プロトコルでは、回転楕円体の perfusable 管ネットワークを設計する方法について説明します。血管新生を誘導するマイクロ流体デバイスのマイクロに回転楕円体を接続する回転楕円体の周囲の微小環境が工夫されています。メソッドでは、三次元培養での待望の技術は、回転楕円体の血流をことができます。
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この記事について
サマリー
要約
回転楕円体 (多細胞集合体) は、人間の体内で生体組織の良いモデルとみなされます。回転楕円体の文化の重要な前進、にもかかわらずスフェロイドの perfusable 管のネットワークを維持し、タンパク質の発現、形態形成など、彼らの機能を開発するために必要な長期的な文化のための重要な課題のまま。プロトコルは、マイクロ流体デバイスの回転楕円体内 perfusable 血管網を統合する新しい手法を提案します。回転楕円体の perfusable 管ネットワークを誘導して、マイクロ チャネルに接続されている血管新生もやしは、回転楕円体の培養ひと肺線維芽細胞から血管新生因子を用いた回転楕円体に導かれました。血管新生もやしは、回転楕円体で共培養血管内皮細胞と結合、回転楕円体に達し、連続的な血管網を形成します。血管のネットワークをヌケモレなく回転楕円体の内部灌流でした。構築された血管網は、栄養素の供給と血液循環の生体を模倣した廃棄物の除去のためルートとしてさらに使用可能性があります。メソッドは、生体組織のよい反復に向かって回転楕円体文化の新しいプラットフォームを提供します。
概要
生活の細胞の機能を模倣文化モデルを使用する必要性によって動機づけられている三次元培養単分子膜 (二次元) 文化からシフト組織1,2,3。細胞培養でよく使用されるフラットとハードなプラスチック基板の上には、人間の体内で細胞外の環境のほとんどは似ていません。実際には、多くの研究を示す従来の二次元文化4でみられていない、三次元培養再作成組織固有のアーキテクチャに、機械的、生化学的手がかりと細胞間コミュニケーション 5,6,7,8。
多細胞集合体または回転楕円体は、この三次元培養9,10を実現するために最も有望な技術の一つです。細胞は、細胞外マトリックス (ECM) を分泌し、回転楕円体で他のユーザーと対話できます。ただし、いくつかの他の工学アプローチ
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プロトコル
1. マイクロ流体デバイス金型の作製
- 市販のソフトウェアを使用してマイクロ流体デバイスの模様 (Clewin5 または AutoCAD 2016など。)。Clewin5 の関数、ユーザー マニュアル (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual) を参照してください。
注: デザイン ファイルはファイル 1 の補足で利用できます。 - 設計ファイルをマイクロ パターン発生器に転送し、ポジ型フォトレジストで被覆されたクロム マスク ツールを読み込みます。
- マイクロ パターン発生器を使用してパターン領域のポジ型フォトレジストを公開します。
- ポジ型フォトレジストの開発 (材料のテーブル) を使用して開発し、純水 (DI) を使用してマスクをすすいでください。
- クロム エッチング液 (資材表) を使用すると、ポジ型フォトレジストが削除された露出部のクロムをエッチングします。純水を使用してマスクをすすいでください。
- アセトンを使用してマスク上のフォトレジストの残りを削除します。
注: 透明度マスク Cr マスクのための代わりをすることができます。 - きれいなシリコンウェーハを準備 (4 インチ、P(100))、スピン ....
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結果
図 1は、設計とマイクロ流体デバイスの写真を示しています。3 つ並列チャンネル、どのチャネルで 2 が含まれている回転楕円体もいます。チャンネル 1 と 3 は螢光文化のため使用され、チャネル 2 は、回転楕円体。各チャンネルは、PDMS のパターンに設計された台形 microposts で区切られます。Microposts チャネル 2 のハイドロゲルの表面張力によってチャンネル 1 と 3 に漏れを防ぐし、マイクロ28回転楕円体と比較との間の物質の交換を許可します。
図 7 aは、細胞播種後マイクロ流体デバイスの中心を示しています。明視野/蛍光画像の 0 日目に撮影したフィブリン ゲルは、チャンネル 1、3 に、ヌケモレなくチャンネル 2 のみを充填し、比較はフィブリン ゲルの側壁に.......
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ディスカッション
過去のレポート表示 hLFs がカクテル アンジオポエチン 1、アンジオジェニン、肝細胞増殖因子、増殖因子-α、腫瘍壊死因子といくつか細胞外マトリックス蛋白質29、変換など、複数の血管新生因子を分泌します。 30です。この試金は hLFs 共回転楕円体法の制限である内から血管新生の分泌に依存しています。したがって、培養スフェロイドと Huvec チャンネル 1 と 3 の間の距離を短縮できるよう、井戸の底で共回転楕円体を設定する安定した血管形成のため重要です。線維芽細胞から血管の長さは短い距離は安定した血管形成有利である血管内皮細胞および線維芽細胞の31日間の距離に反比例します。ただし、有害なチャンネル 1 と 3 に開くと回転楕円体の穴 (直径 1 mm) にチャネル 2 の最小の幅 1.5 mm であった。
回転楕円体は、井戸の底で一段落、血管根時折 microposts またはマイクロ チャネル (
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
この作品は、CREST 科学技術振興機構 (許可番号 JPMJCR14W4)、社会のための科学振興) 費 (許可番号 25600060、16 K 16386) 文部科学省からキー評価技術の開発に焦点を当てたプロジェクト、科学技術振興機構からイノベーション プログラムのセンターによって支えられました。医学研究・開発、アメッド、みずほ財団法人科学振興財団日本代理店。微細加工は京都大学ナノ技術ハブによって支えられました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| AZP 1350でコーティングされたクロムマスク。 | クリーン表面技術 | CBL2506Bu-AZP | |
| マイクロパターンジェネレータ | ハイデルベルク | uPG101 | |
| MF CD-26開発者 | ロームとハース電子材料 | - | プロトコル1.4 |
| S-クリーン | 佐々木化学 | S-24 | クロムエッチング液プロトコル1.5 |
| ストン | 和光 | 012-00343 | |
| シリコンウェーハ | カノーシス | SiJ-4 | |
| スピンコーター | MIKASA | 1H-D7 | |
| ヘキサメチルジシラザン (HMDS) | 東京応化工業 | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem-Negative | フォトレジスト in protocol 1.9 | |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | プロトコール1.13 |
| 2-プロパノール | ワ | コー163-04841 | |
| 表面プロファイ | ラーVeeco | Veeco Dektak XT-S | |
| (トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン | シガンシグマ | 448931 | |
| ポリジメチルシロキサン(PDMS) | ダウコーニング東レ | 184W / C | |
| 生検パンチ(1.0mm) | 貝印工業 | BP-10F | |
| バイオプシーパンチ (2.0mm) | 貝印工業 | BP-20F | |
| プラズマシステム | フェムトサイエンス | COVANCE | |
| カバーガラス | 松波ガラス | C024241 | |
| 培養皿 | いわき | 1000-035 | |
| RFP 発現ヒト臍帯静脈内皮細胞 | アンギオプロテオミー | cAP-0001RFP | |
| 正常ヒト肺線維芽細胞 | ロンザ | CC-2512 | |
| 内皮細胞増殖培地 | ロンザ | CC-3162 | |
| 線維芽細胞増殖培地キット | ロンザ | CC-3132 | |
| DMEM | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 11965092 | |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 26140079 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 | 和光 | 168-23191 | |
| 0.05w/v% トリプシン-0.53mmol/l EDTA• フェノールレッド | 和光 | 204-16935 | |
| PBS(リン酸緩衝塩) | タカラバイオ | T900 | |
| 96ウェルプレート | 住友ベークライト | 631-21031 | |
| 1000ul | チップ NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul チップ | NIPPON ジェネティクス | FG-301 | |
| 10ul チップ | NIPPON ジェネティクス | 37650 | |
| CO2インキュベーター | サーモフィッシャー サイエンティフィック | モデル 370 | |
| GFP 発現ヒト臍帯静脈内皮細胞 | アンギオプロテオミー | cAP-0001GFP | |
| ウシ血漿由来フィブリノーゲン | シグマ | F8630 | |
| ウシ肺由来アプロチニン | Sigma | A6279 | |
| コラーゲンI | コーニング | 354236 | |
| ウシ血漿由来トロンビン | Σ | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | プロトコール5.5 |
| パラホルムアルデヒド溶液 | 和光 | 163-25983 | |
| 倒立蛍光顕微鏡 | オリンパス | IX71 | |
| デジタルCCDカメラ | オリンパス | ORCA-R2 | |
| 共焦点レーザー走査型生物顕微鏡 | オリンパス | FV1000 | |
| 倒立蛍光顕微鏡 | オリンパス | IX-83 | |
| フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン | シグマ | FD70S |
参考文献
- Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10),....
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