特定病原体緑化シトラスカンキツグリーニング病病原細菌属カンキツ葉組織サンプルで使用した従来の PCR の正確な検出

サマリー

カンキツグリーニングは柑橘類の作物に影響を与える世界的に特に破壊的な病気です。ここで紹介は単純なメソッドを使用して PCR およびカンキツ葉組織のゲノム DNA 抽出カンキツグリーニング病原体、カンキツグリーニング病病原細菌属の正確かつ正確な同定のため

要約

カンキツグリーニング、カンキツグリーニング病として知られているは、世界的に柑橘類の農場を荒らす破壊的な柑橘類疾患です。この病気には、非対称の黄色葉の斑点、葉脈黄、摘葉、根面齲蝕、最終的には、柑橘類の植物の死が発生します。感染、柑橘類の植物は成長の発育を妨げているし、季節はずれの花を作り出します。これらの花はほとんど果物をもたらすし、小さく、苦い、不規則な形の柑橘系の果物を降伏行うことが望ましい。この病気は、感染したカンキツ組織からの移植、ミカンキジラミ、ミカンキジラミ、広がっています。病原体は柑橘類の植物の中で長いと変数の潜伏期間-時々 年、症状が現れる前に。この病原体の in vitro培養の試みが成功すると、可能性が低いのためにされている、内の病原体の凹凸濃度感染カンキツ組織や環境を複製することは困難だから条件の成長を助長病原体。前にそれが広がっており、その長い潜伏期間と、病原体を培養する研究者の無力のために病気を識別する非常に困難です。その結果、病気のみ明らかになります突然柑橘類の農夫の全体収穫を破壊した後。ここに提示のカンキツグリーニング病原体、ゲノム DNA 抽出キットや PCR を用いたカンキツグリーニング病病原細菌属の正確かつ具体的検出法です。このメソッドは、シンプルで効率的、費用対効果、かつ定量化するための適応です。このメソッドは、カンキツ組織で使用するために合わせることができます。しかし、それは可能性のある病原体の組織内に存在の量によって制限されます。それにもかかわらず、このメソッドは以前、感染した柑橘系植物を識別するために柑橘農家を許可し、それがさらに広がることができる前に、この破壊的な病気の広がりを抑制します。

概要

カンキツグリーニング、カンキツグリーニング病とも呼ばれる、柑橘類の木々 の重要な損失を引き起こした。1 つの代表格は、フロリダ州 2016-2017 シーズン¹現在 7000 万箱に 2 億 4400 万ボックスから 1997-1998 年シーズンのフロリダ オレンジ ボックスの生産の 70% 削減を引き起こす病気を予想する場所です。以上フロリダの柑橘類の木の 90% が感染した²、およびフロリダの柑橘類工業は、前記カンキツグリーニングは³主要な役割を果たしている柑橘類の病気が毎年約 10 億ドルを失うこと推定されています。カンキツグリーニング、侵襲ミカンキジラミミカンキジラミ、によって主に広がる、.の感染組織の接木によって広げることができるも病気の静脈、非対称的な黄化斑点、早期落葉、枝枯れ、根面齲蝕、植物の死の黄変が発生します。重要なことは、疾患の原因となりフルーツ、ほとんど、季節外れの花を作り出す柑橘類の植物。プロデュースは感染したカンキツ果実が未熟な緑、および⁴の味が苦いです。

このメソッドの目的は、正確し、運動性細菌カンキツグリーニング病病原細菌の属、感染したカンキツ⁵の師部内に生きてカンキツグリーニング病原を正確に識別。ゲノム DNA は生きている細菌を含む全体の葉組織から抽出されます。この抽出したゲノム DNA は細菌の 16S rdna に相補的なオリゴヌクレオチドは、このシーケンスを増幅するため、従来の PCR のテンプレートとして使用されます。シトラスFBOX遺伝子相補的なオリゴヌクレオチドは、内部増幅制御として使用されます。以前の研究⁶で成功するために実証されているため、このメソッドを使用にしました。

この方法には、簡単な比較的安価な任意の通常の整った生化学のラボで実施することができるの明確な利点があります。さらに、PCR のままこの病原体の⁷と病原体の能力を生き残るため、無症候性ホスト⁸年の再現を養殖の難しさのため、この病原体を検出するため最も正確かつ正確な方法。多くの異なる専門 PCR の試金はこの病原体; を正常に検出に使用されています。しかし、従来の PCR は、無症候性ホスト⁸の内で特に、正確かつ特定の検出のための最も簡単なアッセイを残ります。

プロトコル

1. ゲノム抽出キットを使用して植物組織からのゲノム DNA を分離します。

1. 切り出して全体の新鮮なきれいなはさみを使用して柑橘類の木から葉し、葉がきれいなプラスチック サンドイッチ バッグ、柑橘類の葉の組織を取得します。
   注記: 葉のティッシュの入った袋を配置する 4 ° C の冷却装置でまたは断熱容器で氷の腐敗を防ぐため、コレクション後できるだけ早く。
2. 乳鉢と乳棒を寒さに液体窒素の少量を追加します。彼らが冷やしている間葉組織、サイズ約 1 平方インチの小片をカットするはさみを使用します。それを瞬時に凍結するモルタルに切断組織を配置します。必要な場合より多くの液体窒素を追加します。
   注: 絶縁手袋は、液体窒素を処理しながら常に着用する必要があります。
3. すぐに、モルタルを用いた微粉末に植物組織を粉砕します。液体窒素が完全に蒸発して緑の粉のままなるまで研削を続けます。
4. 簡単に、ヘラを使って 1.5 mL 遠心チューブにモルタル内部地組織をスクープして 10-15 s、液体窒素中での金属のヘラを冷やします。
5. 核溶解液の 600 μ L を追加 (材料の表を参照) を使用して 1000 μ L ピペットと渦 1-3 s のサンプルは、15 分の 65 ° C の水浴中孵化させなさい。
6. 逆転管 2 - 5 回、それを混合し、37 ° c 15 分間キャビネット インキュベーターで孵化して、ライセート 10µL ピペットを使用する RNase 溶液 3 μ L を追加します。
   注: 続行する前に室温に冷却する混合物を許可します。
7. しっかりしたペレットを形成する 13,000 x g でタンパク質沈殿物溶液、20 秒の高速、3 分間遠心する渦の 200 μ L を追加します。サンプルを遠心分離されているが、新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに室温イソプロパノールの 600 μ L を追加します。
8. 1000 μ L ピペットを使用して、慎重にイソプロパノールを含む新鮮な 1.5 mL 遠心管に移し、遠心サンプルから上澄みを取り外します。ペレットを破棄今可能性があります。
   注: を使用すること、ペレット上清の非常に小さい量を残すことによって蛋白質の上澄みが汚れない。
9. DNA が糸状の繊維の塊として目に見えるようになるまで、チューブを反転し、室温で 1 分 13,000 × g で遠心分離します。
10. 上清をデカント、ペレットを 70% のエタノールの 600 μ L を追加、DNA を洗浄し、1 分間 13,000 × g で遠心チューブを数回反転します。
11. 慎重に緩やかな DNA の餌を残して、エタノールを吸引し、開き、吸収紙の上に休んで、チューブを反転します。15 分間室温で乾燥した空気。
12. 乾燥 DNA の餌に DNA 補水液 100 μ L を追加し、チューブをタップして定期的に混合しながら、1 時間 65 ° C の水浴の DNA を孵化させなさい。
13. 精製水 1 μ L を microcuvette に置き、空白として使用する分光光度計に挿入します。Microcuvette に 1 μ L のサンプルを配置し、分光光度計を挿入して、現在の DNA の濃度を計算します。DNA 濃度 (ng/μ L) (₂₆₀-₃₂₀) として計算される × 希釈係数 × 50 ng/μ L をすることができます。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは 4 ° C で保存できます。

2. ゲノム DNA のサンプルの PCR を実行します。

1. 結合 10 μ L 2 x PCR マスター ミックス (材料の表を参照)、1 μ L 前方プライマー (10 pM/μ L)、1 μ L 逆プライマー (10 pM/μ L) (プライマー シーケンスについて表 2を参照)、100 ng の DNA のサンプルから抽出され、精製水 (最大 20 μ L 最終巻) で50 μ L の PCR チューブ、ミックス、フリックで簡単に遠心分離機。
2. たちに PCR チューブを挿入し、それに応じて実行 (表 1参照)。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。必要に応じて、反応が完了した後、4 ° C でサンプルを格納します。

3. Agarose のゲルに増幅された DNA を electrophorese します。

1. アガロース パウダー 0.4 g の重量を量る、きれいな 200 mL 三角フラスコ、50 mL を充填する 1 x TAE バッファーと共にそれを追加します。
2. マイクロ波高 1.5 分、すべての 30 の揺れの s、アガロースは完全に溶解するまで。
   注: 火傷を防ぐために液体のアガロースを処理しながら絶縁手袋を着用ください。
3. 液体アガロースとミックスする手ふれに臭化エチジウム 10 mg/mL の 2.5 μ L を追加し、レベル ゲル鋳型に液体 agarose ゲルを注ぎなさい。注入後標準 12 歯ゲル櫛をすばやく挿入します。
4. ゲルを許可、室温で 20 分間冷却し、ゲルの櫛を削除して、ジェルを 1 x TAE バッファーでいっぱいレベル ジェル ボックスに。
5. ピペットを使用すると、増幅された DNA サンプルの合計を井戸に読み込みます。あなたのサンプルから別のよく 5 μ L の DNA の梯子 (材料の表を参照) を追加します。
6. 定数 90 V、35 分間のサンプルを electrophorese し、ゲルを取り外し、UV transilluminator に置きます。
7. 写真し、302 の紫外線透過を使用しながらパターンをバンディング ゲル分析 nm。

結果

肯定的な結果が 500 に対応する明瞭なバンドを得られる bpカンキツグリーニング病病原細菌うわさの花姫Las606/Lss⁶,および/または 700 に対応する異なるバンドのLaa2/Laj5、 16S リボソーム β への挿入のための bpオペロン⁹。内部増幅制御帯域 400 に現れる場合も bp。このバンドは柑橘類FBOX遺伝子の¹⁰では、増幅に対応し、有効と見なされる結果に表示する必要があります (図 1および図 2)。両方 500 の欠如 bp と 700 bp バンド 400 bp のバンドが存在する間は、否定的な結果を表します。約 700 のいくつかの非固有のバンド パターンを...

ディスカッション

まさに最適な実験条件を達成するためにすべての手順が続いていることが重要です。全体の葉の組織がこのデモ中に使用されました。しかし、理論的には植物組織の任意の種類を含めるにプロトコルを変更できます。以前は、研究者は葉静脈の組織ではなく、全体の葉組織からのゲノム DNA を抽出して同様の結果¹¹を達成しました。シトラスFBOX遺伝子に対応するバンドが表示されない場合、結果は有効でないし、動作の手順でいくつかの技術的なエラーの 1 つ以上可能性があります。一般的なエラー: 汚染または不適切な滅菌水、マイクロ ピペットのヒント、またはマイクロ遠心チューブ用を使用してPCR ミックスやゲノム DNA の抽出の間に必要な 1 つまたは複数のコンポーネントを追加する失敗適切なたちの条件を維持するために失敗しています。試薬またはその有効期限を過ぎている他の食材を使用してください。agarose のゲルに臭化物または別の DNA 染色エチジウムを追加に失敗高すぎる電圧または余りに長くのための増幅された DNA を electrophoresing古いまたは不適切な混合の TAE バッファーを...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウィザードゲノムDNA精製キット	プロメガ	A1120	核溶解、RNase、タンパク質沈殿、およびDNA再水和液の供給源
液体窒素	空気製品	N/A
コントロールパネル付きMastercyclerプロ	エッペンドルフ	6321000019
1250 W マイクロ波	パナソニック	N/A
5424 卓上遠心分離機	エッペンドルフ	05-403-93
Isotemp 215 デジタルウォーターバス	フィッシャーサイエンティフィック	15-462-15Q
金属ヘラ	シグマ-アルドリッチ	Z283274
モルタルと乳棒	シグマ-アルドリッチ	Z247464
LSE ボルテックスミキサー	コーニング	6775
2-プロパノール	シグマ-アルドリッチ	I9516
滅菌 10 μLチップ	TipOne	1161-3730
200 μLチップ	TipOne	1163-1730
1250 μLチップ	TipOne	1161-1750
容量ピペッターキット	VWR	75788-460
臭化エチジウム	Sigma-Aldrich	E1510
アガロース	IBI Scientific	IB70041
EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17892
酢酸	フィッシャーケミカル	A38-212
トリスベース	Sigma-Aldrich	10708976001
μキュベット	エッペンドルフ	6138000018
スタッカブルキャスティングトレイとコーム	カロライナ	213655
PowerPac ベーシック電源	バイオ・ラッド	1645050
ミニサブセル GTシステム	バイオ・ラッド	1704487EDU
バイオスペクトロメーター ベーシック	エッペンドルフ	6135000009
0.2 mL PCR チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	AB-0620
1.5 mL 微量遠心チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	3439
2X Taq グリーン PCR マスターミックス	Promega	M7122
フォワードプライマー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	N/A
リバースプライマー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	N/A
水、PCR グレード	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA ラダー	サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィ	ック 10787018

滅菌滅菌可変