方法論記事

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

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DOI：

10.3791/57191

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2018年2月6日

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1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

最小の侵入と生きたマウス肝臓の二光子励起イメージングのための新しい外科プロトコルを設立しました。この手法は、リポポリサッカライド誘起ブタエンドトキシン肝臓の微細構造を確認できた。肝の白血球の遊走に各種の試薬処理の有効性を決定するこのメソッドが利用されることを期待しています。

要約

敗血症は組織と臓器障害を引き起こす可能性が重度の感染症の種類の損傷。敗血症に関連する死亡率および罹患率率が非常に高く、ない直接の治療または臓器関連のメカニズムをリアルタイムで詳細に調べた。肝臓は毒素と人間の体内で感染症を管理する主要臓器であります。ここで、肝被膜マクロファージ (LCMs) 好中球などの免疫細胞の運動性を追跡するためにエンドトキシンの誘導後マウス肝臓の生体イメージングを実行する目的とします。したがって、露出低侵襲手術と肝臓の手術法を考案しました。リポ多糖 (LPS)、一般的なエンドトキシンを腹腔内に注入したマウス。露出と LPS 投与する LysM 緑の蛍光蛋白質 (GFP) でマウスの肝臓、その好中球がわかった募集の生体イメージングのための外科的手法を使用してマウスの肝臓はリン酸バッファーのそれと比べると増加しました。生理食塩液投与の肝。LPS 処理後の好中球数は時間と大幅に増加。また、CX3Cr1 GFP マウスを使用して、我々 は正常に、LCMs と呼ばれる肝マクロファージを可視化。したがって、生体内で免疫の移動を制御する新しい試薬の有効性を調べるためには、運動性および肝臓における好中球および LCMs の形態を決定することができによる臓器障害や組織損傷の治療の効果を識別するために敗血症における白血球の活性化。

概要

肝臓は、哺乳類の主要な代謝器官それはエネルギー、ホルモンおよび解毒1の司令塔として機能します。その重要性のため研究者は炎症時に肝臓の変化を明らかにする多くの in vitroとin vivoの実験を行った。肝2からのライブ画像をキャプチャする生体顕微鏡を使用されています。確かに、イメージングの方法をされている様々 な肝臓は2,3,4,5,6を導入しました。しかしより簡易な外科的アプローチを開発、標的臓器や免疫細胞の安定化を達成するために、我々 は生体イメージングのための彼らの努力を最小限に抑えるための研究者を導くことができる単純なプロトコルを設計しました。

本研究では、安定的かつ新規イメージング室と出血や可能な限りの感染を最小限に抑えるために使用できる手術手技を紹介しました。肝臓は 2 時間以上そのまま残ったことを確かめた。この方法では、我々 は正常に LCMs7と敗血症性条件下における好中球の形態を識別されます。以来、このメソッドは、手術中に震えていると予期せぬ炎症など物理的・生物的交絡要因を最小化、このメソッドを使用して応答で肝臓の免疫細胞の急性反応を観察することができると見込んでください。試薬には、LP が好きです。

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プロトコル

すべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会の延世大学医科大学、韓国のガイドラインにしたがって運営しました。LysM 緑の蛍光蛋白質 (GFP; gfp/+) マウス8と CX3Cr1 GFP (gfp/+) 生体イメージングのための 8-12 週齢9マウスが使用されました。すべての手術器具はオートクレーブと 70% アルコールで消毒.

1. カスタム設計されたマウス肝イメージング ツールのサポート室

  1. マウス肝イメージング室の設計
    1. (図 1) をイメージング マウス肝臓の次のサイズの部屋を作る: 内側のチャンバー (120 mm 長さ × 幅 160 mm × 30 mm 高さ)、外側室内 (100 mm 長さ × 幅 100 mm × 24 mm)、ボルト (Ф 3 × 30 mm 高さ)、ナット (Ф 4 mm)、と翼形ナット (Ф 4 mm)。
    2. 硬化エージェントとエラストマーの比が 1:9 の基本とのシリコーンの 120 g の合計を測定します。
    3. 液状シリコーン混合物を 250 mL の三角フラスコに入れて、よく混ぜてね。フラスコを乾燥器に入れて、ポンプを真空下で約 1 時間の空気の泡を削除します。
    4. カスタム設計されたマウスの商工会議所の高さ 10 mm ほどに液状シリコーン ミックスを注ぐそれをさせ (図 1 a) の日のカップルのための治療法。
  2. カバー スライドとベッドを固定レバーの準備
    1. 金属製のフレームでは、シリコーン接着剤を使用してガラスを添付します。1 日 (図 1 b) で乾燥させます。
    2. 水浸漬レンズ用蒸留水を効果的に保持するために半永久的な水ブロック構造が不可欠です。1 mm のシリコーン接着剤を丸めを行い、一晩それを強化します。
    3. 硬化剤とエラストマー ベースのミックスし、それを注ぐ高さの約 8-10 mm。 実行 6 ウェル プレートに硬化プロセス 1.1.2-1.1.4 で説明したよう。

2. 組合の準備

  1. 1 × リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 性腸炎サルモネラ血清型から LPS 粉末を希釈するための準備します。(1 × PBS: 137 mM 2.7 mM KCl 塩化ナトリウム 10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4)。
  2. 37 ° c の水浴の PBS を予熱して慎重に LPS 粉ボトル (25 mg) を開きます。
  3. ピペットで移しなさい援助を使用して、滅菌 PBS (5 mL) を注ぎ LPS パウダー ボトルと優しくかき混ぜるまたは在庫ソリューションを準備するソリューションを中断します。
    注: LPS 粉末を液状、過酷なボルテックス泡が発生できます。1.5 mL チューブの因数を作るときに損失を最小限にするために泡を避けます。
  4. − 20 ° C、LPS 原液を格納し、注射用 1 mg/mL 組合ソリューションに希釈します。
  5. 1 mg/mL の LPS 溶液 (20 mg/kg) を 1 mL の注射器を使用して非麻酔下マウスの腹膜に注入します。対照動物の PBS の同じボリュームを挿入します。
  6. 十分な炎症性応答を 2 時間待つ。

3. 血管を染色するテキサス赤デキストランの準備

  1. 2 つの 15 mL の円錐管と滅菌 PBS の 10 mL を準備します。
  2. テキサス赤デキストラン粉 (25 mg) 3 mL の PBS を希釈し、よく混ぜます。空 15 mL の円錐管に混合物を転送します。
  3. デキストランの混合物 (3 mL) を含む 15 mL の円錐管に残り PBS (7 mL) を転送します。
  4. 0.45 μ m のシリンジ フィルターを 10 mL の注射器の先端に接続します。シリンジ フィルターが針を置き換える必要があります。
  5. デキストランの混合物 (10 mL) をフィルター処理します。こぼれることを避けるために均等に押し、注射器。
  6. 光ブロック 1.5 mL チューブにデキストラン溶液 2.5 mg の 500 μ L を分注、− 20 ° C で保存解凍後、4 ° C で保存します。

4. 手術のプロセス

  1. 手術テーブルと、手術前に 70% アルコールを使用してすべての機器を消毒します。肝切除のためのツールを設定し、37 ° c (図 2 a、 B) 加熱プレートを調整します。
  2. 麻酔、腹腔チレタミン/チレタミンの 30 mg/kg とキシラジンの 10 mg/kg、マウスを注入します。これらのソリューションは、混合し、同時射出のため PBS で希釈できます。マウスのつま先を軽く押す anesthetization を確認します。 反射がない場合次の手順に進みます。
  3. マウスの網膜の乾燥を防ぐために眼軟膏の少量を適用します。
  4. 脱毛クリーム (図 2) を使用して腹部周辺の体毛を削除します。
  5. 尾静脈またはインスリン注射器 (図 2 D) を使用してレトロな軌道注入を介してテキサス赤デキストラン溶液 (2.5 mg/mL の濃度) の 200 μ L を注入します。
  6. マーカーで右弓下の領域をマークします。剣状突起から肋骨の終わりに線描する必要があります。鉗子、はさみ (図 2 e, F) で表皮をカットします。
  7. マイクロ剪刀、鉗子を用いた腹腔内を開き、慎重に肝臓を公開します。左葉外側綿棒 (図 2, H) を使用して展開する必要があります。
  8. 肝臓の乾燥を防ぐために腹腔内に 500 μ L の滅菌 PBS を注ぐ。
  9. カスタム設計されたチャンバーで右側臥位でマウスを置き、シリコン ベッドに組織接着剤の少量を適用します。その後、綿棒 (図 2 i) を用いた肝慎重に取り付けます。
    メモ: 肝臓の組織は非常にもろい、機械的に引っ張らないで、肝を。優しく、綿棒でそれをロールアウトします。
  10. 数秒後は、500 μ L の肝臓から乾燥を防ぐため滅菌 PBS で再び肝臓を濡れています。肝臓に金属製のフレームを置き、ナット (図 2 j) でしっかりと固定します。

5 2 光子顕微鏡を用いた肝臓の生体イメージング

  1. 880 nm、緑、セットし禅ソフトウェア (カールツァイス) レーザーをオンに、波長を設定するを実行し、赤のチャンネル。蛍光強度 (図 3 a) によるとレーザー パワーを調整します。排出フィルター情報のとおりです: グリーン/Alexa488、500-550 nm、赤/Alexa 555、575 610 nm。
  2. イメージングの段階でチャンバーを配置し、水浸対物レンズ カバー ガラスに近い X 20 を配置します。
  3. その体温 (図 3 b) を維持するためにマウスの体の下でシリコン ラバー ヒーターを修正します。
  4. 金属製のフレームに 500 μ L の蒸留水をドロップ、肝臓 (図 3) に近い対物レンズを引き出します。
  5. イメージングの領域の深さを調べるし、フォーカスを調整します。
  6. イメージングを実施します。
  7. 長期用チレタミン/チレタミンとキシラジンの混合物の半分線量イメージング中にそれぞれの時間を挿入します。この段階で、37 ° C でマウスの体温を維持することが不可欠です。常に目にマウスに anesthetization 時間とすべてのマウスは異なりますので。
    注: このメソッドは手術とイメージング後回復に適していません。我々 は倫理的手術後すぐにマウスを犠牲します。
  8. 安定した anesthetization の 30 分毎のペダルの反射神経をチェックします。

6. データの分析

  1. データ分析ソフトウェア Volocity を開き、ソフトウェアにライブラリ内の生データをインポートします。
  2. 状況に合わせて、スナップショット画像からノイズを除去します。
    注: 滑らかな画像を得るためには、'罰金または '中央' のフィルターを使用します。さらに、暗いまたはぼやけた画像を明確にするのに 'コントラスト強調' 機能を使用します。
  3. スナップショット画像を JPEG または TIFF ファイルと AVI ファイルの映画の 100%、輸出に編集した項目に適合します。

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結果

シンプルで非常に安定した画像処理室が考案されました。チャンバーの下部は、マウス本体と臓器のすべりを防止するシリコンで覆われていた。また、シリコンは弾力性の適切な量があるのでそれはカバーのスライド (図 1 a, C) の圧力による損傷が予想されるを防ぐことができます。第二に、組織の安全な接着剤 (ボンド獣医) は、シリコーンの円形のベッドの上で抽出した肝臓を修正するために適用されました。このメソッドには、心拍や呼吸運動によって引き起こされる震えているを避けるために私たちが有効になります。最後に、金属カバー スライドは配置され固定ボルトとナット、マウスの体サイズと突出レバー (図 1 b-D) の位置に基づきます。麻酔が正しく実行されたときこれらのイメージング設定 6 h 以上最後の可能性があります。

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ディスカッション

肝臓は多くのグループ3,10, その機能の重要性のために積極的に研究されています。例えば、ヘイマンらは agarose を使用して繊細な手法を提案します。ただし、このメソッドは、高精度なことが判明した、アガロースの設定時間がかかります。ただし、私たちの方法論ですべての手順が実施される他の交絡因子を最小限に抑え、30 分以内。ハートビートは、ビデオを乱すことがので第二に、肝臓を安定化非常に重要です。この現象を避けるためには、マウスを右側臥位に再配置されます。

このプロトコルでもう一つの重要なステップは、金属製のカバー フレームと金属製のバー上でその場所の生産だった。私たちが直面した最も重要な障害だった肝固定圧力の適切な量を使用してに応じて肝壊を克服する方法を決定します。当初、蝶ナットのみがカバー スライドを保持するために適用されたとき血液の循環が低下して、肝臓がカバー スライドの重量に耐えることができませんでした。代わりに、バーに沿ってカバー スライドを配置する前にボ...

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開示事項

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

謝辞

この研究助成金から国立研究財団の韓国 (NRF) (Y m グラント号 2016R1A2B4008199 MSIP。 韓国政府によって資金を供給されるによって支えられましたH.) 厚生省と韓国の福祉 (許可番号: HI14C1324)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
カスタムデザインチャンバーライブセルインスツルメンツカスタムデザインサイズ
メタルカバースライドライブセルインスツルメンツカスタムデザインサイズ
カバーガラス電子顕微鏡科学#72204-03
シルガード 184 シリコーンエラストマーキットダウ コーニング
三角フラスコDURAN21 216 36
細胞培養プレート(フラットタイプ)HYUNDAI Micro Co.H31006
デシケーターADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LAB半永久的なダムを作るには
フレキシブル シリコーン ゴム ヒーターオメガSRFR/SRFG シリーズ、M1250/0800
DC 電源東洋工大DP30-03A
リン酸緩衝生理食塩水自家製
サルモネラ菌由来のリポ多糖類(LPS) 血清型腸炎Sigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL 高透明度ポリプロピレン
円錐管		FALCON14-959-49B
0.45 μmフィルター (Minisart シリンジフィルター)ザルトリウス16555k
1.5ml マイクロチューブ 琥珀色アクシゲンMCT-150-X遮光用
1mLシリンジ韓国ワクチンKV-S01
3mLシリンジ韓国ワクチンKV-S03
10mLシリン韓国ワクチンKV-S10
0.3mLインスリンシリンジベクトン・ディキンソン324900
脱毛クリーム 100 mLボディ ナチュア
綿棒ABDI
ゾレチル 50 5 mLヴィルバック
ロンプン 10 mLバイエル
ヒーティング プレートライブ セル インスツルメンツPH-S-10カスタムデザイン
サイズ DC コントローラーライブ セル インスツルメンツCU-301
マイクロデスセクションはさみハーバード装置72-5418
さRobozRS-5882
鉗子RobozRS-5137
医結合3M1469SB
ZENソフトウェア(ブラックエディション)カールツァイLSM用プログラム7 MP
LSM 7 MPカールツァイス
VolocityPerkinElmer分析プログラム
ジ はみ獣ス

参考文献

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
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  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303(2015).
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