 画像集録/顕微鏡

1. インドのインクで染まってイメージ投射セル。
   1. 標準的な光学顕微鏡 (100 倍) を使用してイメージを取得します。
   2. 条件ごとの 50 のセルの最小値をイメージします。
      注: フィールドあたりのセル数は異なります、これは許容されます。重要です、しかし、その重複細胞 (手動で、および自動化されたソフトウェア両方) を測定する困難なので最低限、保持します。これらの実験の画像は露出時間のセルの小さな動きによって引き起こされるぼかしを最小限に抑えながら画像のコントラストを最大にする最適化と 16 ビットの深さでに買収されました。
2. 蛍光色素で染色細胞イメージング
   1. 蛍光顕微鏡による細胞をイメージする顕微鏡イメージング ソフトウェアを開き、使用 fluorophores の適切な励起と発光波長を選択 (CFW と AF488 興奮しているそれぞれ、405 nm と 488 nm ライトを使用して)。蛍光顕微鏡を用いて画像を取得します。
   2. 条件ごとの 50 のセルの最小値をイメージします。
      注: フィールドあたりのセル数は異なります、これは許容されます。重要です、しかし、その重複細胞 (手動で、および自動化されたソフトウェア両方) を測定する困難なので最小に保たれます。
   3. 特定のフィールド内の各セルの最大のカプセル径が得られることを確認するために細胞の z スタックのイメージのシリーズを取得します。
      1. 顕微鏡制御ソフトウエア"z"コントロール パネルを開き、パネルの左上隅で「姓」オプションを選択する"z"バーをクリックします。
      2. 単一酵母細胞とビューの現在のフィールド内のすべてのカプセルの最も広いポイントの下は、「最初に設定」をクリックしてレベルで集中する顕微鏡の罰金フォーカス コントロールを使用します。
      3. 現在の表示領域内のセルのすべてのカプセルの同じ細胞の細胞体の最も広いポイントの上の集中する微小焦点コントロールを使用し、「過去の設定」をクリックします。
      4. 「実験を開始」をクリック現在位置の z スタックを取得するを取得する」タブ。複数の位置でプロセスを繰り返して 50 セルの最小の z スタック画像が取得されています。
         注: これらの実験では、1.0 に設定された共焦点ピンホール AU と 10-20 スライス各 0.7 μ M をカバーの重複する z シリーズは、選択された位置に買収されました。AU = 風通しの良いユニット。
   4. 次に、それぞれの z シリーズを最大強度投影法 (MIP) 適切なイメージ解析ソフトウェアを使用してに変換します。
      注: MIPs プロジェクト積み上げ画像²⁹のすべての面で最大の強度です。MIPs の作成セルの最大とキャプチャされた 3-D スタック内でカプセルの直径に対応するイメージの 2 D 表現を生成することができます。
3. インドのインクと蛍光染色細胞イメージング
   1. 広視野 (40 倍) または共焦点の顕微鏡を使用して画像を取得 (63 倍または 100 倍)。インドのインクと蛍光染色細胞のコンピューター制御ステージと油浸対物レンズを搭載した広視野顕微鏡を使用してイメージをキャプチャします。
      注記: 使用の顕微鏡は、イメージング ソフトウェアの CFW を使用して制御する必要があります。340-380 nm の励起フィルターを介して励起と光を放って蛍光 400 nm ダイクロイック ミラーから反映 435-485 nm バリア フィルターを介して検出されます。AF488 蛍光を 465 495 nm の励起フィルターを励起できることし、505 nm のダイクロイック ミラーで反射バリア フィルターの 515-555 nm から放出される光を検出できます。
   2. イメージごとの染色法の条件ごとの 50 のセルの最小値。

4 カプセルの手動測定

1. インドのインクまたは蛍光汚れに染まったセル、カプセルとセル径を手動で測定するセル測定ソフトウェアを使用 (材料の表を参照してください)。これを行うには、"File"へ行く >「画像を開く」>「測定」とカーソルの使用全体のセル (径) の最も広いポイントを通る直線を描画します。
2. 次に、「測定」をもう一度クリックし、細胞体 (細胞体径) を通る直線を描画します。
   注: 測定、セルに自動的に保存されます。
3. (最低 50/グループ) のすべてのセルについてこのプロセスを繰り返します。
4. 彼らを測定したら、画像を保存するクリックして「ファイル」>「名前を付けて保存」、画像を適切な名前します。
5. 新しく測定ファイルを選択し、表計算ソフトへデータをエクスポートします。
6. 式を使用してカプセルの直径の平均を計算する: ([合計直径] - [細胞体直径])。

5 カプセルの自動測定

注: 自動測定に成功のコントラストの高い 16 ビット画像を使用し、するは正しく適切なイメージ解析ソフトウェアと一緒に焦点を当てた (材料の表を参照してください)。クリプトコッカスは、カプセル測定用イメージング、細胞壁とカプセルの間の境界で暗いリングに焦点を当てることが重要です。これによりセルとカプセルを正しく記述するソフトウェアです。

1. 反転し、染色細胞像が適切なイメージ編集ソフトウェアを使用してすべてのインドのインクのコピーを作成 (材料の表を参照してください)。これを行うには、「ファイル」をクリックして > 墨染色画像を開き、「コントロール」では、「オープン」+"I"イメージを反転しますします。クリックして「ファイル」>「名前を付けて保存」反転イメージを保存します。
2. オリジナルと逆の両方をインポートするソフトウェアに画像クリックして「ファイル」>「インポート シーケンス」>「読み込み画像」>「を定義するシーケンス (手動)」>「寸法 (チャネル)」>「インポート」>「適用」。
   注:クリプトコッカス細胞体とカプセル識別でき、ソフトウェアに含まれている - 'レシピ' と呼ばれる - 特定のアルゴリズムを使用してマスクします。
3. 倒立像に ' 植民地アナライザー (蛍光)' のレシピを使用して検出し、細胞体をマスクし、「適用」をクリックします。反転イメージクリプトコッカスセルの境界を定義する暗いリングは周囲のカプセルよりも明るくなります。
4. 彼らのカプセルからクリプトコッカス細胞体のセグメントをクリックして「適用」を反転した画像を ' 植民地アナライザー (蛍光)' レシピを使用します。これは、カウントのマスクを作成します。このカウント マスク「体細胞」の名前を変更するには、"カウント マスク"というラベルの付いたタブを右クリックして。
   メモ: レシピは、複数の画像処理手順ので構成されます: 背景除去、オブジェクトの検出、オブジェクトの分離とサブセット フィルタ リングします。
5. 次に、元の画像の '細胞増殖' レシピを使用して検出し、カプセルをマスクし、「適用」をクリックします。これは、カウントのマスクを作成します。このカウント マスク「カプセル」の名前を変更するには、「カウント マスク」というラベルの付いたタブを右クリックします。
6. 互いに隣接するカプセルを分割する元のイメージの上に新しいマスクを作成レシピ、' カプセル パーティション ' を使用しています。これを行うには、レシピのドロップ ダウン メニューから「パーティションのカプセル」をクリックします。カプセル パーティション ボックスでカプセル領域の今名前を変更したカウント マスク「カプセル」(5.5) を選択します。暗号のセル (5.4) 今名前を変更したカウント マスク「体細胞」を選択します。「オリジナル」を選択入力チャネル、および"パーティションに分割されたカプセルの作成マスク。"適用をクリックします。
   注: セルと検出マスクからセル ・ カプセル、エリア測定の中心を通る最長と最短の軸の平均値として定義されているカプセルの直径にレシピが生成されます。このソフトウェアのスプレッドシート タブの下にある出力を見つけます。すべての画像 (最低 50 セル/グループ) には、このプロセスを繰り返します。レシピのパラメーターは、個々 の画像の検出を最適化するためにチューニングまたは複数画像のバッチ検出用に最適化できませんでした。セルとカプセルの形態の包括的な評価のためのレシピでは、追加の計測を計算できます。
7. さらに分析に最適な表計算ソフトへデータをエクスポートします。

Results

3 系統を用いてカプセル誘導、細胞染色、イメージング、および計測技術を示すためには、クリプトコッカス:共通、よ特徴付けられた実験室株、H99S³⁰、および 2 つの臨床分離株の以前不明なカプセルの直径、B18 と B52³¹。

カプセル誘導、染色、およびインドのインクを使用して画像集録のワークフローは、図 1 aに表示されます。前と後の誘導、図 1 bのすべての 3 つの系統から撮影した画像が表示されます。研究者は、カプセルの誘導はしていない同じ文化からのそれらにカプセルの誘導を受けている細胞を比較することによって成功をだったかどうか知っています。明確なサイズの増加いくつかの系統は誘導後も当然のことながら小さなカプセルを展...

Discussion

何十年も、カプセルは mycologists および臨床医クリプトコッカスとクリプトコッカス症病原体の主要な病原因子としての役割のために興味があるための研究の主要な焦点をされています。カプセル サイズの系統間の違いを測定する顕微鏡を用いたと異なる成長の下で条件は、病原体と様々 な刺激 (すなわち、異なった環境条件に対する応答に関する重要な情報を提供できます。潜在的な薬物治療など) ここでは、クリプトコッカスカプセルの成長を誘導する方法を概説したし、比較された 2 つの異なるカプセル プロトコルを汚す。最後に、画像解析ソフトを使用して画像から手動測定法に匹敵する結果を生産細胞を染色墨のカプセルの直径の測定を自動化する方法を紹介しました。

実験では、2 つの臨床株、B18、B52、H99S、知られているカプセル サイズ¹⁸の標準ラボひずみとを比較しました。両方の染色 3 菌株の最大のカプセルの直径があった臨床ひずみ、B52、ことがわかった。ただし、蛍光測定から結果墨測...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsule Induction<
em>C. neoformans cells			臨床検査株H99Sは、ジョン・パーフェクト博士(デューク大学)からのご厚意により贈られました。 臨床株B18とB52は、ペンシルニア大学のグレッグ・ビッソン博士からのご厚意による贈り物です。
酵母ペプトンデキストロースブロス(YPD)	フィッシャーサイエンティフィック	DF0428-17-5
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)			これは、標準的なレシピ(137mM NaCl、2.7 mM KCl、10mM Na2HPO4O、2 mM Kh2PO4O)
DMEM /高グルコースとL-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムなし	GEライフサイエンス	SH30022.01
6ウェルプレート	ファルコン	CL5335-5EA
振盪インキュベーター	Thermo Scientific		MaxQ6000
CO2インキュベーター	フィッシャー・サイエンティフィ		・アイソテンプ
遠心分離機	サーモ・サイエンティフィック		・レジェンド XTR
<ストロング>ステイン
マイクロ遠心機	サーモ・サイエンティフィック		・レジェンド・マイクロ 21R
インド・インク	フィッシャー・サイエンティフィック	14-910-56
Calcofluor white	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
18B7 マウス抗 GXM 抗体 Alexafluor 488			トゥーロ・カサデヴァル博士 (ジョンズ・ホプキンス大学)からの親切な贈り物
1%ウシ血清アルブミン(BSA			PBSPBSは、上記(4行目)と同じレシピで、1%BSAを添加し、フィルター滅菌したものです。
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A9418
スーパーフロスト顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-143
ガラスカバースリップ	コーニング	2855-18	#1.5 厚さ
透明なマニキュアまたはその他の無毒のシーラント
画像取得
イマージョンオイル	カージル	16484
液浸油対物レンズ付き光学顕微鏡	Zeiss		Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x 油浸NA 1.30 対物レンズ
光学顕微鏡カメラ	Zeiss		Zeiss Axiocam ErCD カメラ
油浸対物レンズ付き共焦点顕微鏡	Zeiss		LSM 700 レーザー走査型共焦点nbsp;
共焦点顕微鏡ソフトウェア	Zen 2009
共焦点顕微鏡カメラ	Nikon		Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 油浸対物レンズ (Nikon) and 1.5x magnification changer.
広視野イメージングソフト	Nikon Elements(ニコン)
カプセル測定
画像編集ソフト	Photoshop(Adobe)
手動測定用顕微鏡ソフト	Axiovision(カールツァイス)
自動測定用画像解析ソフト	Aivia(DRVisionテクノロジー)
表計算ソフト	Excel(マイクロソフト)