共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

サマリー

環境化学物質、酵素中間体の共有結合 DNA の生成に bioactivated が付加体に薬剤の効力を評価するがんとその治療法の開発に重要な分野です。DNA 付加体、その検出と定量の技術だけでなく、フォームに化合物の活性化のための方法を説明します。

要約

共有結合 DNA 付加体の化学物質によって形成される発がん性の薬は発がんプロセスの初期段階で最も重要な要因の一つと判断されたか。癌の原因を考えると、この結合は、今化学発がんのセントラル ドグマとして評価されます。ここでは、チトクローム P450 によって触媒反応を用いた方法を説明し、付加体の化学物質や代謝産物がこれらの DNA を形成するの活性化のための薬の効力を調査するその他の微生物による分解酵素。体内酵素シトクロム P450 に他体内の酵素、すなわちペルオキシダーゼ、NADPH: チトクローム P450 (ミクロゾーム及びサンプルを有する細胞画分の分離を記述する手順を紹介してNAD (P) h: キノン酸化還元酵素、またはキサンチン酸化酵素酸化還元酵素)。メソッドの説明また、分析化学物質の代謝活性化のための DNA の隔離のためのそれらと同様、これらの酵素によって使用できます。さらに、検出および化学/医薬品由来 DNA の定量化できる適切な方法は、すなわち、 ³²p-ポストラベル法のさまざまな変更を内転、放射性ラベルの雇用の化学物質を分析、詳細に表示されます。

概要

(環境化学物質や薬物) は化学物質の代謝は 2 つのフェーズ¹で発生します。フェーズ I と II はもともと疎水性 (水溶性) 化合物をより親水性にレンダリングする目的 (水溶性)、汗や尿、糞便を介して容易に excretable のため。フェーズ I (化) 反応は、酸化、還元、およびペルオキシダーゼ (p450、アセチルトランスフェラーゼ)、シトクロム p450 などの酵素によって触媒される水酸化反応 (すなわち、シクロオキシゲナーゼ、コックス)、アルド-ケト還元酵素 (AKRs)、および肝ミクロゾーム。フラビン含有モノオキシゲナーゼ (FMOs)。様々 な還元すなわち、ミクロソーム NADPH: チトクローム P450 還元酵素 (POR) と細胞内 NAD (P) h: キノン酸化還元酵素 (NQO1)、キサンチン酸化酵素 (XO)、アルデヒド酸化酵素 (AO)¹による還元反応の内容はまた相.2 番目のフェーズ (活用) 段階に付けられた官能基は極性をさらに高める小さい極性分子の共役にされます。フェーズ II は、硫酸転移酵素 (結果)、 N、O- コリンアセチルトランスフェラーゼ (Nat)、メチル基転移酵素カテコール -O-メチルトランスフェラーゼ (COMT) グルタチオンS- などの反応で参加と酵素の例トランスフェラーゼ (観光科....

プロトコル

ケアと使用の実験動物 (311/1997 年、農業省チェコ共和国)、ヘルシンキ宣言に準拠しているため規則に従ってすべての動物実験を行った。

1. 肝ミクロゾームとゾル性細胞質分画の分離

1. シンプルな差動遠心分離 (105,000 x g) ラット肝細胞下分画 (ミクロゾーム P450 酵素や還元酵素または可溶性のペルオキシダーゼが豊富なサイトゾルで豊富な) を準備します。
   注: ペレットと清が撮影ミクロソームとサイトゾル、それぞれ。
   1. PH 7.4 150 mM KCl のバッファー (バッファー 1) を含む 50 mM トリス塩酸バッファーで 2 回肝臓サンプル (1-10 g) を洗う (組織、すなわちの体重よりも 10 倍高いボリューム 10 100 mL)、組織を小さな断片に切断し、(の 2 x 2 mm サイズの周り)。
   2. このバッファーの存在下で組織をホモジナイズしてください (> 3 容積/重量 mL/g) 5 分と廃棄のための 4 ° C でホモジナイザのろ過を使用して組織の残りの非均質化部分のフィルター ペーパーを。4 ° C で 10 分間 600 x gでホモジネートを遠心分離し、上澄みを別の遠心分離管に転送します。
   3. バッファー 1 (組織 1 g 当たり 1 mL) にペレットを再均質、1.1.3 の手順を繰り返します....

結果

中間体の共有結合の結果に代謝される化学物質 (発ガン性物質/薬) の効力を調査する (すなわちP450、ペルオキシダーゼ、還元酵素) の活性化酵素触媒の利用のためにはここで説明したプロトコルを使用してください。DNA に結合 (世代の DNA 付加物)、(i) (ため検討を見る、^29,30,31)、抗悪性腫瘍剤エリプチシンの薬理作用の新規のメカニズムを解決することができました (ii) 2 つの病因植物 (のレビューを参照してください、^{32,33,34、アリストロキア酸をアルカロイド (アリストロキア酸腎とバルカン流行性腎症) による上部尿路管癌に関連付けられている neph.......}

ディスカッション

この論文では付加体の共有結合 DNA の生成で生じる代謝の中間体に bioactivated をする化学物質の効能を研究する広くアクセス可能な方法論を示した。これは重要な問題です、付加体の環境化学物質の効力または共有結合 DNA を生成する代謝産物への酵素的活性化の薬の評価ために、がんとその治療法の開発に重要なフィールドは。腫瘍の開発の原因と考えられる発ガン性物質による DNA の変更は今発ガン性物質による発がんのセントラル ドグマとして判断されます。この提案は様々 な現象などの所見によって確認される: 様々 な発ガン性物質の発ガン性 (i) プロパティ反応求核 DNA センター代謝物にこれらの化合物の生理活性に依存(ii) DNA のレベルは頻繁に付加体多くの発癌性反応に対応(iii) およびある特定の腫瘍のサプレッサー遺伝子のプロトオンコジーンのいくつかの活性化突然変異は、発がん性のポーテンシーと化学物質とその修正によって引き起こされるかもしれない。さらに、抗がん剤によって DNA の共有結合修飾は、最も効率的な DNA 損傷の影響これらの薬がん治療での使用結果の 1 つとして実証されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリス	シグマアルドリッチ	252859
塩化カリウム	グマアルドリッチ	P9541
酸ナトリウム	シグマアルドリッチ	S2889
フェノール	ロス0032.8
ノール/クロロホルム/イソアミルアルコール	ロス	A156.1
タノール	ペンタ	70390-11000
子牛胸腺 DNA	Sigma-Aldrich	D4522
NADH	Sigma-Aldrich	N7004
NADP+	Sigma-Aldrich	N5755
NADPH	Sigma-Aldrich	N7505
D-グルコース 6-リン酸	Sigma-Aldrich	7647001
D-グルコース 6-リン酸デヒドロゲナーゼ	Sigma-Aldrich	G6378
Supersomes	Corning Gentest	456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
ヒト肝臓 ミクロソーム	Corning Gentest	452172
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	77662
2-ヒドロキシピリミジン	Sigma-Aldrich	H56800
酢酸エチル	Sigma-Aldrich	437549
ジエチルエーテル	Sigma-Aldrich	179272
黄色ブドウ球菌/em<>	Sigma-Aldrich	N3755
子牛の脾臓、II型	カルバイオケ	524711
ムからのホスホジエステラーゼヌクレアーゼP1 Penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630
ビシン	Sigma-Aldrich	163791
DL-Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
スペルミジン	Sigma-Aldrich	S2626
塩化テトラブチルアンモニウム	Sigma-Aldrich	86870
n-ブタノール	Sigma-Aldrich	437603
T4-polynucleotide kinase	USB Corp	70031Y
[γ-32P]ATP	Hartman Analytic GmbH	FP-201
PEI含浸セルロース TLCプレート	Macherey-Nagel	801053
Packard Instant Imager A202400	Packard	G120337
Ellipticine	Sigma-Aldrich	285730
参考文献40			3-ニトロベンザントロン

シ酢フェエに示すように調製(合成)した