外側境界セグメンテーションと Imagej のプラグインで海綿骨の定量化を支援

海綿骨のマイクロ CT 解析は、異なる骨損失条件^1,2,3、いくつかの変数が関連の下で小動物の骨の形態学的変化を追跡するための標準的なアプローチ、骨の構造は、報告された⁴です。しかし、このようなパラメーターが⁵長骨の骨幹端に均等に配布されていない、現在商用マイクロ CT 機^{6,7 から各サンプルの各構造変数の要約または平均値のみが報告されます。}、単一の値は完全に分析領域の測定パラメーターの特性を表すことはできません。海綿骨の層によって定量化だけでなく各変数の詳細を保持、また構造の後の統計的分析を促進する分析地域のような変数の分布のプロファイリングを有効に⁵さまざまな条件下での変更。したがって、このメソッドの目的は、現在、市販のマイクロ CT 解析パッケージで利用されていません、各スライス レベルでマイクロ CT スキャンの海綿骨を定量化は。

効率的にセグメント海綿骨--スライスごとに自動分割方法が望ましいです。ただし、マイクロ CT 解析のための現在の標準的な技術、労働集約的でエラーを起こしやすい、骨皮質のコンパートメントから分離する半自動補間続いて手動対話型輪郭に基づいて、実質的な演算子バイアス^8,9,10に関連付けられています。自動セグメンテーション方法^11,12は報告されたが、海綿骨と皮質骨の間良好な分離がある地域で地域の明確な分離なしではなく、このようなメソッドは最適です。さらに、異なるセグメンテーション パラメーターは異なるサンプル¹²、必須、様々 なパラメーターの組み合わせ¹²を試みることによって骨のサンプルのグループに適用される満足な分割パラメーターを手動で選択するは面倒です。にもかかわらず、すべての関連するパラメーターが設定されている場合、分割プロセスは自動です。骨の外側の境界がスキャンの背景を持つ最大のコントラストと長骨の骨幹端部皮質シェルは、選択した領域を分析ことができます長い骨の外側輪郭に応じてセグメンテーション方法いくつかの変更を表示確実に、正確には、皮質の殻から海綿骨を区切ります。このような分割方法の利点は、セグメンテーションは海綿骨と皮質骨^{6,12の違いではなく背景と骨の外側の境界の違いに基づいています。 13}, したがって、それは一般的に異なるグループの間の骨梁変化のより信頼性の高い解析を促進する骨のサンプルのグループの満足できる分割パラメーターの組み合わせを見つけるは簡単。

各スライスにはボリューム、サーフェス、および 3 次元 (3 D) の厚さは 3 D 数量で報告される間、レベル、エリア、境界、および二次元 (2 D) 厚さが 2D 解析の報告されます。そのような情報は、一般的に現在画像解析ツールは、そのような情報が必要な一般のイメージに報告された手順を適用できることを示すから報告されません。

動物を対象とする手順ケアおよび実験動物の使用 (NIH パブリケーション、第 8 版、2011) ガイドに従って行われたとが検討されており動物介護制度と武漢の使用委員会によって承認されました。大学。

1. ソフトウェアのインストール

1. ImageJ ソフトウェアをインストールします。Https://imagej.nih.gov/ij/ からの 64 ビットの Java とバンドルされた ImageJ (バージョン 1.51 p) ソフトウェアの Windows 版をダウンロードします。「ImageJ ディレクトリ」とその後呼ばれるフォルダーにダウンロードしたソフトウェアを抽出します。
   注: 骨梁解析プラグイン時間 64 ビット java ランタイム (バージョン 1.8) とできれば 64 ビット Windows 7 オペレーティング システム 64 ビット版の windows オペレーティング システムが必要です。
2. 骨分析のプラグインをインストールします。Http://www.bomomics.com からの骨の分析のプラグインを要求し、「ImageJ ディレクトリ/プラグイン"は、ImageJ ワードプレスプラグイン ディレクトリ内容を解凍します。
   注: 5 のための測定は、隣接するスライスが報告される指定場所、無料版、または、スライスの範囲の指定方法と測定場所は、商業上のバージョンとしては、プラグインを入手できます。

2. 海綿分析用 3 D データセットを準備します。

1. スキャン プロトコル⁵標準マイクロ CT 機次にラットの大腿骨をスキャンし、ImageJ、例えば、tiff 形式にインポートできるフォーマットでデータを保存します。複数の骨のサンプルは、1 つのサンプル チューブで同時にスキャンされた、最初 ImageJ にデータをインポートし、ImageJ の画像処理ツールを使用して、他のサンプルをオフにトリミングによってそれぞれの個々 のボーンを分離します。その後、ImageJ に後でインポートできる形式で結果の画像を保存します。
   注: 分析で使用される代表的なサンプル イメージ ファイルが含まれている (補足ファイル 1)。
2. 標準的な 2 D および 3 D オブジェクトをシミュレートします。
   1. ImageJ ソフトウェアを開きます。プラグインの下 |BoMomics |オブジェクトをシミュレートメニューの丸ボタンをクリックしてポップアップ ウィンドウに直径 200 を入力し、200 ピクセル (図 3B) の直径のシミュレートされた円を生成する[ok]をクリックします。生成された円を tiff 形式で保存します。
   2. ImageJ ソフトウェアを開きます。プラグインの下 |BoMomics |オブジェクトをシミュレートメニューの正方形のボタンをクリックしてポップアップ ウィンドウに側面の長さとして 200 を入力し、200 ピクセル (図 3B) の辺の長さとシミュレートされた正方形を生成する[ok]をクリックします。生成された広場を tiff 形式で保存します。
   3. ImageJ ソフトウェアを開きます。プラグインの下 |BoMomics |オブジェクトをシミュレート] メニューの [四角形] ボタンをクリックしてポップアップ ウィンドウの高さと幅と 100 と 200 と入力し、200 ピクセルの幅と高さが 100 ピクセル (図 3 シミュレーション四角形を生成する[ok]をクリックして B)。生成された四角形を tiff 形式で保存します。
      注: 円 (直径: 200 ピクセル)、正方形 (側面の長さ: 200 ピクセル) と長方形 (幅: 200 ピクセル; 高さ: 100 ピクセル) 以降の解析用に保存されます。
   4. ImageJ ソフトウェアを開きます。プラグインの下 |BoMomics |オブジェクトをシミュレート] メニューの [キューブをクリックし、ポップアップ ウィンドウの辺の長さとして 30 を入力し、シミュレートされたキューブを生成する[ok]をクリックします。最後に、のプラグインをクリックして | 3 D |ボリューム ビューアー生成されたキューブを表示して tiff 形式 (図 3C) で保存します。
   5. ImageJ ソフトウェアを開きます。プラグインの下 |BoMomics |オブジェクトをシミュレートメニューの立方体ボタンをクリックし長さ、幅、40 とポップアップ ウィンドウの高さとして 30 と 80 を入力、シミュレートされた立方体を生成する[ok]をクリックします。最後に、のプラグインをクリックして | 3 D |ボリューム ビューアー生成された立方体を表示して tiff 形式 (図 3C) で保存します。
   6. ImageJ ソフトウェアを開きます。プラグインの下 |BoMomics |オブジェクトをシミュレートメニューの球ボタンをクリックしてポップアップ ウィンドウで直径 30 を入力し、シミュレートされた球を生成する[ok]をクリックします。最後に、のプラグインをクリックして | 3 D |ボリューム ビューアー生成された球を表示して tiff 形式 (図 3C) で保存します。
   7. ImageJ ソフトウェアを開きます。プラグインの下 |BoMomics |オブジェクトをシミュレートメニューの [円柱] ボタンをクリックしてポップアップ ウィンドウの高さと直径と 100 30 を入力し、シミュレートされたシリンダーを生成する[ok]をクリックします。最後に、のプラグインをクリックして | 3 D |ボリューム ビューアー生成されたシリンダーを表示して tiff 形式 (図 3C) で保存します。
      注: 球 (直径: 30 ピクセル)、キューブ (側面の長さ: 30 ピクセル)、立方 (長さ: 80 ピクセル × 横: 40 ピクセル; 高さ: 30 ピクセル) と円柱 (直径: 30 ピクセル; 高さ: 100 ピクセル) 後続の分析用に保存されます。

3. プロファイルの解析パラメーター

1. ImageJ ソフトウェアを開くと開くか、スキャンした画像をインポートします。
2. 画像をクリック 1 つのスライスを選択する下部のスクロール バーをスライド |調整 |しきい値ボタン。ポップアップウインドウのしきい値の骨がよく、背景から分割されていることを確認する手動検査で最小値と最大しきい値を調整し、皮質骨のしきい値と最小しきい値値を記録します。
   注: 異なるマイクロ ct 装置メーカーは、画像の x 線吸収係数を格納するためさまざまなスケール ファクターを使用して、実際のしきい値値が経験的に定められる手動検査または特定のメーカーの次のいずれか推奨事項。我々 の練習で 6,000-7,000 にマイクロ CT 装置で生成された ISQ ファイルの最小しきい値を設定することができます確実に骨背景から分離スキャン。
3. プラグインをクリックして |BoMomics |Trab Param プロファイリングボタン。ポップアップ ウィンドウで代表的なスライスの位置をスライス インデックスを設定し、皮質骨 (「Cort」)、(「範囲」) の範囲と分割パラメーターをプロファイル皮質しきい値セットを計算するための手順 ("") 値を設定します。ステップ 3.2 (図 1) で、皮質骨のしきい値を取得します。ほとんどのマイクロ CT 画像 2,000 と 400 の既定範囲とステップ値。5 例のデータセットにスライス インデックスを設定し、その他の設定の既定値を保持します。
   注:「Cort 骨」は皮質骨のしきい値としきい値の最小値が Cort の値のステップ値の増加に高いしきい値しきい値の最小値からパラメーター プロファイル変更使用するしきい値骨 - 範囲、および最高のしきい値値は Cort 骨 + 範囲です。分析が 5,000、Cort 骨、範囲、およびステップの設定値は、6,000、1,000、500、それぞれ、し、皮質骨の最低しきい値は 6,000-1, 000 = 5, 000、最高のしきい値値は 6、000 + 1, 000 = 7, 000、およびしきい値で使用場合5,500、6,000、7,000 の 6,500、
4. セット ノイズ径 (「ノイズ径」)、ステップ (「ステップ」)、分析と穴径 (「穴径」)、ステップ (「ステップ」)、および穴値のセットを計算するための値の範囲 ("範囲") の騒音値のセットを指定するため (「範囲」) 値の範囲。一般に、既定の設定は、ほとんどのマイクロ CT 骨サンプル、ノイズ、ステップ、および範囲は 5、5、2、それぞれ、穴径、ステップ、および範囲、15、5、2、それぞれの動作します。例のデータセットの既定の設定を維持します。
   注:「騒音 φ」はノイズ抑制フィルターの直径と「押しつけ」は皮質骨内穴の直径。パラメーターのプロファイルに使用ノイズと穴の値を同様に指定したノイズ/穴、範囲、およびステップの値を使用して、上記で説明した皮質のしきい値値として計算できます。画像を取得する際にパラメーターをスキャンの違いノイズと穴のパラメーターに応じて決定してください経験的画質、ノイズと穴のパラメーターの一般的な範囲はすべてのスキャンのために良い。しきい値、ノイズ、または穴の最小値が 0 以上にする必要があります、特定の最低値が 0 に設定、計算の最低値が指定されたパラメーターを使用して負の場合。
5. パラメーターのプロファイリングの実行を[ok]をクリックします。視覚的にパラメーター「ライブプロファイル結果」ウィンドウで領域分割結果を確認し、、スライス レイヤーを選択すると、骨外側境界は非常正確に記載されている (図 1B).その後、選択したスライス レイヤー (表 1) に対応するパラメーター「ライブプロファイル結果テーブルのエントリからプロファイルのパラメーターを取得します。

4. 骨梁解析

1. 海綿骨のセグメンテーション
   1. ImageJ ソフトウェアを起動し、開くかスキャンしたイメージをインポートします。
   2. プラグインをクリックして |BoMomics |Trab セグメンテーションボタンをクリックし、適切な解析パラメーターを入力します。セット「スタート」、「アウトライン境界」、"Trab。5、7,200、7,000、6、12、25 に「皮質厚径」、「穴充填径」、「ノイズ削減 φ」骨"それぞれ。
      注:「スタート」と"End"は海綿骨のセグメンテーションの選択したスライス範囲を指定、「アウトライン境界」は「ノイズ φ」に「ノイズ削減 φ」プロファイリング「Cort 骨」パラメーターに対応します。パラメーター、および「穴充填径」「押しつけ」パラメーターにします。「皮質厚径"外側の皮質骨を除外するため指定した厚さであります。「Trab。"骨は海綿骨 (図 2) を抽出するためのしきい値、手順 3.5 ところでここで前述のプロファイリング解析パラメーター コマンドを使用して、設定が決定されます。
   3. 骨梁の分割を実行する[ok]をクリックします。Trab セグメンテーション結果] ウィンドウ (図 2B) に分割結果を視覚的にチェックします。他のソフトウェアによってさらに解析可能な tiff 形式 (図 2B) でセグメント化された海綿骨ウィンドウに表示される抽出した海綿骨を保存します。
2. 海綿骨の分析。
   1. ImageJ ソフトウェアを起動し、開くかスキャンしたイメージをインポートします。
   2. プラグインをクリックして |BoMomics |Trab 解析ボタンをクリックし、「スタート」など、適切な分析パラメーターを入力「アウトライン境界」、"Trab。記載されているステップ 3.5 として骨"、「ノイズ削減径」、を使用してプロファイリング解析パラメーター コマンド (図 3A) 上で説明した「穴充填径」と「皮質厚径」として設定が決定されます。セット「スタート」、「アウトライン境界」、"Trab。5、7,200、7,000、6、12、25 に「皮質厚径」、「穴充填径」、「ノイズ削減 φ」骨"それぞれ。
      注: プラグインの無料版で指定された「スタート」スライス インデックスから始まる 5 つの隣接するスライスが選択測定、商業上のバージョンの中にスライスの任意の数指定できますユーザーが。
   3. 骨ボリューム (BV)、選択した地域、および厚さの合計ボリューム (テレビ) 測定されるいずれかの二次元測定されるパラメーターは、結果報告のセクションの 1 つまたは複数の選択肢を選択 (2 D) または 3次元(3 D) 3 チェック ボックス、すなわち「BV テレビのみ」、「2 d」と「3 D」を選択可能です。チェック ボックスをオン (図 3表 2) 梁の解析を実行する"OK"をクリックして"2 D"と"3 D"。
      注:「BV テレビのみ」をチェックする場合"2 D"と"3 D"の選択状態に関係なく強度、テレビ、BV の生対策が報告され、セグメント化された海綿骨を抽出して保存、さらに他の分析することができます新しいウィンドウで表示ソフトウェア。「2 d」をチェックすると、BV、テレビ、強さ、およびプレート モデルを使用して各スライス レベルで二次元測定厚さの生対策が報告されます。"3 D"をチェックすると、任意のモデルの前提、BV は、生対策せずに直接各ボクセルの 3次元の厚さを計算各スライス レベルから採取した三次元の厚さ、強度、テレビ報告されます。しかし、チェック ボックスが選択されていない場合、海綿骨は、上記一連のパラメーターを使用して分割されて、測定は報告されません。

5. 模擬オブジェクトの定量化

1. ImageJ ソフトウェアを開き、シミュレーション画像を開きます。ここでは、例として直径 30 ピクセルのシミュレートされた球を開きます。
2. プラグインを選択 |BoMomics |Trab 解析ボタンをクリックし、前述のように、適切な分析パラメーターを入力します。「開始」、「終了」、「アウトライン境界」、"Trab の既定値を保持します。骨"セット「ノイズ削減 φ」、「ノイズ削減 φ」、「穴充填径」と 0 (図 3) に「皮質厚径」。
   注:模擬オブジェクトの意図しないノイズがないと対応する皮質のシェルがあるかもしれません。したがって、このような値のパラメーターを適切に設定する必要があります (既定の設定は 0 に)。3 D 数量の 30 前に、と指定された「スタート」スライス「開始」と「終了」のスライスで指定した範囲内だけのスライスは、プラグインの商業上のバージョンによって分析される中、プラグインの無料版を使用して処理後のスライスします。
3. [結果報告] セクションで、"2 D"と"3 D"パラメーターの測定するを選択し、シミュレートされたオブジェクト (表 3) の骨の解析を実行する[ok]をクリックします。

6. 海綿等データ プレゼンテーションの校正: プロファイルの選択した分析領域の骨対策の分布

1. マイクロ CT ベンダーの指示に従って、スキャンされたデータセットからキャリブレーション情報を取得します。
   注: BV、テレビ、強さ、および厚さの生対策だけは、プラグインによって報告されます。対策を他のソフトウェアによって生成されたレポートに匹敵するため、結果の調整が望まれます。
2. Microsoft Excel、報告された結果テーブルを開きます。骨のボリューム (BV) の校正計算、全ボリューム (テレビ)、骨ミネラル含量 (BMC)、骨体積比 (BV/テレビ) と骨密度 (BMD) の新しい次の式によると報告された生 BV、テレビ、および強度値を使用して列をエクセルします。
3. 注: はスキャン、スキャンしたマイクロ CT 画像やメタタグなどのファイルから Scanco ISQ ファイル解像度 (解像度、μ m)、灰色拡張 (スケール)、密度の単位 (mg HA/cm³)、密度勾配 (傾き)、および密度の交点 (切片) を抽出することができます。したがって、調整措置は次のように計算されます。
   強度、テレビ BV は、BV_c生対策とテレビ_cは、校正値、解像度、スケーリング、傾斜、インターセプトはイメージ マイクロ CT の校正ファイルからです。
   BV_c = BV × 解像度³ [μ m³]
   テレビ_c = テレビ × 解像度³ [μ m³]
   BV/テレビ = BV ÷ テレビ
   BMC = (強度 ÷ × スロープ - BV × インターセプトをスケーリング) × 解像度³ × 10^-12 [mg HA】
   BMD - BMC ÷ テレビ_c × 10¹² [mg HA/cm³]
4. Microsoft Excel ソフトウェア (図 4) を使用してスライスのレイヤー (X) に対して調整措置 (Y) の散布 (散布) プロットを作成します。

骨梁の解析プラグインは自動的にセグメント化し、精度と海綿骨を定量化する設計されています。当初、骨の外側の境界が検出され、線引き後に穴充填操作骨外側皮質シェル内の任意の穴が満ちています。その後、外側の皮質骨を除外し、セグメント化された海綿骨を得る侵食操作を実行します。最後に、海綿骨部のセグメント化された地域の対策は明らかにした.

マイクロ CT 画像は本質的にノイズの多い、区切りよく定義済みの任意のパラメーターを使用して正確に骨の外側の境界を識別するために失敗します。満足のいくセグメンテーション パラメーターを選択するためのパラメーターの組み合わせの多くをしようとする退屈な労働集約的です。骨群のパラメーターの共通セットを選択することを容易にも十分なパラメーターの組み合わせを選択する際に支援するために自動的に設定の範囲で 1 つずつパラメーターを変更するためのプラグインをプロファイリング パラメーターを指定するため、サンプル。図 1A良い分割パラメーターをプロファイルに使用設定を示しています。皮質骨のしきい値 (Cort 骨) がしきい値の範囲のパラメーター プロファイル (範囲) と各ステップでのしきい値 (ステップ) の増分量を指定、プロファイルするしきい値のシリーズが生成されます。その後、一連の音と穴の値は、対応するパラメーターを設定することにより同様に生成されます。最後に、海綿骨はすべての可能なパラメーターの組み合わせに対して一度に 1 つのパラメーターを変更することによって分割されます。図 1Bは、別のパラメーターの組み合わせの代表的な結果を示しています。明らかに、いくつかのパラメーターの組み合わせは、骨の外側の境界の輪郭を描くで他より優れている、1 つ以上のパラメーターの組み合わせが良好な領域分割結果を示しています。領域分割結果を視覚的にチェックした後、プロファイリング結果表 (表 1) から満足のいく区切りのパラメーター値を取得できます。

海綿骨の措置を定量化するには、海綿セグメンテーションと分析が実行されます。図 2Aスライスごとで選択した領域の骨が分割し、(図 2B) を抽出し、パラメーターを指定して領域分割結果をチェックできる海綿セグメンテーション用設定ダイアログが表示されます視覚的に。その後、海綿骨は十分なパラメーター (図 3A) を分析します。レポートのオプション、骨のボリューム (BV) の生数量の選択状態に応じてボリューム (テレビ)、グレー値 (強度) の合計を合計し、厚さ測定、2 次元または 3 次元 (表 2) が報告されます。最後に、校正情報はスキャンしたマイクロ CT データセットから抽出され BV、テレビ、BMC、BV/テレビの措置を校正、骨密度計算、選択した分析地域によって層の層に対しての分布をプロファイリングによって続いて位置 (図 4)。

プラグインの品質管理機能として模擬オブジェクトの定量化がサポートされています。既知寸法をシミュレートされた標準的なオブジェクトは、理論値またはマイクロ CT 装置または BoneJ14、無料のオープン ソースのプラグインに付属している商用ソフトウェアなど、ほかのソフトウェアからの対策との比較のためのプラグインにより定量化されています骨画像解析。シミュレーション画像は、ノイズのない高画質とみなされます模擬オブジェクトを分析するためノイズの設定はゼロに設定されます。厚さの異なるオブジェクトはシミュレートされたし、した結果 (図 3表 3)。円、正方形、長方形などのシミュレートされた標準 2D オブジェクトの領域 (テレビまたは BV) の値の正確な厚さが報告される (表 3)。3 D オブジェクトは、キューブ、球体、直方体に正確な厚さ測定を報告、しかし、シリンダーの厚みないシリンダーの両端、近くボクセルの正確な一方、シリンダーの中のスライスのボクセルの厚さは正確予測しました。これは、厚さ測定、基になるアルゴリズム、最大の球の直径または最大のキューブこのボクセルが含まれています、完全に内側の側面の長さによって各オブジェクトのボクセルの厚さを決定する前記の機能、オブジェクト。したがって、オブジェクトの厚さ別の球から成って、両端から中央のスライスの半径距離でシリンダーが正確に測定のみが可能、キューブを正確に測定することができます。

図 1: プロファイリング分析パラメーターの代表の結果。(A) パラメーターの設定ページします。(B) プロファイリング分析パラメーターの代表的な結果。いくつかのパラメーターの組み合わせは、骨の外側の境界を検出するため他のものより優れています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 海綿セグメンテーション分析代表結果。(A) パラメーターの設定ページします。(B) 代表的なセグメンテーション結果さまざまなレイヤーで海綿骨の。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 梁解析します。(A) パラメーターの設定ページします。(B) シミュレーション 2D オブジェクトの代表的な結果。(C) 3 D ボリューム ビューアーで可視化したシミュレートされた 3 D オブジェクトの代表的な結果。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 選択した分析領域における骨対策の分布.水平軸は、解析領域の開始のスライス層に相対距離を表します。Y 軸の値は、解析領域の調整海綿措置です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: プロファイリング分析パラメーターの代表的な結果。

表 2: 海綿分析の代表的な結果。

表 3: 数量は、シミュレートされたオブジェクトを結果します。

の補足ファイル 1。骨をサンプルします。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

オブジェクトの厚さの定量化の基になるアルゴリズムの特許が提出されています。著者と共同で他の人は bomomics.com ウェブサイトのコンサルティングと定量化画像解析サービスをリクエストに応じて提供する、無料版プラグインをホスティングを登録します。