固定、パラフィン包埋、および微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面技法について述べる。作製した試料では、顕微鏡によるバイオ フィルムの基礎部分やレポーターの発現パターンを視覚化できます。
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この記事について
サマリー
要約
真核生物において広く確立された技術は、パラフィン包埋による区分します。ここでの埋め込み・灌流のパラフィン ワックスを使用してそのまま微生物コロニー バイオ フィルムの断面、固定法を実施します。コロニー バイオ フィルムで使用するためこのメソッドを適応し、我々 はその成長基板の各サンプルを維持すると、寒天オーバーレイヤーのラミネート技術を開発し、固定液にリジンを追加しました。これらの最適化は、微細形態機能のサンプルの保存/保護を向上させます。この方法で作製した試料は、薄膜の断面と光、蛍光、および透過電子顕微鏡によるイメージングに適しています。緑膿菌 synxantha 菌、枯草菌、コレラ菌のコロニー バイオ フィルムにこの手法を用いています。ディテールはこのメソッドによって生成されるサンプルでの高レベル レポーターひずみと組み合わせて工学または特定の染料の使用は生理学と微生物の開発にエキサイティングな洞察力を提供することができます。
概要
ほとんど微生物バイオ フィルム フォームする能力があります、セルのコミュニティは、セルフ プロデュースの行列で一緒に開催。バイオ フィルムは、栄養素と基板の提供の様々 な体制で物理的なセットアップの多くの種類で栽培できます。再現可能な多細胞構造を生成する傾向がある特定のアッセイのバイオ フィルム形成とコミュニティまたは巨視的レベルで系統発生的に多様な種のための一般的なアーキテクチャが観察されます。微生物は雰囲気下で固体媒体の植民地で栽培される、肉眼形態はマトリックス生産能力についての情報を伝えるし、他の特徴1,2,3とよく相関します。微生物コロニーの内部アーキテクチャは、バイオ フィルムに固有の化学および生理学に関する手がかりを提供することもが特徴付けることは困難されています。細菌のコロニーに cryoembedding、セクショニングの技術の最近のアプリケーションは、画像と前例のない解像度4,5,6で特定の機能の可視化に有効にしています。しかし、動物組織を用いた研究は、パラフィン包埋 cryoembedding 7
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プロトコル
1. 緑膿菌コロニー バイオ フィルムの成長
- 中二層プレートの準備
- トリプトン 10 g/L、寒天 10 g/L を準備脱イオン水 (材料の表を参照) ソリューション。
- 水浴中で 20 分 50-60 ° C に涼しいオートクレーブ。
- トリプトン寒天培地溶液 45 mL を注ぎ 100 mm × 100 mm 角皿 (材料の表を参照してください) 50 mL コニカル チューブを使用します。寒天を固めるための許可 (20 ~ 30 分)。最初の層の上に 2 番目、15 mL の層を注ぐ。一晩固化させるは、糸くずのティッシュで拭くことによって必要に応じて蓋から結露を除去します。
- バイオ フィルムのコロニー スポッティング
- LB 寒天培地プレート13に冷凍庫株から関心の系統を連勝し、37 ° C、80-100% の相対湿度で 12-16 時間暗闇の中で孵化させなさい。
- 各ひずみまたは複製、LB の 2 mL を接種して 250 rpm で振とうしながら 37 ° C で 12-16 h のため暗闇の中でインキュベートする単一コロニーを使用します。
- 新鮮な LB と 250 rpm で振とうしながら 37 ° C で 2.5-3 時間暗闇の....
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結果
このメソッドは、明瞭な形態学的特徴と遺伝子発現のゾーンを DIC、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡によって視覚化される前記バイオ フィルム薄いセクションを生成します。油浸対物レンズ × 40 を使用して DIC イメージングは、いくつかの形態学的特徴 (図 2 e) を表示するのに十分なことができますが、我々 はその蛍光を発見した恒常エクスプレス蛍光蛋白質に設計された系統の顕微鏡は、強化されたを提供しますサンプル (図 2 D) 内の細胞分布の可視化(図 2 b) 全体の植民地の断面を生成し、巨視的レベル (比較で全体の形態内の構造の特徴のローカリゼーションのためのコンテキストを提供する、個々 のセクションの画像を一緒にステッチすることができます。図 2 a、B、および C)。形態学的特徴と蛍光シグナルは、イメー.......
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ディスカッション
パラフィン包埋、薄切片組織サンプルは微細形態構造のイメージングを有効にし、一般に真核生物の組織、使用、微生物サンプル8 にいくつかの成功と適用されている古典的な組織学的手法 ,9。Cryoembedding 内因性および蛍光信号の強力な保持できますが、パラフィン包埋は一般に望ましい形態16のより良い保全を提供します。この微生物バイオ フィルムへの応用法を適応で、私たちのシステムに固有の特性に着目。細胞と組織のマトリックス頻繁に開かれる一緒に比較的頑健、バイオ フィルムより繊細な; する傾向がある中我々 したがって、ルーチン固定とワックスのサンプル保持を最大限にプロトコルを埋め込むことに最適化されています。その成長の基質のサンプルを維持してすぐに固定する前に寒天培地にコロニーを重ねることは、サンプルが上端または基部から失われないことを保証します。ただし、余分なケアは、このステップの間にしなければならないので、高温で寒天をコロニーに重ねることと、コロニーが損傷することが。
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、NSF のキャリア賞を受賞 1553023 と NIH/NIAID 賞 R01AI103369 によって支持されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5 3/4 "パスツールピペット | フィッシャーサイエンティフィック | 13-678-6A | 大学のバイオストアから購入 |
| 寒天 | テクノバ | A7777 | |
| ブフナーアスピレーター(真空)フラスコ | Pyrex | 5340 | 大学のバイオストアから購入 |
| 耐薬品性マーキングペン | VWR | 103051-182 | メーカー:ライカ |
| クリア フィンガー ネイル ポリッシュ | 店は | ||
| コンゴレッドインジケーターグレード | VWR | AAAB24310-14 | メーカー:Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | メーカー:EMD Millipore |
| TRISバッファ実装媒体(DAPI付き) | Fisher Scientific | 50 247 04 | メーカー: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | 3Dプリントされた社内 | ||
| 埋め込み型(商用) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| エタノール 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | 大学バイオストアから購入 |
| 細い先端のブラシ | 店が買った、ペイントブラシ | ||
| ガラスカバースリップ60x22mm | フィッシャーサイエンティフィック | 12-519-21C | |
| ガラス再水和メーラー | テッドペラ | 21043 | 20スライドメーラー |
| Histoclear-II、オレンジ油ベースの清澄剤 | フィッシャーサイエンティフィック | 50 899 90150 | メーカー:国立診断 |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-リジン塩酸塩 | フィッシャーサイエンティフィック | BP386 100 | |
| ロープロファイルミクロトームブレードフィ | ッシャーサイエンティフィック | 22 210 048 | メーカー:スターキー |
| マイクロピペット | VWR | 89080-004 | プロモーションパック |
| マイクロピペットのヒント | コメントセクション | セクション | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| ミクロトーム | フィッシャーサイエンティフィック | 905200U / 00016050 | モデル:HM355S、メーカー:マイクロム、カタログなし、ベンダーカタログ#905200U / 00016050 |
| ホルムアルデヒド、37%水性(ホルマリン) | リッカケミカル | RSOF0010-500A | |
| パラプラストエクストラ(パラフィンワックス) | VWR | 15159-486 | メーカー:マコーミックサイエンティフィック |
| ペトリ皿スクエア100x100x15mm | 実験室使い捨て製品 | D210-16 | |
| 塩化カリウム | EMDケミカルズ | PX1405-1 | リン酸緩衝生理食塩水の成分、社内で調製 |
| リン酸カリウム | フィッシャーサイエンティフィック | P380-500 | 酸塩緩衝生理食塩水の成分、社内で調製 |
| カミソリの刃 | VWR | 55411-050 | 大学のバイオストアから購入 |
| スライドウォーマー | フィッシャーサイエンティフィック | NC0865259 | 非カタログ、ベンダーカタログ#12857D |
| 塩化ナトリウム | VWR | 0241-1KG | リン酸緩衝生理食塩水の成分、社内で調製 |
| リン酸ナトリウム | VWR | BDH9296.500 | 、リン酸緩衝生理食塩水の成分、社内で調製 |
| 超凍土組織学スライド | フィッシャーサイエンティフィック | 12-544-2 | |
| 組織浮選ウォーターバス | フィッシャーサイエンティフィック | NC0815797 | メーカー:テッドペラ、ベンダーカタログ#28156-B |
| 自動ティッシュプロセッサ | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | モデル: STP120 ティッシュプロセッサー |
| トリプトン | テクノバ | T9012 | |
| 酵母エキス | テクノバ | 9010 |
参考文献
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035(2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.
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再版と許可
