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共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

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DOI：

10.3791/57177

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2018年3月20日

1Department of Biochemistry, Charles University

この記事について

サマリー

環境化学物質、酵素中間体の共有結合 DNA の生成に bioactivated が付加体に薬剤の効力を評価するがんとその治療法の開発に重要な分野です。DNA 付加体、その検出と定量の技術だけでなく、フォームに化合物の活性化のための方法を説明します。

要約

共有結合 DNA 付加体の化学物質によって形成される発がん性の薬は発がんプロセスの初期段階で最も重要な要因の一つと判断されたか。癌の原因を考えると、この結合は、今化学発がんのセントラル ドグマとして評価されます。ここでは、チトクローム P450 によって触媒反応を用いた方法を説明し、付加体の化学物質や代謝産物がこれらの DNA を形成するの活性化のための薬の効力を調査するその他の微生物による分解酵素。体内酵素シトクロム P450 に他体内の酵素、すなわちペルオキシダーゼ、NADPH: チトクローム P450 (ミクロゾーム及びサンプルを有する細胞画分の分離を記述する手順を紹介してNAD (P) h: キノン酸化還元酵素、またはキサンチン酸化酵素酸化還元酵素)。メソッドの説明また、分析化学物質の代謝活性化のための DNA の隔離のためのそれらと同様、これらの酵素によって使用できます。さらに、検出および化学/医薬品由来 DNA の定量化できる適切な方法は、すなわち、 32p-ポストラベル法のさまざまな変更を内転、放射性ラベルの雇用の化学物質を分析、詳細に表示されます。

概要

(環境化学物質や薬物) は化学物質の代謝は 2 つのフェーズ1で発生します。フェーズ I と II はもともと疎水性 (水溶性) 化合物をより親水性にレンダリングする目的 (水溶性)、汗や尿、糞便を介して容易に excretable のため。フェーズ I (化) 反応は、酸化、還元、およびペルオキシダーゼ (p450、アセチルトランスフェラーゼ)、シトクロム p450 などの酵素によって触媒される水酸化反応 (すなわち、シクロオキシゲナーゼ、コックス)、アルド-ケト還元酵素 (AKRs)、および肝ミクロゾーム。フラビン含有モノオキシゲナーゼ (FMOs)。様々 な還元すなわち、ミクロソーム NADPH: チトクローム P450 還元酵素 (POR) と細胞内 NAD (P) h: キノン酸化還元酵素 (NQO1)、キサンチン酸化酵素 (XO)、アルデヒド酸化酵素 (AO)1による還元反応の内容はまた相.2 番目のフェーズ (活用) 段階に付けられた官能基は極性をさらに高める小さい極性分子の共役にされます。フェーズ II は、硫酸転移酵素 (結果)、 N、O- コリンアセチルトランスフェラーゼ (Nat)、メチル基転移酵素カテコール -O-メチルトランスフェラーゼ (COMT) グルタチオンS- などの反応で参加と酵素の例トランスフェラーゼ (観光科学研究)、ウリジン二リン酸不明瞭 (UGTs)1。段階で酵素の分類 I または II は、しかし、堅くないし、いくつかの酵素は、どちらのカテゴリに恐らく間違いなくグループ化できます。

P450 酵素 (EC 1.14.14.1)、ヘム蛋白質の変換3,4を触媒多くの化学物質の生体内変換に参加する様々 な生物の存在を含んでいます。P450 酵素触媒反応を 1 つの酸素原子を分子薬物動態、導入する中の酸素 2 原子が 2 つの電子 [式 (1 を必要とする反応によってフォーム水に還元される場所の多くの基質のヒドロキシル化)]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → 盧 + H2O + NADP+ (1)

P450 酵素 (ミクロゾーム P450 系) 哺乳類細胞の小胞体膜に局在 NADPH: チトクローム P450 還元酵素 (POR) とチトクロムb5がさらに含まれている酵素のモノオキシゲナーゼ系のメンバーであります。、NADH: チトクロームb5還元酵素と呼ばれる酵素の基板。一般に認められた理論の仮説、P450 に必要な 2 つの電子のドナーは、NADPH/POR システム。それにもかかわらず、チトクロームb5可能性がありますとしても電子のドナー チトクローム P450 のすなわち 2 還元の反応サイクルの P450 を削減電子のドナーとして NADH: チトクロームb5と共に機能する場所還元酵素の2,の3,4。

哺乳類利用各種 P450 酵素 (例えば家族 5、8、11、17、19、21、24、26、および 27 の酵素) ステロイド類などの貴重な内因性化合物の合成のため天然物2,3の異化作用のために使用し、.他の CYP の哺乳類酵素などヒト CYP1A2、2 9、2 19 2 6 と 3A4、代謝薬として使用される外因性の化学物質。5,6薬の代謝を触媒する最も重要な酵素は、特に CYP3A4 3A 亜科の広いです。プロ発ガン性物質などプロ-毒性、薬物動態の変換は、ヒト CYP1A1、1 a 2、1B1、2A6、2E1、3A42,5によって仲介されます。これらのアセチルトランスフェラーゼのほとんどは (CYP1A1 1B1 除く) 肝臓に存在です。それにもかかわらず、広いはいくつかの肝外臓器にも表されます。このような p450 意義は大きい、主にあるかもしれないときこれら臓器7の反応中間体を化学物質 (薬物) の生理活性代謝に彼らを参加します。各種 p450 は、これは必ずしもそうではありませんが、基板は、いくつかの化合物によって引き起こされます。

多くの P450 酵素は、毒性化学物質 (薬物) の役割を果たします。彼らは彼らの解毒代謝だけでなく、物質に変換することができますがもさらに通常彼らの毒性を引き起こす別の生物学的特性を示す内在性の高分子を変更反応性の種にそれらを有効に。DNA、脂質、タンパク質は、反応性の求電子剤と活性化学物質から生成されたラジカル調節の目標かもしれない。DNA の場合いくつかの重要な遺伝子応答とそのメカニズムを解決されている2,3,4,5。

DNA の変化は細胞成長の制御の減少につながるし、この現象が支配的な要因の発がんプロセスの開発につながると見なされます。共有結合 DNA の生成付加体の化学物質の発ガン性の初期段階で最も重要な手順の 1 つを処理する8,9,10,11発がん性を持つと判断します。それを示した付加体の DNA の形成との関係、腫瘍の発生、付加体の DNA の量の減少に対し、化学予防8,9,10,11,12,13,14. 発癌物質/薬物由来の形成 DNA 付加体の DNA の塩基に依存して DNA のこれらの塩基の配列によって影響されます。付加体の DNA の修理の場所 (上転写または非転写される DNA 鎖) と修正されたヌクレオチド シーケンス8,11,12,15の型に依存しています。 16。

この資料で述べる変更 DNA 代謝産物にアクティブにする彼らの力を調査するため化学物質 (薬物) の酵素触媒変換を利用した (生成する DNA 付加体)。DNA 結合テスト混合物をする必要があります通常個々 の薬物に応じて、酸化、または還元反応によってアクティブになります。テスト対象化学物質の酸化や還元活性化ミクロソームの細胞分画に存在する P450 依存性酵素システムを介したまたは還元還元ミクロソーム (POR、NADH: チトクロームb5の両方に存在還元酵素、P450 酵素)、細胞質細胞内分 (NQO1、XO、アオ、ペルオキシダーゼ)。反応性代謝物その後バインド DNA 付加体の DNA を形成します。酸化及び還元反応はこれらの反応種にいくつかの薬をアクティブにすることが重要なので酸化/還元酵素システムを用いた実験の手順を示します。さらに、検出し、これらの DNA を定量化できる適切なメソッドが付加体で詳しく説明します。

酵素システムによってテスト化学がアクティブかどうかを決定する 2 つの独立した手順は DNA 行きをお勧めします: 32p-ポストラベル法と利用した放射性標識化合物 (e.g、 3H または14。C)。最初はパイロット、 32p-ポストラベル試験をスクリーニングをお勧めします。ソリューションでは、正確に評価される、DNA 量の定量は、両方の方法を付ける必要があります。

32p-ポストラベル法による非放射性化学物質 (発がん性物質・医薬品) 3´-phosphodeoxynucleosides、5´-放射性リン (32P) と追加のリン酸化修飾核酸の酵素加水分解を利用してください。ああ位置、および化学 deoxynucleotide の分離通常の (非修飾) 弱まりからによる付加クロマトグラフィー17 (図 1)。ミクロコッカスヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼとして知られている混合物で化合物の化学修飾 DNA を加水分解します。(未変更の状態) 両方の法線を含む、変更デオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates [γ-32P] フォーム 5´ pH 9.5 でキャリア (非放射性) ATP と T4 ポリヌクレオチド キナーゼの存在下で ATP と反応し、加水分解 DNA の混合物32P ラベル 3´、5´ bisphosphates (図 1の「標準」プロシージャ)。使用されるアルカリ pH は T4 ポリヌクレオチドの位置 3´ でデオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates dephosphorylate キナーゼの酵素活性を最小限に抑えることが可能です。分離と32の解像度から付加体 P ラベルの化学薬品によって変更されていないラベルの弱まりはポリエチレンイミン (PEI) セルロース (図 2 多陰イオン交換薄層クロマトグラフィー (TLC) によって遂行).最初と 2 番目の溶出の手順 (D1 および D2 方向) で、短い部分に電解質の水溶液を用いた TLC PEI セルロース板の最初からラベル付き通常 (非修飾) 弱まりとして [32P] リン酸を溶出します。ガスクロマト グラフ用紙 (発がん性物質/薬物-アダクト) 疎水性特性を示すバインドされた化学物質を含む弱まりはさらに解決すべき PEI セルロース プレートのスタートで維持されるに対し、TLC プレート上に適用されます。D3 と D4 の方向 (図 2) でいくつか異なる溶媒システム。付加体の局在強化画面オートラジオグラフィー; を使用して実行されます付加体の分離された x 線フィルムの認識可能な黒ずみとして検出されます。スポットのエリアはプレートから摘出した、液体シンチレーションまたはカウント チェレンコフによって放射能を定量化する使用されます。クロマト グラム検出された付加体のイメージング法のマップし、DNA の定量化に適応されているストレージりん32p-ポストラベル試験が今も使用されます。18インスタント イメージャ マシンは頻繁にそのような検出のため、付加体の DNA の定量化。このメソッドでは、画面の技術強化オートラジオグラフィー19よりも32P を検出するための 10 倍以上の感度を提供します。

量の DNA 付加体の付加物の相対値分類 (RAL) の方程式 (2) を使用して次のように計算、定め。

インプレッション。弱まりを付加します。
RAL =---(2)
32P ATP の特定活動 (cpm で/pmol) x pmol 弱まり

RALs の値が内転の弱まりのカウント レートの比 [内転と通常 (非修飾) 弱まり] の合計カウント率弱まり20,21。ただし、この計算は平等に基づいて付加体の効率のラベリングと通常弱まり22。32p-ポストラベル法の古典的な (「標準」) プロシージャは適切様々 な DNA 付加体 (および/または非かさばるかさばる付加) しかし、その感度は満足のいく付加体の dna の少量を検出しますします。この手順を使用して、DNA (0.3 fmol 付加/μ g DNA) の 10 の7そのまま弱まりで抱合体の生成量は検出します。

この古典的な32p-ポストラベルのプロシージャの変更の様々 な技術の感度を高めるため利用されています。32で付加体の定量の 10-100 倍高感度まで P ラベルは [γ-32P] ATP (強化のプロシージャ) の制限レベルを使用して達成されています。23,24 32p-ポストラベル法の感度の増加を利用して DNA を含む消化の潜伏を提供するそれ以上のプロシージャ付加ヌクレアーゼ P1 (活性) から21 (図 1)。この酵素は、バインドされた化学物質 (内転のヌクレオチド) と弱まり、本質的にないこの酵素の基板に対し未修正デオキシリボヌクレオシド 3´-monophosphates、dephosphorylate を好みます。したがって、脱燐酸化されたデオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates (すなわちdeoxyribonucleosides) がない γ-32P から [32P] リン酸塩による T4 ポリヌクレオチド キナーゼによるリン酸化] ATP。しかし、いくつかの化学物質が、ヌクレオチドのバインド (内転弱まり)、デオキシグアノシン、この酵素によってすることができます bedephosphorylated の C8 で置換アリールが付加体のよう。対照的に、他のほとんどは付加体 (例えば、付加体のデオキシグアノシンのN2を代入) ヌクレアーゼ P1 でない脱燐酸化します。32p-ポストラベルのこの変更によりこのメソッドのかなり敏感、以上 3 つの一桁によってその感度を増加します。32p-ポストラベルのこのバージョンがメソッドを提供しますが、さらに DNA (5-10 μ g)、キャリア フリーの過剰量 [γ- 32P] ATP を利用することができます。

豊かにする別の方法、付加体、グプタ25によって記述されている、物理化学的性質を利用してかさばる deoxynucleotide のプロパティが付加体、 nに何を抽出することがでく-相転送エージェント テトラブチル アンモニウム存在下でブタノール[32P] リン酸ラベリング、未変更の弱まりがこの有機溶媒によって抽出される悪いに対し前に塩化 (未定) (図 1)。しかし、少ない疎水性付加で構成される残基、非芳香族扱いにくい部分や小さなアルキルと変更された弱まりの例効果的に抽出されませんn-ブタノール。したがって、彼らは32p-ポストラベル法のこの変更によって分析されるとき本質的に検出されません。

109,10通常当たり、前述の両方のバージョン32p-ポストラベル増加感度と DNA の定量化は非常に (3 桁) 最大付加体、1 つを検出できること付加物ヌクレオチド (0.3 - 3 amol/μ g DNA)。自明で DNA を効率性の化学薬品をテストのこれらの 2 つの方法が推奨され、したがって、彼らは詳細にこの作品のとおり。

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プロトコル

ケアと使用の実験動物 (311/1997 年、農業省チェコ共和国)、ヘルシンキ宣言に準拠しているため規則に従ってすべての動物実験を行った。

1. 肝ミクロゾームとゾル性細胞質分画の分離

  1. シンプルな差動遠心分離 (105,000 x g) ラット肝細胞下分画 (ミクロゾーム P450 酵素や還元酵素または可溶性のペルオキシダーゼが豊富なサイトゾルで豊富な) を準備します。
    注: ペレットと清が撮影ミクロソームとサイトゾル、それぞれ。
    1. PH 7.4 150 mM KCl のバッファー (バッファー 1) を含む 50 mM トリス塩酸バッファーで 2 回肝臓サンプル (1-10 g) を洗う (組織、すなわちの体重よりも 10 倍高いボリューム 10 100 mL)、組織を小さな断片に切断し、(の 2 x 2 mm サイズの周り)。
    2. このバッファーの存在下で組織をホモジナイズしてください (> 3 容積/重量 mL/g) 5 分と廃棄のための 4 ° C でホモジナイザのろ過を使用して組織の残りの非均質化部分のフィルター ペーパーを。4 ° C で 10 分間 600 x gでホモジネートを遠心分離し、上澄みを別の遠心分離管に転送します。
    3. バッファー 1 (組織 1 g 当たり 1 mL) にペレットを再均質、1.1.3 の手順を繰り返します。、ペレットを破棄します。遠心分離機の 4 ° C で 20 分間 15,000 × gでプールされた清上清を別の遠心分離管に転送します。
    4. 4 ° C で 60 分 105,000 x gで上清を遠心分離します。上清 (細胞質) を収集して因数 (1-10 mL)-80 ° C で保存します。ブラッドフォード26で説明したメソッドを使用して蛋白質の量の細胞質を特徴付けます。
    5. 100 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.4 でペレットを再停止 (> 2 容積/重量 mL/g)、105,000 x gで 4 ° C で 60 分間遠心上清を捨てます。50 mM トリス塩酸バッファー、pH 7.4 150 mM KCl と 20% グリセロールを含む再ペレット (ミクロゾーム) を均質化 (< 5 容積/重量 mL/g) で 4 ° C でホモジナイザーミクロソームを 0.5 - 1 mL 因数-80 ° C で保存します。ブラッドフォード26で説明したメソッドを使用して蛋白質のコンテンツのミクロソームを特徴付けます。
    6. ミクロゾームのチトクローム P450 の濃度を決定します。
      注: 大村と佐藤27一酸化炭素 (CO) の還元 P450 の複合体の吸収の決定のとおり、ミクロゾーム P450 酵素の濃度、測定します。一酸化炭素は毒性化合物は、ケアとフードで処理します。

2. 孵化酵素システムの存在下で dna テストの化学物質 (発ガン性物質/薬) の

  1. テストの化学物質 (発ガン性物質/薬) DNA のチトクローム P450 酸化酵素系の存在下での孵化
    1. インキュベーション混合物含む、4 ° C で 0.75 mL の最終巻、次の化合物および酵素システムを準備します。
      1. ミックス 10 mM NADPH または NADPH 生成システム (10 mM MgCl2, 10 mM D-グルコース 6-リン酸、10 mM NADP+、1 U/mL D-グルコース 6-リン酸脱水素酵素) と 100 mM リン酸緩衝、pH 7.4、(0.375 mL) (75 μ L)。
      2. この混合物のミクロソームに追加または純粋な組換え昆虫細胞から分離されたミクロソームである Supersomes P450 発現組み換え P450 酵素、50 μ L のミクロゾームの supersomal 50 pmol P450 酵素の cDNA を含むバキュロ ウイルス構築-実験室でまたは商業ソースから分離された肝ミクロソーム画分の調製品
      3. 1 mg 子牛の胸腺 DNA (原液 - 3.3 mg/mL の蒸留水での 0.3 mL) を追加し、5 の渦シェーカーを振る s。
      4. 最後に、追加 7.5 μ L 0.1 mM テスト エリプチシン薬 DMSO と 42.5 μ L に溶解した蒸留水 0.75 mL の培養混合物の量に達する。使用化学物質の付いた3H や14C や DNA の検出手順に応じて、ラベルのない化学物質の付加します。
      5. 30-60 分の 37 ° C で開かれた管内 5 s. 加温の渦シェーカーを振る。
      6. また活性化システム (ミクロゾーム サンプル) または (ii) それと、なく化合物のテストなし (i) が、同様に、2 つのコントロールの孵化を準備します。
  2. 還元酵素システムの存在下で dna テスト物質 (発ガン性物質/薬) の孵化
    1. インキュベーション混合物含む、4 ° C で 0.75 mL の最終巻、次の化合物および酵素システムを準備します。
      1. 4 ° C でミックス 100 mM トリス塩酸バッファー、pH 7.4 0.2% を含むトゥイーン 20、(0.375 mL) NQO1 還元酵素 (NADPH) の補酵素の 10 ミリメートルのソリューション (75 μ L)、細胞質画分 (肝細胞質画分の分離実験室でまたは、細胞質を用いた場合画分タンパク質 1 mg (50 μ L) を含む商業ソースから取得された個々 の人間のドナーから分離された)。
      2. 1 mg の子牛の胸腺 DNA (原液 - 3.3 mg/mL の蒸留水 0.2 mL) を追加し、5 のシェーカーを振る s。
      3. 最後に、7.5 μ L 0.1 mM 化学物質 (化合物の溶解度に応じて蒸留水、メタノール、エタノールまたは、DMSO に溶解) とインキュベーションの混合物の 0.75 mL の量に達する 42.5 μ L 蒸留水を追加します。使用化学物質の付いた3H や14C や DNA の検出手順に応じて、ラベルのない化学物質の付加 (下記参照)。
      4. アルゴン 1分間 30-60 分の 37 ° C で閉じた管内 5 s. 加温のシェーカーでシェイクに反応混合物をパージします。
      5. また活性化システム (細胞質画分) または (ii)、それとなくテスト化学薬品なし (i) が、同様に、2 つのコントロールの孵化を準備します。
  3. 潜伏テストの化学物質の過剰を削除する有機溶剤の混合物の抽出
    1. これらの溶媒を追加することにより酢酸エチルまたはジエチル エーテル (ヘキサン) の同じボリュームにキャップと試験管内培養混合物を混ぜます。エマルジョン形までシェーカーで管の内容を振る。
    2. 常温遠心分離機で 1,600 x gで (3 分) を回転します。水相が正しく分離された場合、はスピン 1 回以上の長い期間または遠心分離速度。
    3. ピペットで集める上、有機相を削除します。場合少量 (< 400 μ L)、適切な先端装備自動ピペットを活用を使用する。この有機相を捨てます。
    4. 2.3.1 の手順を繰り返します。、2.3.2。、2.3.3 と。窒素ガスの流れによって残留有機溶剤を削除 (取り外しの少なくとも 5 ~ 10 分が必要)。
  4. 孵化からの DNA の隔離
    1. フェノール/クロロホルム ソリューションおよびエタノールの沈殿物からの DNA の抽出
      1. フェノール、フェノール/クロロホルム (1:1)、DNA の溶液からタンパク質を抽出して培養混合物から DNA を分離し、次に示す手順によってクロロホルム タンパク質を排除します。
      2. フェノール又はフェノール/クロロホルム (1:1) 鷹のエッペン チューブ キャップと同じ量とインキュベーションの混合物を組み合わせます。エマルジョン形まで混合物をかき混ぜます。
      3. 常温遠心分離機で 1,600 x gで (3 分) を回転します。水相が正しく区切られていませんが長い期間、または遠心分離に高い速度でもう一度スピンします。
      4. 新しいポリプロピレン管にピペットの上部水相を転送します。場合少量 (< 400 μ L)、適切な先端装備自動ピペットを活用を使用する。有機相と共にタンパク質インターフェイスを削除します。
      5. フェノールおよびクロロホルム (1:1) の混合物の同じ量と上層の水相を組み合わせます。2.4.1.2 の手順を再現します。-2.4.1.4。
      6. 同じ量のクロロホルムと手順 2.4.1.2 と上層の水相を組み合わせます。-2.4.1.4。風邪 (-20 ° C) エタノールの 2 つの容積と沈殿物によって DNA を回復します。DNA 溶液の量を決定します。
      7. 最後の 5 M 塩化ナトリウムの添加により 1 価の陽イオンの濃度を合わせる 0.1 M の濃度は積極的にかき混ぜます。風邪 (-20 ° C) エタノールの 2 つの容積と組み合わせるし、正しくミックスします。-20° Cに冷却します。
      8. DNA を沈殿するまで-20 ° C で保存します。浮遊中に DNA が断片化されているとき (e.g、酵素的活性化反応における酸素ラジカルの生成によって) または小さい DNA のサイズ分離のプロシージャの間に (< 1 kb) または DNA が少量であるとき (< 0.1 mg/。mL)、冷却の時間が増加して、-70 ° c. に温度が低下しました。
      9. 1,600 × g遠心分離機で 0 の ° c で (10 分) を回転します。DNA が小さな断片の形式、または低濃度で存在する場合は、長い期間 (30 分) もう一度スピンします。上清を捨てます。
      10. 存在可能性もある溶質 (や化学のテストの残留痕跡) を削除するには、DNA、70% エタノールとジエチル エーテル洗浄 DNA を沈殿させた。洗浄は、寒さ (-20 ° C) で DNA を沈殿 70% エタノール。1,600 × g遠心分離機で 0 の ° c で (10 分) を回転します。上清を捨てます。
      11. 2.4.1.10 の手順を繰り返します。洗浄は、寒さ (-20 ° C) で DNA を沈殿 70% エタノール。1,600 × g遠心分離機で 0 の ° c で (10 分) を回転します。上清を捨てます。
      12. 2.4.1.10 の手順を繰り返します。残留の上清を除去する吸収紙の上、垂直状態に管を置きます。DNA の分離から化学の試験の潜在的な残基を破棄するジエチル エーテル 1 mL を追加することによって DNA の餌を洗います。1,600 × g遠心分離機で 0 の ° c で (10 分) を回転します。上清を捨てます。
      13. 適切な量の DNA ペレットを溶解 (0.5 - DNA 濃度を達成するために 100-400 μ L で通常 1 μ g/μ L) 蒸留水 (または 0.15 mM 1.5 mM のクエン酸ナトリウム塩化ナトリウム)。DNA ソリューションは、一晩、4 ° C で立つことができるまたは DNA を溶解させる 10-30 分の 37 ° C に加熱することができます。
      14. ストレージ、前に DNA 溶液の濃度を付加物の減少の結果可能性があります凍結融解が繰り返されたために、DNA を小さい因数 (10-20 μ L) に分けます。ストア-80 ° c またはより冷たい。
        注: DNA の吸光光度定量: シンプルで正確なメソッド、サンプルは、純粋な場合準備の DNA 量を測定するために広く用いられている (すなわちタンパク質、フェノール、その他などの汚染物質の大量なし核酸)、(前に説明した手順を参照してください) 拠点によって吸収される DNA の紫外線照射量の吸光光度測定は、28。
  5. 付加体形成を DNA の検出のための手順
    1. 32P-ポストラベル試験
      注: 加水分解 DNA 付加体の解析 (2.5.1) のと同様、通常の (非修飾) 弱まり (2.5.7) のこの段階で準備加水分解物を利用しています。
      1. ~ 450 単位 (U) の濃度で水にミクロコッカスヌクレアーゼ (MN) を溶解/mL。蒸留水に対して dialyze、300 U/mL に調整します。Dialyze 脾臓ホスホジエステラーゼ (SPD) ソリューション、4 U/mL に調整します。
      2. 最終濃度 150 mU/μ L MN と 2.5 mU/μ L SPD (MN/SPD ソリューション) にミネソタおよび SPD をミックスします。12.5 μ g を含む DNA 溶液を取るし、蒸発器内減圧乾固します。6.5 μ L 蒸留水に溶解します。
      3. 5.0 μ L MN/SPD ソリューションを追加 (ミネソタの最終濃度は 60 mU/μ L、SPD の最終濃度が 1 mU/μ L) と 1.0 μ L 消化バッファー (コハク酸ナトリウムの最終濃度は 20 mM、CaCl2の最終濃度が 8 mM)。混合物の最終巻は、12.5 μ L. ミックスし、37 ° C で 3 時間反応
      4. さらに希釈と未変更の弱まり (2.5.7) の分析のための 2.5 μ L (別の管への転送) を削除します。
    2. ヌクレアーゼ P1 濃縮
      1. 加水分解物の残りの 10.0 μ L を追加 0.65 μ L ナトリウム酢酸バッファー (最終濃度、40 mM)、0.65 μ L ZnCl2ソリューション (最終濃度 0.1 mM)、1.25 μ L NP1 ソリューション (最終濃度、0.385 μ g/μ L)、および 0.45 μ L 蒸留水します。混合物の最終巻は 13 μ L です。
      2. 37 ° C で 30 分間反応混合物を許可し、トリス溶液 3 μ l を添加した反応を終了します。
    3. n-ブタノール濃縮
      1. DNA の加水分解物の残りの 10.0 μ L、11.6 mM, ギ酸アンモニウム溶液、pH 3.5、および 25 μ L 10 mM 未定塩化物溶液の 215 μ L を追加します。250 μ L n抽出-積極的な混合によるブタノール (水で飽和)。別々 の画層とnの上の離陸に 1,600 x gで (3 分) のスピン-ブタノール層。250 μ nともう一度抽出-ブタノール (水で飽和)、スピン、上のnを取る-ブタノール層、および元のエキスと組み合わせる。
      2. 400 μ L の水を追加 ( nで飽和-ブタノール) これに抽出、および積極的にミックスします。スピンは、別々 のレイヤーと下の水層を削除します。水の 400 μ L を使用してこの洗浄手順を繰り返します ( nで飽和-ブタノール)。Nに 250 mm トリス塩酸溶液、pH 9.5 3 μ L を追加-ブタノール層。Nを蒸発させる-ブタノール常温蒸発器内の乾燥に。
      3. 100 μ L n残余を分解-ブタノール、再度、乾燥に蒸発し、16.0 μ L の水に溶解します。
    4. ラベリング、アダクト
      1. ビシン緩衝液 (ラベリング バッファー) の 1 μ L と 100 µCi [γ-32P] ATP、冷たい atp 45 pmol、10.0 を含むミックスの 4.5 μ L を追加 U の T4-PNK (T4 phosphonucleotide キナーゼ) 16.0 μ L 溶液に NP1 またはブタノール濃縮ミックスから。試薬の最終濃度は次のようになります: 20 mM ビシン、10 mM MgCl2や 10 mM dithiotreitol、0.5 mM スペルミジン 0.5 U/μ L T4-PNK、3 μ M の ATP。混合物の合計量は 20 μ L です。
      2. 室温で 30 分間反応混合物を許可します。全体のサンプルを適用 (すなわち。 20 μ l) PEI セルロース TLC プレート (2.5.6。)。
    5. NP1 またはnの効果の評価-ブタノールの手順を強化
      1. 50 μ L の水で管の底を洗います。30 s とスピン (1 分) 1,600 × gで遠心分離機には積極的に存在を確立するミックスには、蓋の上の汚染はありません。PEI セルロース TLC プレート (20 × 20 cm) に 5 μ L をスポットします。(NH4)2で 280 mM のソリューションを使用してガスクロマト グラフ4と 50 mM の NaH2PO4、pH 6.8。
    6. 内転の弱まりの TLC 分離
      1. 蒸留水に TLC の版を前洗い。特に自家製の板のことをお勧めします。
        注: この洗浄実施されなければならない板、特に溶媒フロント、バック グラウンドに昇格させる色から黄色の色を削除します。
      2. PEI セルロース TLC プレート上に全体のサンプルをスポットし、クロマトグラフィーを開始 (2.5.4);。付加体のクリーンアップが D1 と D2 の方向 (図 2) でプレートを開発することによって実行されます。
      3. D1 方向 (図 2) でプレートを開発します。1.7 M ナトリウム リン酸バッファーを使用、DNA が付加体確保するため pH 6.8, TLC プレートの開始時に残っています。同様にこのバッファーを使用して D2 方向に板を開発します。プロシージャの可能なバッファーについては、いくつかの種類の解像度の説明を参照してくださいソリューション付加体の20,28。
        注: D2 方向板の開発を省略できます。
      4. 脱イオン水で 2 つの連続したバスで約 5 分のためのクロマトグラフィーの後、洗浄します。その後、プレートを乾燥します。
      5. 3.5 M リチウム ギ酸バッファー、pH 3.5 を使用して D3 および D4 の方向に板を開発、D3 方向に 8.5 M 尿素と 0.5 を含む M トリス塩酸バッファー、pH 8.0、D4 方向 (図 2) のための 0.8 M LiCl と 8.5 M 尿素を含みます。溶剤を調整して、TLC プレート上付加スポットを開発する必要があります。D3 と D4 の開発手順の可能なバッファーの詳細については、ソリューションのいくつかの種類の解像度は23,24,25,28付加体で説明を参照してください。
      6. D4 方向と水洗浄の開発後、D4 の問題を避けるため、1.7 M リン酸ナトリウム、pH 6.0 (通常は D5 の方向で開発として割り当て)、紙芯 (12 x 11.5 cm) の上に (D4) に沿って板を開発します。
        注: D5 方向を省略もできます。この場合、溶媒は、TLC の上部に達したときに TLC タンクを開き、最大 60 分のために実行を許可必要です。このメソッドは芯 (D4 の任意の問題を削除する多くの実験室で頻繁に使用法) を追加するよりも。
    7. 加水分解後通常の (非修飾) 弱まりの定量化
      1. 加水分解物の因数を希釈 (から2.5.1。 DNA の加水分解を記述する)、蒸留水 (すなわち。、2.5 μ l から消化の混合物の2.5.1。 250 μ l に調整、150 μ l に 10 μ l このソリューションの調整)。
      2. このダイジェストの分注 5 μ L (10 pmol 通常弱まり) を取る、2.5 μ L 10 mM トリス塩酸バッファー、pH 9.0 では、およびようにラベル追加2.5.4 。(混合物の最終巻は 10 μ L である) です。室温で 30 分間反応できるようにします。
      3. 混合物の分注 4 μ L を取り、10 mM トリス-HCl、pH 9.0 750 μ L に希釈します。ミックスとスピンは蓋の汚染がないことを確立します。PEI セルロース TLC プレートに 5 μ L を適用します。だから 280 mM (NH4)2の溶液に TLC プレートを開発4と 50 mM の NaH2PO4、pH 6.5。TLC 後乾燥することができます。
      4. 4 そのまま deoxynucleotide ビス リン酸塩をローカライズする周囲温度の約 45 分の実行は放射線写真法を使用します。液体シンチレーションやチェレンコフ計数による定量化のためのスポットをカットします。
    8. 親戚の計算は、ラベリング (RAL) 付加物します。
      1. 付加点の数とラベルの変更されていない (通常の) 弱まりの因数の数の値を決定します。
        注: 後者は少ない前者、未変更の (通常) 弱まり付加レベルの RAL 値を評価するための数に適用する変換係数は図より材料 180,000 カウントに覚悟しなければなりません。RAL の DNA 付加体の上記 (2) の式に従って計算されます。
    9. テストの発ガン性物質や dna 標識放射性薬剤を使用して薬物の結合の検出
      1. 3H や14C 液体シンチレーション カウンターによる化学修飾 DNA の放射能を評価します。
      2. シンチレーション バイアルにシンチレーション溶液 3 mL に DNA 溶液の 10-50 μ L を追加します。よく混ぜます。シンチレーション カウンターを使って放射能を測定します。

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結果

中間体の共有結合の結果に代謝される化学物質 (発ガン性物質/薬) の効力を調査する (すなわちP450、ペルオキシダーゼ、還元酵素) の活性化酵素触媒の利用のためにはここで説明したプロトコルを使用してください。DNA に結合 (世代の DNA 付加物)、(i) (ため検討を見る、29,30,31)、抗悪性腫瘍剤エリプチシンの薬理作用の新規のメカニズムを解決することができました (ii) 2 つの病因植物 (のレビューを参照してください、32,33,34、アリストロキア酸をアルカロイド (アリストロキア酸腎とバルカン流行性腎症) による上部尿路管癌に関連付けられている neph...

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ディスカッション

この論文では付加体の共有結合 DNA の生成で生じる代謝の中間体に bioactivated をする化学物質の効能を研究する広くアクセス可能な方法論を示した。これは重要な問題です、付加体の環境化学物質の効力または共有結合 DNA を生成する代謝産物への酵素的活性化の薬の評価ために、がんとその治療法の開発に重要なフィールドは。腫瘍の開発の原因と考えられる発ガン性物質による DNA の変更は今発ガン性物質による発がんのセントラル ドグマとして判断されます。この提案は様々 な現象などの所見によって確認される: 様々 な発ガン性物質の発ガン性 (i) プロパティ反応求核 DNA センター代謝物にこれらの化合物の生理活性に依存(ii) DNA のレベルは頻繁に付加体多くの発癌性反応に対応(iii) およびある特定の腫瘍のサプレッサー遺伝子のプロトオンコジーンのいくつかの活性化突然変異は、発がん性のポーテンシーと化学物質とその修正によって引き起こされるかもしれない。さらに、抗がん剤によって DNA の共有結合修飾は、最も効率的な DNA 損傷の影響これらの薬がん治療での使用結果の 1 つとして実証されています。

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開示事項

著者は、何を開示します。

謝辞

本研究は、チェコ科学財団 (GACR、グラント 17 12816S) によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
トリスシグマアルドリッチ252859
塩化カリウムグマアルドリッチP9541
酸ナトリウムシグマアルドリッチS2889
フェノールロス0032.8
ノール/クロロホルム/イソアミルアルコールロスA156.1
タノールペンタ70390-11000
子牛胸腺 DNASigma-AldrichD4522
NADHSigma-AldrichN7004
NADP+Sigma-AldrichN5755
NADPHSigma-AldrichN7505
D-グルコース 6-リン酸Sigma-Aldrich7647001
D-グルコース 6-リン酸デヒドロゲナーゼSigma-AldrichG6378
SupersomesCorning Gentest456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
ヒト肝臓 ミクロソームCorning Gentest452172
Tween 20Sigma-AldrichP1379
HypoxanthineSigma-Aldrich77662
2-ヒドロキシピリミジンSigma-AldrichH56800
酢酸エチルSigma-Aldrich437549
ジエチルエーテルSigma-Aldrich179272
黄色ブドウ球菌/em<>Sigma-AldrichN3755
子牛の脾臓、II型カルバイオケ524711
ムからのホスホジエステラーゼヌクレアーゼP1 Penicillium citrinumSigma-AldrichN8630
ビシンSigma-Aldrich163791
DL-DithiotreitolSigma-AldrichD0632
スペルミジンSigma-AldrichS2626
塩化テトラブチルアンモニウムSigma-Aldrich86870
n-ブタノールSigma-Aldrich437603
T4-polynucleotide kinaseUSB Corp70031Y
[γ-32P]ATPHartman Analytic GmbHFP-201
PEI含浸セルロース TLCプレートMacherey-Nagel801053
Packard Instant Imager A202400PackardG120337
EllipticineSigma-Aldrich285730
参考文献403-ニトロベンザントロン
シ酢フェエに示すように調製(合成)した

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