衛星細胞の正確な同定は様々 な生理学的、病理学的条件の下でその機能を研究するために不可欠です。この記事では、蛍光抗体法による染色による大人の骨格筋のセクションの衛星細胞を識別するためにプロトコルを示します。
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方法論記事
Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
蛍光抗体法は、異なる細胞ティッシュ セクションの種類を識別するため効果的な方法です。目的のセル人口を研究するために特定のセル マーカーの抗体はティッシュ セクションに適用されます。大人の骨格筋衛星細胞 (SCs)、筋肉の修復と再生に貢献する幹細胞です。したがって、視覚化し、異なる生理学的な条件の下で衛星細胞集団を追跡することが重要です。安静時骨格筋の SCs は基底膜と筋線維膜の間に存在します。筋線維、細胞培養、SCs を識別するために一般的に使用されるマーカーは、ペアになっているボックス タンパク質 Pax7 です。この記事では、非特定の染色と背景を最小限に抑える骨格筋のセクションに最適化された Pax7 蛍光プロトコルが表示されます。基底膜のタンパク質 (ラミニン) を認識する別の抗体はまた SCs 同じようなプロトコルを識別するのに役立つダブルまたはトリプル Pax7 興味の他の蛋白質のための抗体とラベル付けを実行するも使用ことができますを追加しました。
概要
骨格筋は多核巨細胞の筋肉細胞から成るであると呼ばれる、力および収縮運動を生成する筋線維で構成されています。いくつかの顔面の筋肉を除いて、最も骨格筋は、体節1と呼ばれる一時的な萌芽期の構造から派生します。筋芽細胞になる上皮体節から筋前駆細胞が剥離されます。さらに筋芽細胞は多核筋線維を形成する細胞になる融合細胞に分化します。上記のプロセス筋形成と遺伝子発現の制御を一時的に規制されているが特徴です。筋原性前駆体は筋芽細胞表現 MyoD および/または Myf5 と心筋細胞表現する myogenin とミオシンの2,3に対し Pax3 と Pax7 を表現します。筋肉の成長は、既存のファイバー (過形成) により筋核を組み込むことによって、筋線維 (肥大) のサイズ4の増加によってに筋線維が大きくなるプロセスです。筋肉の成長の間に、彼らは区別し、自己更新できる幹細胞プロパティを持つ筋細胞の持続可能なソースです。これらの細胞は筋鞘 (筋線維の細胞膜) と基底膜5の間の物理的な場所に基づく衛星細胞と呼ばれます。SCs は、精力的に幼若期 (生後マウスの最初の 2-3 週間) 筋肉の成長に貢献するが、大人の筋6を安静時の休止状態になります。....
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プロトコル
このプロトコルではアダルト マウス (2-6 ヶ月)、脛骨前方 (TA) と長趾伸筋 (EDL) の前後肢の筋肉は、SCs の染色蛍光を実行する例として用いられました。マウスおよび筋肉の処理手順をすべて組織解剖は、動物の世話、NIAMS/NIH の使用委員会 (ACUC) によって承認されています。
1. マウスの後肢から TA/EDL 筋を解剖します。
- NIH の ACUC のガイドラインの下で CO2充填安楽死室でマウスを安楽死させます。必要な場合は、頚部転位を実行します。
- マウスの顔アップを郭清パッド (仰臥位) に置きます。その腹の皮の上に 70% エタノールをスプレーします。マウスの腹皮の中央に水平方向に開く 1 ~ 2 cm をカットし、マウス フィートに向かって開口部を引っ張って、マウスを deskin します。マウスの後肢の片側を公開します。
- 2 つのシャープな鉗子を使用: TA/EDL を付ける、足首の腱を保持するために 1 つを使用し、破るし、TA/EDL を覆う筋膜をせん断する他の 1 つを使用します。筋膜を剥離鉗子の先端の鋭利な TA/EDL 筋の下にあるヒントを実行して、脛骨骨から TA/EDL をデタッチするのに使用します。
- まだそれらを生検鉗子で保持しながら足首の腱をハサミでカットします。足首から膝までの TA/EDL の縦の線に沿ってハサミ鉗子....
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結果
上記の手順に従って、SCs は、蛍光顕微鏡 (図 1) 成人の安静時筋セクションで正常に視覚化できます。大人の筋組織は強い自己蛍光が繊維の特定のタイプで、明るいアレクサ シリーズ染料がバック グラウンド ノイズを克服できるし、際立っている信号 (図 1 a, B; 矢印)。二光子励起共焦点顕微鏡は、広視野蛍光顕微鏡 (図 1 a) よりも比較的クリーンなイメージ (図 1 b) をキャプチャします。同じプロトコルはまた少年マウス (図 2 a)、マウス胚 (図 2 b) の筋肉組織で十分に働きました、大人の筋組織 (図 3) .......
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ディスカッション
上記のプロトコルは、ゼブラフィッシュ骨格筋12Pax7/MF20 染色法に基づいていた。ソリューションの使用手順をブロックが同じまたは類似しました。使用抗体は同一です。調整手順は、マウスの筋肉組織と SCs の機能に基づいていた。まず、ラミニン抗体は、視覚化し、SCs の位置を確認するためにミックスに追加されました。それは 488/555; のデュアル フィルター キューブを使用して顕微鏡下で Sc の数をカウントする特に有用だったこれは、騒々しいされる背景から目立つように SC 派生 Pax7 信号を大幅に強化。第二に、使用 Pax7 抗体はマウス抗体なので、マウス igg 抗体の非特異的結合から生じる背景を減らすためにマウスでブロック ステップ (ステップ 5.3) を追加しました。第三に、抗原検索ステップ (ステップ 5.2) は固定ティッシュ PFA Pax7 抗体の汚損のために批判的であった。
(子犬と胚) 若いマウスの筋肉組織で使用された同じプロトコル (図 2).......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
NIAMS 光イメージング セクション顕微鏡と技術的なサポートを提供するために感謝いたします。MF20 Pax7 抗体は、発育の後援の下で開発され、アイオワの大学、生物科学専攻、アイオワ シティで維持発達研究ハイブリドーマの銀行から得られました。この作品は、国立衛生研究所の NIAMS の学内研究プログラムによって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| メチルブタン | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| 最適切断温度 (O.C.T.) 化合物 | 電子顕微鏡 Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | サーモフィッシャー | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab フラグメント ヤギ抗マウス IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (superkinant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (superkitant) | Developmental Study ハイブリドーマBank | N/A | |
| ヤギ抗マウスIgG1交差吸収二次抗体, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| ヤギ抗マウスIgG2b交差吸収二次抗体, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| ヤギ抗ウサギIgG(H+L) 高交差吸着二次抗体, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| ライカCM1860 クライオスタット | |||
| ライカDM6000広視野蛍光顕微鏡 | |||
| ライカDMR広視野蛍光顕微鏡 | |||
| ツァイスLSM510共焦点顕微鏡 | |||
| ツァイスLSM780共焦点顕微鏡 | |||
| クイジナート電子圧力鍋 |
参考文献
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell D....
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再版と許可
