耐久性のある遺伝子発現により一般的な頚動脈移植に頸静脈の家兎モデル

サマリー

このメソッドでは、ウサギの介在静脈グラフトの配置、移植の伝達と遺伝子発現の耐久性の達成をについて説明します。これは遺伝子とグラフト静脈でタンパク質製品の生理学的および病理学的役割と静脈グラフト病に対する遺伝子治療のテストの調査をことができます。

要約

静脈グラフト バイパス手術は、閉塞性動脈疾患の一般的な治療法ただし、長期的な成功は、血栓症、肥厚、動脈硬化など血管障害によって制限されます。この記事の目標は、ウサギの二国間静脈移植を配置し、遺伝子発現の耐久性を実現する遺伝子の転送ベクトルと移植を伝達する方法を示すことです。メソッドは、通常静脈グラフトの恒常性の遺伝子とその蛋白質製品の生物学的役割の調査をことができます。例えば静脈グラフト障害を防ぐことができる活動のための遺伝子のテストを実行できます、transgene の式に新生内膜増殖を防ぐかどうかは、血管の炎症を軽減メソッドまたは家兎動脈硬化を軽減供給。高脂肪食。初期生残手術中に右と左の外頚静脈のセグメントは摘出、逆側の端に一般的な頚動脈移植として両側に配置されます。28 日後を実行、2 番目の生存手術中にグラフトのそれぞれは血管クリップで循環から隔離され、ルーメンがヘルパー依存 (HDAd) アデノウイルスベクターを含むソリューション (すなわち) 経由で満ちています。20 分インキュベーション後ベクトル ソリューションを吸気、切開を修理し、流れを復元します。静脈は、個々 の実験的プロトコルによって決まります時点で収穫されます。移植配置と情報伝達系の 28 日間の遅延は動脈循環の静脈グラフトの適応を確保するため必要です。この適応は、静脈グラフト導入前に、または直後移植で発生する遺伝子発現の急速な損失を回避できます。メソッドは、耐久性、安定した遺伝子発現によりグラフト静脈を達成するためにその能力でユニークです。ウサギ他動物大静脈血管モデルと比較して、低コストと簡単な処理の利点があります。ウサギ齧歯動物の静脈グラフトのモデルと比較して、解析のための豊富な組織を提供する大きく、操作が簡単の血管があります。

概要

動脈硬化は、脂質蓄積と血管壁の炎症で血管内腔、心臓発作、ストロークおよび手足^1,2の損失の縮小につながる慢性炎症性疾患です。経皮的介入 (e.g、血管形成術とステント留置術) と薬物療法 (e.g。、スタチン系薬剤と抗血小板薬のエージェント); アテローム性動脈硬化症の治療は、。ただし、彼らはしばしば冠動脈および末梢循環に重度の閉塞性疾患の両方の治療に効果的です。バイパス術、自家静脈セグメントを使用して深刻なびまん性冠動脈および末梢血管疾患^3,4の患者を治療するための一般的な手順のままです。ただし、両方の冠は、移植を静脈し、末梢循環悪い長期開存率があります。冠循環の静脈グラフトが 1 年間で 50% 遮蔽の約 10-20% は 10 年^5,6に遮蔽されました。末梢循環の静脈グラフト故障率、5 年間⁷時 30-50% です。

病気のサイトに正確に治療遺伝子産物を配信できるため、遺伝子治療は静脈グラフト障害の防止のための魅力的なアプローチです。したがって、多くの前臨床研究は静脈グラフト遺伝子療法^8,9をテストしています。ただし、本質的にこれらの研究のすべては、早い時間 (2-12 週) のポイント^{10、11,12,13,14,15,}の有効性を調べられます^16,17. 遺伝子療法の介入が耐久性を提供できるという証拠はないと意識しております (年) 通常起因する新生内膜過形成や動脈硬化⁴後半の静脈グラフト障害に対する保護。グラフト静脈で耐久性のある遺伝子発現をでき、後半と初期の時点で遺伝子治療介入のテストによりメソッドを開発しました。耐久性のある遺伝子発現を成し遂げるためには、メソッドには、HDAd ベクトルと遅延伝達戦略が組み込まれています。HDAd ベクトル免疫^18,19,によって導入された細胞の認識 (と拒絶)^20,を防止するウイルスの遺伝子がないために長期の遺伝子発現を提供する²¹. 遅延伝達 (グラフト留置後実行される 28 日) は²²移植後早期に発生する大量の処理中に導入された細胞の損失を防ぐことができます。

移植配置^{10、11,12,15,16 時静脈グラフトの伝達に依存して静脈の血管壁における治療導入遺伝子発現を達成する他の方法 ,17}。連続的に測定したとき遺伝子発現のこのアプローチを使用してすばやく伝達^22,23後低下します。したがって、このアプローチを用いた研究がほとんどない 4 週間を超えて有効性を評価すると、グラフト静脈後 12 週を超えて有効性を検討していません。これに対し、本方式による静脈グラフトと-同じような研究に基づいて動脈可能性がありますで実行される、少なくとも 24 数週間安定持続する遺伝子発現のはるかに長い^22,24を続けています。その他静脈グラフト遺伝子療法の介入なしこの期間の遺伝子発現の安定を実現すると意識しております。

家兎モデルを使用して、本手法を開発しました。他の齧歯動物、ウサギ、使用したまたは静脈をテストするより大きい動物移植遺伝子療法^{10、11,12,15,16,17,25、 26}。齧歯動物モデルと比較して、ウサギはより高くより厳格な規制要件が適用されます。しかしより大きい動物に比較 (e.g。、ブタおよび犬)、ウサギを購入し家にはるかに高価な、はるかに扱いやすい。ウサギ血管生理人間の血管のようにまた、²⁷、彼らが経皮的介入^28,29をテストするため使用することができます、彼らは十分な組織を提供する十分に大きい複数のエンドポイント (e.g。、組織学、タンパク質、RNA) 単一の血管標本^22,30を使用して調べることができます。さらに、静脈グラフトのウサギは、高脂肪食にうんざりした、彼ら開発静脈移植動脈硬化^31,32, 冠動脈バイパス静脈グラフト障害^{4,5 の一般的な原因であります。}.これらの動脈硬化家兎静脈グラフトは、遺伝子治療の介入は、この方法をテストするための基板として使用できます。指定されたプロトコルは、ウサギ静脈グラフトにおける遺伝子発現の耐久性を達成するために必要な技術的なスキルを習得する捜査官を助けることができます。

プロトコル

すべての動物のプロトコルと研究は、ワシントン事務所の動物福祉の大学によって承認されました。

1. 事前操作 (すべての手術)

1. 棘筋の筋肉内注射 (IM) 30 mg/kg 1.5 mg/kg とケタミン ・ キシラジンとウサギを麻酔します。
   注: 食料と水は、手術前に制限されません。
2. 十分な麻酔深度を待っている間、準備室と手術室 (OR) 内のテーブルを設定します。
   1. ウサギの首と耳 (生存手術のみ) で静脈内 (IV) ポートの配置をシェービングの準備室を準備します。眼軟膏、フェンタニル パッチ (生存手術)、バリカン、アルコール準備パッド、¾"カテーテル、注入ポート、およびサージカル テープ x 24 G を準備テーブルに配置します。
   2. または、監視装置を設定し、プローブ (心電図 (心電図)、パルス酸素濃度計 (スポ₂)、および温度) を関連付けられています。18 G、19 G の針で 100 mL の生理食塩水 IV バッグ IV ポンプを準備し、10 mL/h として流量を設定/kg (生存手術のみ)。ノーズ (静脈移植または収穫手術) と酸素とイソフルランの機器を設定します。
      1. ウサギにノーズを保護するには、ガーゼ ストリップ ノーズにガスを供給する管の周りをループします。このループは、ノーズと接続しているチューブを囲む必要があります。ガーゼ ストリップの自由端両方約 45 cm を長いことを必要があります。表の頭の端に (接続されているガーゼ) とノーズを配置します。
   3. 循環水の上および/または空気またはテーブルの上の毛布を温暖化を余儀なくされました。地球温暖化の毛布の上首サポートとして圧延のタオルの位置し、電気メス対極板プレートを配置します。
   4. 局所麻酔薬として 2% リドカイン塩酸 1 mL の注射器を組み合わせるし、0.5% ブピバカイン塩酸 1 mL の希釈した望ましい集中にウイルス (HDAd ここで、使用 2 x 10¹¹ウイルス粒子/mL) の滅菌 DMEM、氷上 (遺伝子伝達手術のみ)。
   5. 適切な麻酔深度に達すると後、は、手術のためウサギを準備します。
      注: は十分な麻酔深度を確保するためペダルの逃避反射の欠如をテストします。手術中ペダルの反射を監視し続けます。
      1. ウサギの目に眼軟膏を適用されます。
      2. 直腸温度プローブを配置できるように、直腸のすぐ上の手袋をはめた指で押すし、ウサギの直腸から stooling を削除する肛門に向かって指を動かします。
      3. 下顎骨の端に胸骨切痕からウサギを剃る。IV の配置のための 1 つの耳とフェンタニル パッチ管理 (生存手術のみ) の反対側の耳を剃る。SpO₂プローブの配置の左後部中間爪先を剃る。
   6. ベクトル注入手術のためには、ウサギを挿管します。関節鏡でスレッド 4 mm O.D./3 mm 内径成形カフなし気管内チューブを使用します。胸骨の横臥でウサギを置き、首をハイパー拡張します。ウサギの口を大きく開いて保持し、声門や喉頭ひだを視覚化する関節鏡を使用します。インスピレーションは、中にそっと喉頭や気管に気管内チューブを挿入します。
   7. サバイバル手術の場所しウサギの左の耳静脈に 24 G IV カテーテルを保護し、吹出し口を備えたキャップします。ウサギの右耳に 25 μ g/h フェンタニル パッチを適用します。
      注: プロトコルは、ウサギの右側に配置されている外科医です。外科医はウサギの左側にある場合は、逆にワイヤーと外科医の反対の IV を維持するこの手順の側面。必要に応じて、今後のステップに側面を切り替えます。
   8. 静脈移植・収穫手術用ノーズ ・ コーン部分; 麻酔を管理します。ベクトル注入手術のため気管内チューブを介して全身麻酔を管理します。
      メモ: 挿管は、すべての手術に使用できます。 ただし、我々 の経験で、挿管時の気管・喉頭外傷による合併症のリスクは挿管の利点を上回ることができます。 (特にコレステロール ウサギ) で移植への遺伝子導入を含む手術は唯一の手術現況純便益を提供するようであります。
   9. OR にウサギを運ぶ。ウサギの頭のちょうど下に首サポート タオルで手術台の上に仰臥位にウサギを配置します。優しくまっすぐであり、およそ水平までは、ウサギの首を拡張します。
   10. ウサギ (静脈移植・収穫手術) に粗野または 1 L/分、O₂気管内チューブ (ベクトル注入手術) を接続し、イソフルランを起動します。ノーズを使用している場合は、ウサギの首サポート タオル周り添付ガーゼ帯の端をラップすることによって固定します。麻酔の手術のレベルを維持するために (通常 1-2%) を必要に応じて、イソフルラン麻酔濃度を調整します。
   11. ウサギの背中の下電気メス対極板プレートの中心。直腸温度プローブを挿入し、SpO₂プローブと心電図リードをウサギに適用します。
   12. 生理食塩水の静脈ラインをウサギの左耳にカテーテル ポートに接続し、10 mL/h で IV 輸液ポンプを開始/kg。生理食塩水の輸液速度で 5 mL/h 1 h 後下げ/kg。
   13. 緩く拘束としてウサギのオペレーティング テーブルに前足を結ぶ。
       注: 必要に応じて、小さなプラスチック製のテーブルすることができます上に配置するウサギ ウサギの胸部・腹部、上を押すと胃食道逆流や誤嚥を引き起こす可能性がありますから外科医を防ぐために。
   14. リドカイン/ブピバカイン (2 mL、50/50 ミックス、ステップ 1.2.4) を皮下注入 (SQ) 局所麻酔のため、予定切開線に沿って首。
   15. 消毒、手術助手についているサイトを交互にイソプロパノール、グルコン酸クロルヘキシジン ・ スクラブ 3、ポビドン ヨード剤サイトをスプレーします。ある外科医のスクラブ、ガウン、手袋、無菌の原則に従います。
       1. 無菌条件下で生存手術を実行します。任意の非滅菌アイテムの処理し無菌外科医に滅菌材料を渡すまたは無菌ドレープ楽器テーブルに置いてのアシスタントをしています。
       2. 無菌、顕微鏡などの非滅菌装置を操作するための外科医の使用滅菌タオルがあります。ある外科医の手術の最初の半分を実行している間外科用ルーペ × 2 を着用します。

2. 静脈グラフト手術 (サバイバル)

1. 器具滅菌フィールドを準備します。
   1. 滅菌パック (テーブル ドレープ、紙のドレープ、6 タオル) を開き、無菌外科医に内容を転送のアシスタントをしています。
   2. 計測器表をドレープします。紙のドレープと滅菌タオル ドレープ楽器テーブルの上に配置します。4 タオルでさらされて首に手術部位だけを残して、ウサギをドレープします。ウサギの上に紙のドレープを横たわっていた。タオル 1 が後で、使用され、最後の 1 つはバックアップ。
   3. 滅菌器械のパックを開き、無菌装置トレイを外科医に渡すのアシスタントをしています。計測器表に楽器を配置します。
   4. アシスタントの次の機器を開くと無菌外科医に渡すまたは楽器のテーブルの上にそれを置く: 1 1 mL 注射器、1 つ 3 mL 注射器、1 つ 20 mL 注射器、1 つ 21 G 針、3-0 ポリグ リコール酸 (PGA) 縫合、5-0 PGA 縫合、7-0 ポリプロピレン縫合糸、および 1 つの 24 G IV カテーテル。
   5. ドレープ 7.25"Kantrowitz 鉗子を使用してウサギをカバーする電気焼灼器ケーブルを固定します。電気手術ユニットに接続し、アシスタントでオンになって手術台の端にケーブルのプラグの端をドロップします。
   6. 生理食塩水バッグやアシスタントによって開催されたバイアルから滅菌生理食塩水で 20 mL の注射器を満たしなさい。操作中に公開される組織の脱水を防ぐために必要に応じてこの生理食塩水を使用します。
   7. すなわち食塩液 5 mL にヘパリン 5,000 IU/mL の 0.1 mL を追加してヘパリン生理食塩液 5 mL を準備します。、100 IU ヘパリン/mL、小鉢で手術。このソリューションを使用して、移植術の中に定期的に頚動脈と静脈グラフトをフラッシュします。
   8. ウサギの首に手術部位を紙のドレープの穴をカットします。使用タオルは、基になるタオルの場所の穴の角を固定するクランプします。
2. 血管の解離
   注: は、手術のこの部分を支援する 2 x 手術用ルーペを使用します。
   1. 胸骨切痕と下顎骨 (長さ約 7-9 cm) の正中線に沿って電気焼灼で皮膚をカット、タオルのクランプで、タオルにウサギの首の皮膚をクランプします。尾の端に電気焼灼で筋膜の短い水平カットを作る。大きなはさみを使用して全体の正中線に沿って筋膜下解剖ぶっきらぼう。電気焼灼で正中線に沿って解剖筋膜層をカットします。
   2. 右側にあるを開始します。気管を覆う胸骨舌骨筋と総頸動脈を公開する、sternocephalic の V 字筋の間を解剖します。
   3. 総頸動脈の 4-5 cm のセグメントを慎重に分析、周囲の組織から無料の大きい枝 (通常 1-2 側あたり)。遠位咽頭神経の交差点に近位の首の基部から郭清を拡張します。頸動脈の解剖中の撤回を支援する手術シリコン ループを使用します。遠位各枝を切断する前に 5-0 絹糸で総頸動脈の大きな枝を縛る。
      注: 総頸動脈, または動脈を渡る小さい神経に匹敵する迷走神経の邪魔にならないように気をつけてください。
   4. 左側にある (手順 2.2.3) 郭清を繰り返します。
   5. 組織保持鉗子を使用して、皮下組織層を一時的に閉じる。外頸静脈を公開するまでは、右側の皮膚から浅筋膜を解剖します。4-5 cm セグメント外頚静脈の解剖で、枝が枝を切断する前に 5-0 シルク縫合糸で小さな枝を縛ること、周囲の組織を無料です。
   6. 左側にある (手順 2.2.5) 郭清を繰り返します。
   7. IV カテーテルにヘパリン (150 IU を/kg) を挿入して生理食塩水 10 mL でフラッシュします。
   8. 右側の外頚静脈部分 3 cm を測定し、5-0 絹糸とセグメントの尾方端を縛る。血でいっぱいに静脈を許可し、静脈セグメントの頭蓋の端を縛る。頭蓋外頸静脈セグメント末を分割と 24 G の IV カテーテルに接続されている 3 mL シリンジを使用して通常ヘパリン生食液 (100 U/mL) 容器を慎重にフラッシュします。その尾側で静脈のセグメントに分割します。尾と頭蓋の端が明確に識別可能である、標準化された位置に静脈セグメントを配置します。
3. 静脈グラフト
   1. アシスタントの外科医から手術用のルーペを外し、手術顕微鏡 (25 X) を所定の位置に移動ができます。
      注: 外科医は顕微鏡上滅菌タオルをドレープする必要があります。これは外科医は無菌性を維持しながら顕微鏡を操作することができます。
   2. ミニ クランプ、動脈、充填し、尾側のクランプを置くことを許可する最初の頭蓋のクランプを配置することで分離のセグメントの各端に右総頸動脈をクランプします。
   3. 固い紙 (包装滅菌縫合から利用可能) の 1 × 2 cm 部分をカットし、露出を向上させる共通の頸動脈の下に置きます。
   4. 尾側のクランプ (尾側切開) にちょうど頭蓋すなわちを実行します。切開の長さは頭蓋静脈セグメント末の直径に等しいはずです。尾側切開を通して IV カテーテルと注射器を挿入し、ヘパリン生食による頚動脈内腔をフラッシュします。
   5. 単一ステッチ (図 1) で 7-0 ポリプロピレン縫合糸を使用して、尾側切開する静脈の頭蓋の端を縫合します。
      1. 尾末静脈セグメントのために頭蓋仙骨の切開を縫合する最初のステッチを配置します。頭蓋静脈セグメントのために頭蓋仙骨切開末を縫合する、最初のステッチから 180 ° の 2 番目のステッチを配置します。
      2. 吻合部の側面に、最初の 2 つのステッチから等距離にある点で 3 番目のステッチの場所。吻合は、最初の 2 つのステッチから、3 番目のステッチの向かいに等距離にある内側側 4 ステッチを配置します。4 追加針 (針 5-8) 各ステッチ 1-4 の間に配置します。
      3. 頭蓋クリップ仙骨側頭蓋切開を実行します。頭蓋切開の頭蓋の端、尾側切開の尾の端の間の距離は、静脈のセグメントの長さと同じにする必要があります。頭蓋切開の長さは、静脈のセグメントの尾側端の直径と同じです。
   6. 頭側のねじれを導入せずに、頚動脈の上に敷設、吻合部から静脈を拡張します。頚動脈をフラッシュし、頭蓋切開を介してヘパリン生食による静脈。生理食塩水は尾側吻合を介して静脈、動脈を通って流れ込むが、静脈の無料と unsutured の端から終了します。フラッシング静脈もねじれからそれを防ぎます。
   7. 頭蓋切開 (図 1) に静脈の尾方端を縫合します。
      1. 尾末静脈セグメントの尾の端に頭蓋切開を縫合する最初のステッチを配置します。頭蓋静脈セグメントの尾の端に頭蓋切開末を縫合する 2 番目のステッチを配置します。2.3.5.2 の手順で説明されているように吻合部を完了します。最後のノットは、頭蓋の吻合に結びついている、直前に簡単に出血、頚動脈とグラフト静脈内の空気を洗うように、解剖の一般的な頚動脈セグメントの頭蓋の端にクランプを開きます。最後の結び目を締めます。
   8. 血と静脈グラフト充填を許可し尾側のクランプを離します頭蓋のクランプをリリースします。静脈グラフトには、活発な脈動を見るべき。吻合で任意の出血を止めるに乾いたガーゼで穏やかな圧力を適用します。
   9. 3-0 シルク縫合と吻合を結ぶ共通の頚動脈セグメントの両端を縛るし、合字 (図 1) の中間の頸動脈を分割します。各吻合に隣接する内頚動脈にパパベリン (3.5 mg/mL) を数滴を適用します。
   10. 耳 IV カテーテルにヘパリン (75 IU を/kg) を挿入し、10 ml の生理食塩水のフラッシュします。この時、フェンタニル パッチは、フェンタニルの鎮痛剤の血漿中濃度を提供してまで、術後鎮痛を提供するブプレノルフィン (SQ、0.02 mg/kg) を挿入します。
       注: 追加ブプレノルフィン注射 (平方メートル、0.02 mg/kg) プラズマ フェンタニル治療濃度に達するまでに鎮痛効果を維持するために最初の注射後必要な 6 h になることがあります。
   11. (2.2.8 の手順、2.3.2-2.3.9) の左側に移植を繰り返します。
   12. 連続パターンを使用して 5-0 PGA 縫合糸で皮下組織を閉じます。皮内のパターンを使用して 3-0 PGA 縫合糸で皮膚を閉じます。両端に結び目を埋めます。
4. 手術後の回復、クリーンアップ、およびケア
   注: は、穏やかな、静かな環境で麻酔から回復するウサギを許可します。それは完全に回復するまでは、継続的に適切な酸素と体の温度、ウサギを監視します。
   1. イソフルランと酸素をオフに、ウサギから麻酔器を外します。ウサギから IV 液チューブを切断、緊急アクセスの耳静脈に IV を出港です。
   2. 回復ケージにウサギを輸送し、その側に置きます。温水毛布 (または強制換気が温暖化) 熱のサポートを提供します。SpO₂が安定するまでは、粗野で O₂を与えます。
   3. ウサギは、座っていると、そのケージに歩き回ることができます、までその他の側の 15 分毎にウサギを反転します。耳 IV のカニューレを削除そしてウサギをケージに戻ります。それは完全に麻酔から回復後にのみ、他の動物の会社にウサギを返します。
   4. バイオハザードと鋭利物の廃棄物処理の任意の廃棄物以下の適切なプロトコルの処分します。
   5. 毎日、ウサギの健康と手術創を確認術後。ブプレノルフィン フェンタニル パッチによって管理されない痛みのため必要があるとを管理します。術後 3 日目には、フェンタニル パッチを削除します。

3. 経皮的超音波

1. グラフトの開存性を評価するために超音波検査非麻酔下のウサギの 5-7 日後実行静脈移植外科、遺伝子導入手術。
   1. 非麻酔下のウサギを毛布でしっかりとラップし、拡張その首にウサギの獣医の V トラフにおける仰臥位を配置します。首、ひげをそるか、必要な場合は、脱毛剤で毛を削除します。首に超音波ゲルを適用し、超音波検査を行います。
      メモ: 超音波検査は遺伝子移行術とグラフトの開存を確認し、血管内腔の直径を測る端末移植収穫手術の時の麻酔下のウサギの実行されますも。試験は首のスクラブの直前に行われます、非麻酔下のウサギについては同様の方法で実行されます。

4. 遺伝子手術 〜 グラフト留置 (生存手術) 後 28 日

1. 器具滅菌フィールドを準備します。
   1. 2.1.1-2.1.3 の手順に従ってください。静脈グラフト手術。
   2. 開き、以下の機器いずれか無菌アシスタントができます外科医に渡したり、楽器のテーブルの上にそれを置く: 6 1 mL 注射器 (針)、1 つ 3 mL 注射器、1 つ 20 mL 注射器、1 つ 21 G 針、1 つ 19 G の針、3-0 PGA 縫合、5-0 PGA 縫合、7-0 ポリプロピレン縫合糸、2 つ 24 G 静脈留置針、滅菌血流プローブ。
   3. 2.1.5-2.1.6 の手順に従ってください。静脈グラフト手術。
   4. 動脈と静脈の血管を洗浄するため 1 mL DMEM で 1 つ 1 mL の注射器を準備し、注射器 1 mL 2 ウイルス ソリューションを準備 (〜 0.5 〜 0.7 mL ウイルス ソリューション/静脈グラフト)。ウイルスを解凍し、DMEM で希釈してアシスタントをしましょう。リドカイン/ブピバカイン (50/50 ミックス、ステップ 1.2.4) の 0.5 mL と 1 つ 3 mL シリンジを準備します。
   5. 2.1.8 静脈グラフト手術の手順に従ってください。
2. 静脈グラフトと隣接する頚動脈の分離
   注: この部分の手術用ルーペ × 2 を使用ください。
   1. 胸骨切痕と下顎骨 (長さ約 7-9 cm) の正中線に沿って電気焼灼で皮膚をカット、タオルのクランプで開いて皮をクランプします。リドカイン/ブピバカイン (50/50 ミックス、ステップ 1.2.4) の 0.5 mL を皮下組織に適用されます。
   2. 尾の端に電気焼灼で筋膜の短い水平カットを作る。にべもなく全体の正中線に沿って筋膜下を解剖します。電気焼灼、正中線に沿って解剖筋膜をカットします。
   3. 右側にあるを開始します。気管をオーバーレイ胸骨舌骨筋と静脈グラフトを公開する、sternocephalic の V 字筋の間を解剖します。静脈グラフトと頭蓋と仙骨の両側に移植に隣接する内頚動脈の 1.5 〜 2.0 cm に慎重に分離します。
   4. 左側にある次のステップ 4.2.3 郭清を繰り返します。
3. 静脈グラフトの血流を測定します。
   1. 食塩音波の伝達を有効にすると右側の手術創腔を埋めます。創傷内に生理食塩水で 2 mm の血管周囲流れのプローブ (容積流量計に接続) の流量を 0 に設定。
   2. 尾または静脈グラフトに頭蓋内頚動脈周囲流プローブを配置します。電子データ集録システムでフロー プローブからのデータを記録します。
   3. 左側にある次のステップ 4.3.2 流量測定を繰り返します。
   4. ピーク時収縮期血圧流量、最小拡張流量、平均流量に基づく体外を計算します。また流量に基づいて、層流のせん断応力と内腔の直径 (経皮的超音波測定) を計算します。
4. 静脈グラフトにベクトル ソリューションを吹き込む
   注: 必要に応じて穴をあける、注入、および頸動脈の修復手術顕微鏡 (16 X) が使用されます。
   1. 外科医の手術用ルーペを削除し、所定の位置に手術顕微鏡を移動のアシスタントをしています。外科医は顕微鏡上に滅菌タオルをドレープがあります。滅菌タオルでは、外科医は無菌性を維持しながら顕微鏡を操作することができます。
   2. IV カテーテルにヘパリン (150 IU を/kg) を注入助手についているし、生理食塩水でフラッシュします。
   3. 約 80 ° 傾斜面のすぐ上に 21 G 針を曲げる大きな針ドライバーを使用 (曲げていないかさ;図 2 a)。
   4. ミニ ・ クランプ、動脈、充填し、尾側のクリップを配置することを可能にする最初の頭蓋のクランプを配置すると静脈グラフトの各端に頸動脈をクランプします。尾、切開のいくつかの部屋を残して、吻合部に約 10 mm の尾側のクリップを配置します。
   5. 移植だけ尾動脈周囲の 2 つのシルク ネクタイを入れて、それぞれ合っていることなしに単一オーバーハンド ノットを結ぶ。
   6. ちょうど頭蓋血管クリップ仙骨のベントの 21 G 針で移植尾側の頚動脈を穿刺します。背面や側面の壁はパンクしないように注意します。-前後 2 回、内腔を確実に、明確に内腔に針を進めるし、慎重に針を撤回します。
      メモ: 一般的な頸動脈穿刺の微細鉗子で動脈の外膜を把握、リフト点 (図 2A) にちょうど尾の針の先端を挿入しながら正面の壁を優しく持ち上げて支援が可能します。これは針と後ろの壁を押すことのリスクを減らします。
   7. 伸ばしたガーゼ数枚と注入用注射器を配置する巣を作成します。手術部位にこのガーゼ巣尾を配置します。
   8. DMEM 専用注射器に 24 G の IV カテーテルを入れて注射器をカテーテルを締めます (注射器で削除されます後でこの手術) 漏れを防止するだけで十分なカテーテルを曲げると 〜 先端より 4 mm がリリースされた後約 75 ° ベンドを保持できるように。
   9. ベンド ポイントまで一般的な頸動脈切開に IV カテーテルを挿入し、DMEM の 0.5 mL で 2 回静脈血管内腔を洗浄します。各繰り返し DMEM に静脈グラフトを記入します。移植片グラフトの頭蓋の端に手袋をはめた指で軽く押して、DMEM を取り出します。慎重に、切開を介して内容を洗い流すグラフトの尾側に向かって指をスライドさせます。
   10. DMEM 注射器をカテーテル、血管内カテーテルを残してから削除します。空気にカテーテルが入らないことを確かめてウイルス ソリューションを含む注射器に接続します。緩く結ばれたシルク結ぶ動脈まで彼らはカテーテル先端部周辺が締め付けていないに移動します。
   11. 0.03 mL のカテーテルから残り DMEM をプッシュするウイルス溶液を注入します。頭蓋から尾側へ軽く押す、指で静脈血管内腔からすべての流体を削除します。
   12. 内腔をシールする動脈とカテーテルの先端部周辺のネクタイを 2 本を締めます。静脈が膨張するまでウイルス ソリューションを吹き込みます。ガーゼの巣をシリンジそっと置きます。
       注: 静脈グラフトが展開すると、その事前の伝達の口径とウイルス液注入時に膨れたままに重要です。されていない場合は、遺伝子の量は有意に減少しました。
   13. 20 分間静脈血管内腔にウイルスを含んだソリューションを残すし、空の注射器をカテーテルに接続されているウイルスを含んだ注射を置き換えます。船が崩壊するまでそっと移植からウイルスを含んだソリューションを吸い出しなさい。場所にカテーテルを残して、注射器を削除します。カット絹縫合糸をほどくし、血管からカテーテルを撤回します。血管内皮細胞の損傷を避けるために注意深く頚動脈からカテーテルを削除します。
   14. 手術顕微鏡を用いて、X-パターン (図 2B) を使用して 7-0 ポリプロピレン縫合糸で、切開を閉じる。
       1. ニードル ホルダー付き縫合糸をつかんで、切開の右下で船を入力左下で船を終了します。開口部を渡る容器外左上に右上から 2 番目のパスを見つけ。
       2. 縫合を締める前に簡潔に静脈と動脈から空気と残留ウイルスをフラッシュする頭蓋血管クリップを解除します。クランプが離されたとき、血液は、切開から流れます。
       3. すぐ切開縫合糸を軽く引いて終了し、2 スクエア ノットと結びつけます。
          注: はきつすぎる縫合糸を引いて流れが乱される、血栓症リスクを増大させ、自由な変数を導入することで組織のバンチングなります。
   15. 頭蓋血管クリップし尾側のクリップを解放します。光の圧力を適用するガーゼを使用して任意の出血を停止します。
   16. この時期、フェンタニル パッチは、フェンタニルの鎮痛に血漿中濃度を提供しているまで、術後鎮痛を提供するブプレノルフィン (SQ、0.02 mg/kg) を挿入します。
       注: 追加ブプレノルフィン注射 (平方メートル、0.02 mg/kg) プラズマ フェンタニル治療濃度に達するまでに鎮痛効果を維持するために最初の注射後必要な 6 h になることがあります。
   17. 左側にある、次の手順 4.4.5-4.4.15 ウイルス注入プロトコルを繰り返します。
5. 傷の閉鎖
   1. 連続パターンを使用して、5-0 PGA 縫合糸で皮下組織を閉じます。皮内のパターンを使用して 3-0 PGA 縫合糸で皮膚を閉じます。両端に結び目を埋めます。
6. 手術後の回復、クリーンアップ、およびケア
   1. 2.4 の手順に従ってください。

5. 収穫手術 (ターミナル)

1. 楽器と手術部位を準備します。
   1. 静脈グラフト手術の手順 2.1.1-2.1.3 に従ってください。
   2. 開くと無菌楽器テーブル上に配置 (または外科医に渡す) アシスタントを聞かせて: 1 つ 20 mL 注射器、1 つの 21 G 針、縫合糸 3-0 シルク、滅菌血流プローブ。
   3. 手順 2.1.5-2.1.6 と 2.1.8 静脈移植手術。
2. 総頚動脈と静脈グラフトの分離
   1. 胸骨切痕と下顎骨 (長さ約 7-9 cm) の正中線に沿って電気焼灼で皮膚をカット、タオルのクランプで、タオルにウサギの首の皮膚をクランプします。
   2. 尾の端に電気焼灼で筋膜の短い水平カットを作る。にべもなく全体の正中線に沿って筋膜下を解剖します。電気焼灼で正中線に沿って解剖筋膜をカットします。
   3. 右側にあるを開始します。気管を覆う胸骨舌骨筋と共通の頚動脈と静脈グラフトを公開する sternocephalic の V 字筋の間を解剖します。
   4. 右静脈グラフトと総頚動脈周囲の組織から自由を解剖します。解剖中動脈と静脈グラフトの撤回のため手術シリコン ループを使用します。
   5. 左側にある次の手順 5.2.3-5.2.4 郭清を繰り返します。
3. 次の手順 4.3.1-4.3.3 遺伝子移行術で流量測定を行います。
4. 静脈グラフトの収穫
   1. 縫合糸 3-0 シルクで、右総頚動脈グラフトに頭蓋を縛る。その後移植尾側の頸動脈を縛る。
   2. および各と隣接する吻合間隣接する頚動脈を割って右静脈グラフトを切除します。ウサギから静脈グラフトを削除し、生理食塩水で内腔をフラッシュします。
   3. 頚動脈と静脈グラフトの両端から吻合をトリミングします。静脈グラフトから離れて過剰な外組織をトリミングし、異なるエンドポイント解析に必要なセグメントにグラフトをカットします。
   4. 5.4.1-5.4.3 の手順を繰り返すことによって左静脈グラフトを収穫します。
5. フェニトイン/ペントバルビ タール ウサギを安楽死 IV の 1 mL を注入します。
6. バイオハザードと鋭利物の廃棄物処理の任意の廃棄物以下の適切なプロトコルの処分します。

結果

オペレーターは、実験データを生成するこのメソッドを使用できます前に、new 演算子の技術的な習熟度を検証する必要があります。New 演算子を実現する必要があります最初のマイルス トーンは、一貫性のある静脈グラフトの開存を初回血管移植手術とその後の遅延伝達手術後です。以上手術のそれぞれが望ましいと達成した後 90% 開存性。開存は、我々 は通常術後 5-7 日に行う経皮的超音波を用いた非侵襲的評価できます。特許の葉脈のあるウサギ、超音波試験は前方首 (図 3A) の両側に活発な尾-脳血流と血管を明らかにします。静脈グラフトのいずれかが遮蔽された場合がありますありません検出尾-脳血流閉塞血管の端に。ただし、頭蓋仙骨の血流は、内頸静脈 (図 3B) でまだ検出されます。

N...

ディスカッション

このプロトコルの重要なステップには、麻酔の管理、動脈/グラフト静脈の抗凝固、手術操作、グラフト静脈の血行動態の測定が含まれます。2 つの比較的長い操作 (二国間静脈グラフトの通常 3 〜 3.5 h および二国間移植伝達の 1.5 〜 2.5 h) を含む複数この生存手術モデルの麻酔の適切な管理が欠かせません。両方、粗野で、気管内挿管による麻酔を投与し、挿管を考える肯定的な圧力換気、無気肺を防止、生存を伝達術後改善し、関連付けられていることを発見した呼吸不全。ウサギは、挿管に挑戦しているし、気管挿管による気道外傷術後喘鳴を引き起こすことができます。しかし、課題と、挿管の合併症、周術期合併症と静脈グラフト手術に関連付けられている死亡のほとんどを排除するために支払うために小さな価格です。

抗凝固療法は生存の手術のいずれかの後に発生することができますグラフト静脈の血栓症を防ぐために不可欠です。血栓は、経皮的超音波検査時に特許 5-7 日術後静脈グラフト、収穫時特許ほぼ常に早期術後イベントに表示されます。最初の手術後、血栓症を防ぐために (すなわち。、静脈移植)、最初の外...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Disposables
3mLシリンジ、24G針付き	Becton Dickinson	309571	2x、静脈移植手術用2倍、遺伝子導入用2倍  手術
1mLシリンジ、27G針	Becton Dickinson	309623	静脈移植手術用2倍、遺伝子移植手術用5倍
19G針	Becton Dickinson	305187	Geneトランスファー手術
20 mL シリンジ、ルアーロック	Nipro Medical Corp	JD+20L
カテーテル、24Ga x 3/4 インチ	テルモメディカルプロダク	SROX2419V
21Gニードル	ベクトンディキンソン	305165	遺伝子導入手術および生理食塩水
ガーゼ4 "x 4"	ダイナレックス	3242	~10-15 手術あたり
3-0 シルク縫合	Covidien Ltd.	S-244
5-0 シルク縫合	Covidien Ltd.	S-182
7-0 ポリプロピレン縫合	CP Medical	8703P	静脈移植手術
7-0 ポリプロピレン縫合糸	CP Medical	8648P	遺伝子導入手術
5-0 ポリグリコール酸縫合	CP Medical	421A
3-0 ポリグリコール酸縫合	CP Medical	398A
アルコール綿棒	Covidien Ltd.	6818	I.V.ラインの留置用
カテーテルプラグ	Vetoquinol	411498
Ketamine HCl, 100 mg/mL	Vedco Inc.
キシラジン、100 mg / mL	Akorn Inc.	4821
リドカイン、20 mg/mL	ファイザー	409427702
マルカイン 0.5%	ファイザー	409161050
Beuthanasia D-Special	Intervet Inc.	NDC 00061047305	収穫手術のみ
ブプレノルフィン HCl、0.3 mg/mL	パターソン獣医	12496075705
生理食塩水 IV バッグ、0.9% 塩化ナトリウム	Baxter	2B1309
ヘパリン (5000 U/mL)	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-047-10
パパベリン (3.5 mg/ml)	American Reagent Inc.	NDC 0517-4002-25	30mg/mL ストックから希釈;最大 1 mL
のフェンタニルパッチ、25 mcg/h	Apotex Corp. を使用します。	NDC 60505-7006-2
イソフルラン	複数のベンダー	カタログ番号はありません
ウイルスベクター			遺伝子導入手術のみ
<ストロング>手術器具
メッツェンバウム ニードルホルダー 7インチ ストレート	ロボズ	RS-7900
手術ハサミ 6.5インチ ストレート ブラント/ブラント	ロボズ	RS-6828
ニードルホルダー/縫合糸ハサミ付き	ミルテックス	8-14-IMC
Castroviejoはさみ	Roboz	RS-5658
Castroviejoニードルホルダー、ロック付き5.75インチストレート	Roboz	RS-6412
スティーブンスはさみ4.25 "湾曲した鈍い/鈍い	Roboz	RS-5943
Almリトラクター 4" 4X4 5mm鈍いプロング	Roboz	RS-6514	2x
バックハウスタオルクランプ3.5 "	Roboz		4x
マイクロクリップセッティング鉗子 4.75インチ	Roboz	RS-6496
マイクロ血管クリップ、11 mm	Roboz
Surg-I-Loop	Scanlan International	1001-81M	5 cm 長さ
Bonaccolto 鉗子、4インチ(10 cm) 長い縦方向の鋸歯状、交差鋸歯状の先端、1.2mm 先端幅	Roboz	RS-5210
Dumont #3 鉗子 Inox 先端サイズ .17 × .10 mm	Roboz	RS-5042
Graefe 鉗子、4 インチ(10 cm)長い鋸歯状のストレート、0.8 mmチップ	Roboz	RS-5280
Halstead蚊鉗子、  5インチストレート、1.3 mmチップ	Roboz	RS-7110	2x
Halstead蚊鉗子、  5インチ湾曲、1.3mmチップ	Roboz	RS-7111
ジェイコブソン蚊鉗子 5インチ湾曲超繊細、0.9mmチップ	Roboz	RS-7117
カントロウィッツ鉗子、7.25インチ 90度繊細、1.7mmチップ	Roboz	RS-7305
組織鉗子 5インチ、1X2歯、2mm先端幅	Roboz	RS-8162
Allis-Baby鉗子、12cm、4x5歯、3mm先端幅	ファインサイエンスツール	11092-12	2x
Adson鉗子、12cm、鋸歯状、ストレート	ファインサイエンスツール	11006-12
獣医電気外科用ハンドピースと電極	MACAN Manufacturing	HPAC-1;R-F11
Surgical Suite 機器
循環温水ブランケットとポンプ	複数のベンダー	カタログ番号はありません
ベアハガー加温ユニット	3M	Model 505
IV 輸液ポンプ	Heska	Vet IV 2.2
イソフルラン気化器とスカベンジャー	複数のベンダー	カタログ番号は利用できません
獣医用マルチパラメータモニター	Surgivet	Surgivet Advisor
獣医用電気手術ユニット	MACAN Manufacturing	MV-9
手術用顕微鏡	D.F. Vasconcellos	M900	静脈移植手術の倍率25倍、遺伝子導入手術の倍率16倍