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Summary

このプロトコルにより、腸管病原体の付着、細胞外高分子物質マトリックス形成を評価することによって細菌のバイオ フィルムの動的な性質をキャプチャする多面的なアプローチを使用しての胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成を分析するリーダー分散。

Abstract

バイオ フィルム形成は、過酷な環境条件やストレスの時代下で細菌が発生するダイナミック ・多段階のプロセスです。胃腸管内輸送中と胆汁の露出、人間の消化の法線成分に腸内病原体の重要なストレス反応が誘起されます。胆汁の殺菌効果を克服するためには、多くの腸病原体は、小腸を通過するときに生存を許可するいると仮定バイオ フィルムを形成します。固相の付着試金と同様に細胞外高分子物質 (EPS) マトリックス検出と可視化によるバイオ フィルム形成を定義するための方法論をご紹介します。さらに、バイオ フィルム分散評価が感染プロセス中に細菌のリリースをトリガーするイベントの解析を模倣するように表示されます。クリスタル バイオレット染色、高スループット 96 ウェル プレートの付着試験で付着性細菌を検出するために使用されます。EPS 生産評価、すなわち 2 つの試金によって決まります顕微鏡 EPS 行列と多糖類の蛍光共役結合レクチンと半定量分析の染色します。最後に、コロニー カウントとめっきによるバイオ フィルムの分散を測定します。複数のアッセイから肯定的なデータは、バイオ フィルムの特性をサポートし、他の菌株による胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成を識別するために利用することができます。

Introduction

バイオ フィルム形成は、過酷な環境条件の中に誘起される重要な細菌の生存戦略です。殺菌の化合物への露出のように抗生物質や栄養の変化または酸素可用性がバイオ フィルム形成によって軽減することができます細菌のストレス状態を誘導します。バイオ フィルムは、サーフェスまたは他の細菌に細菌の付着によって特徴付けられるし、多糖類^1,2,3の主にで構成される EPS 行列の分泌を伴います。バイオ フィルム形成はダイナミックなプロセスでイベントのカスケード成熟した付着性を有する細菌群集^1,2,3の形成で絶頂に達する。細菌アドヘシン成熟バイオ フィルムの中に添付ファイルを強化する付着性遺伝子発現プロファイルをシフトさせながら初期添付ファイルを容易にするを生成します。同時に、EPS の生産は初期のストレスから細胞を保護するために行列に細菌群集のコートに発生します。バイオ フィルム内の細菌は、成長が遅い。そのため、レンダリングのほとんどの抗生物質は効果がないと。さらに、低成長は、細菌の増殖^1,2,3を支持する条件を変更するまで、エネルギーを節約します。過酷な条件が過ぎた後、細菌はバイオ フィルムを分散し、浮遊性ライフ スタイル^1,2,3を再開します。従来、バイオ フィルムは表面に観察される、感染貯水池カテーテルと住居のデバイス^1,2,3に存在のための永続的な臨床的課題を表します。

バイオ フィルム形成最近述べたいくつかの腸病原体;小腸または結腸⁴感染細菌。赤痢菌種、の感染は人間のコロンの消化管の大部分を通過後に発生します。小腸を通過、中に赤痢菌が胆汁; にさらされています。同時にほとんどの細菌⁵を殺しながら、脂質の消化を容易にするために腸に分泌される脂質分解洗剤です。腸内の病原体は、胆汁⁶の殺菌の効果に抵抗するユニークな能力を持っています。私たちの最近の分析は生体内で活用-グルコースとs. 菌で堅牢なバイオ フィルム形成を示すため胆汁酸塩の組み合わせだけでなく、赤痢菌、病原性大腸菌、およびの他の種のようにサルモネラ⁴。以前は、サルモネラ血清型慢性感染症^7,8,9,中に胆嚢のユニークな植民地化のため胆汁によるバイオ フィルムを形成する発疹チフスを示した¹⁰.¹¹ビブリオカンピロバクター¹²先行研究が胆汁に対するバイオ フィルム形成を実証するさらに、します。したがって、分析は他の病原体に胆汁によるバイオ フィルム形成観察を拡張、胆汁に保存された腸内病原体応答のデモを確立するのに役立ちます。慢性的なバイオ フィルム細菌の遺伝子の転写は限られているし、細胞老化は^1,2,3を発生することが, とは異なり腸胆汁によるバイオ フィルムがより本質的に一時的である提案します。この過渡病原性バイオ フィルムはように品質証明され急速な分解 (分散分析で見られる) と、バイオ フィルムの人口^4,6で観察された病原性遺伝子発現を強化します。 

バイオ フィルム形成は多面的なダイナミックなプロセス、および胆汁酸塩の使用開始因子が最近最も腸内病原体の説明だけされて、ツールやテクニックを使用は、従来の方法のユニークで創造的なアプリケーションです。したがって、ここでは胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成、バイオ フィルムから細菌付着、EPS 行列の生産と生菌数の分散を含むいくつかの重要な特徴を定量化するための 3 つの無料戦略。これらのテクニックは、赤痢菌の研究に主に利用されています。したがって、他の腸管病原体の評価が最適化を必要とします。それにもかかわらず、3 つすべてのアッセイから肯定的なデータはバイオ フィルムの識別をサポート、胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成の再現可能なプロトコルを確立します。

Protocol

1. 試薬の調製 胆汁酸塩培地: トリプシン大豆スープ (TSB) 0.4% の胆汁酸塩 (重量/体積) を含むを準備、50 mL の胆汁酸塩 200 mg を再懸濁しますオートクレーブ TSB。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。毎週新鮮な媒体を作る。ノート: 定期的に使用される胆汁酸塩は、コール酸ナトリウムと羊や牛の胆嚢から分離されたデオキシ コール酸ナトリウムの 1:1 混合物です。先ほど説明した4グルコースの存在が胆汁酸塩によるバイオ フィルムの形成のため必要でした。TSB がルリア ベルターニカミラ (LB) のスープを基準にしてグルコースを追加します。したがって、赤痢菌分析その他の腸内の病原体のバイオ フィルム形成を誘導するのに十分だったし、。分析する細菌によって別グルコース濃度または別の砂糖の要件が必要な場合があります。 0.5 水に %w/v クリスタル バイオレット: 500 ml の蒸留水でクリスタル バイオレットの 2.5 g を溶かします。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。 コンカナバリン A (ConA) かに (FITC) に共役: 1 × PBS で株式を再構成します。集中 10 mg 株式を 25 μ G/ml の最終的な集中に 1 × PBS の 400 μ l を希釈し、光から保護します。 PBS + ブドウ糖: 10 mL の 1x PBS (最後の血糖値 2 w/v) で 0.2 グラムのブドウ糖を溶解します。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。使用の日に新鮮なを確認します。 PBS + 胆汁酸塩: 溶解 10 mL の 1x PBS で 40 mg (0.4% 胆汁酸塩最終的な w/v)。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。使用の日に新鮮なを確認します。 PBS + グルコースと胆汁酸塩: 40 mg 胆汁酸塩と 10 mL の 1x PBS (0.4 %w/v 胆汁酸塩および 2 %w/v グルコース最終) の 0.2 グラムのブドウ糖を溶解します。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。使用の日に新鮮なを確認します。 LB 寒天培地プレートを準備します。 ホルムアルデヒド ・ グルタルアルデヒド修正: 追加 810 μ L のホルムアルデヒド (37% 原液、最終濃度 3%) および 125 の μ L グルタールアルデヒド (25% 原液、最終濃度 0.25%) 14 mL の 1x PBS。徹底的にミックスし、4 ° C で保存修正プログラムは、適切な使用のため寒いはずです。注意: この修正プログラムは毒性があり有害廃棄物処理が必要です。 Antifade フィルターとフィルター ソリューション: 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 汚れを含む antifade フィルターとフィルター ソリューションを使用して、細菌の DNA を蛍光染色しながら蛍光顕微鏡観察試料の変質を阻害します。 2. 細菌の準備 無菌培養管の単一、独立した植民地と TSB の 3 mL を接種によってテストする細菌の緊張の一夜の文化を育てます。37 ° C で一晩インキュベート (16-24 h) の 225 rpm で振とうしながらインキュベートします。注: 系統必要がありますされる restreaked 冷凍庫株からすべて 2 4 週間とに上で保持板にない 2 週間以上古い。 3. 固相付着試験 注: このアッセイは、96 ウェル プレート法を用いた細菌の付着を定量化します。細菌は、底が平らなプレートに静的に栽培しています。洗濯を行って非付着細菌を排除して細菌付着がクリスタル バイオレットで染色します。水晶バイオレットの汚れは細菌の細胞壁のペプチドグリカンをバインドし、エタノールを用いた可溶化します。付着性細菌の数は、クリスタル バイオレットの保持に基づいて決定されます。 2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + 胆汁酸塩 (BS) とラベルを付けます。 それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。 一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 で希釈)。 滅菌、クリア、平底、組織培養治療 96 ウェルのプレートで空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 130 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。3 つのコントロール井戸 (TSB、TSB + BS) テストする各メディアの種類の設定します。 3 つの井戸に接種した培の 130 μ L/ウェルを追加し、3 通すべての実験条件をめっきまで繰り返します。 静的に 37 ° C で 4-24 時間インキュベートします。 プレート リーダーを使用して、外径600を記録します。’Blank’ として制御井戸を設定します。濁度の証拠と明確な制御媒体を確認します。任意の濁度が検出された場合は、実験を破棄します。菌株間の成長率に有意差がある場合、データを正規化する外径 φ600の値を使用できます。 プレートを軽く傾斜して井戸の下の端にある媒体をゆっくり吸引真空ラインを使用して培養液を削除します。必ずプラスチックの表面に位置する付着性細菌の人口を中断させることがなくすべての培養液を収集してください。EPS の行列は、培養時間の間に作り出されたマトリックスが白い沈殿として視覚化されます。EPS マトリックスを操作不可します。 軽く 200 μ L 滅菌 PBS で 1 回洗浄します。真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。 乾燥するプレートを反転します。乾燥する 20 分の最小値を許可します。注: バイオ フィルムを染色する前に完全に乾燥する必要がありますので、プロトコルは、数時間のこの段階で一時停止また更に夜通し。不完全な乾燥結果と再現性の定量化に影響を与えます、追加乾燥時間は汚損プロシージャに変わりません。 まあ 150 のそれぞれ実験的に 0.5% クリスタル バイオレットの μ L とコントロールを追加します。 室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。 一度蒸留水 400 μ L で洗浄します。追加されたボリュームは、井戸の側面から残留クリスタル バイオレット染色を削除するのに役立ちます。真空ラインの洗浄を削除します。 蒸留水を 200 μ l 添加で 5 回洗浄します。真空ラインの洗浄を削除します。メモ: 徹底的に洗浄は、定量化のため重要です。空白の井戸が蒸留水から明らかが、任意の残留クリスタル ・ バイオレットの汚れが含まれていないときは、次の手順に進みます。 光から保護、乾燥するプレートを反転します。前述のようにプレートの完全乾燥を確認します。 95% エタノール 200 μ L で井戸をすすぐ。30 分間、シェーカーでプレートを孵化させなさい。特に高温で蒸発を避けるために 4 ° C でこの手順を実行します。 プレート リーダーを使用して、外径540を記録します。注: クリスタル ・ バイオレットの最大吸収波長は近く 590 nm。文献報告から外径540 – 外径5954,13,14,15,16クリスタル バイオレット吸光度の範囲このようにプレート リーダーに基づいて使用可能な波長を選択します。 4. EPS マトリックス検出 注: これらの無料試定量化し、EPS を可視化します。どちらも、多糖類をバインドするレクチンを用いた EPS が検出されました。蛍光共役タンパク質により定量化 (手順 4.1) か (ステップ 4.2) の可視化ができます。 EPS の半定量的検出 2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + BS 付きのラベル。 それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。 一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 希釈)。 滅菌、黒、平底、組織培養治療 96 ウェルのプレートで空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 130 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。テストする各メディアの種類の 3 つのコントロールの井戸を設定します。接種した培の 130 μ L/ウェルを井戸に追加し、3 通すべての実験条件をめっきまで繰り返します。 静的に 37 ° C で 4-24 時間インキュベートします。 培養液を理想的にマルチ チャンネル ピペット ピペットを明確 96 ウェル プレートに転送します。付着性の人口および/またはプラスチックの表面に位置する EPS を中断させることがなくすべての培養液を収集するために慎重になります。脇を設定します。 1x PBS で 200 μ L/ウェルのホルムアルデヒド ・ グルタルアルデヒドを用いた常温 15 分用黒色プレートを修正します。 付着性の人口を固定すると、ステップ 4.1.6 から上清画分と評価します。プレート リーダーを使用して、外径600を記録します。’Blank’ として制御井戸を設定します。濁度の証拠と明確な制御媒体を確認します。任意の濁度が検出された場合は、実験を破棄します。 また、黒い透明な底板の全体の分析を実行できます。このような状況で OD600の値を記録することができ、4.1.7 をステップに進む前にその後培養液を破棄できます。外径600値をデータの正規化に使用できます、場合に菌株間成長率に有意差があります。 修正プログラムを削除し、有害廃棄物の処分します。 200 μ L/ウェル滅菌 pbs で 2 回井戸を優しく洗います。プレートを軽く傾斜して井戸の下の端では、洗浄をゆっくり吸引真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。 25 μ g/mL、ConA FITC の 150 μ L/ウェルを追加し、室温に 15 分間インキュベート 200 μ L の PBS で 2 回やさしく洗います。 150 μ L の PBS を各ウェルに加えます。488 で蛍光を記録 nm。 共焦点顕微鏡可視化 EPS 生産とバイオ フィルムの厚さの計算 2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + BS 付きのラベル。 それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。 一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 で希釈)。 滅菌ガラス coverslips ラウンド 12 mm 滅菌 24 ウェル プレートを設定します。空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 400 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。テストする各メディアの種類の 3 つのコントロールの井戸を設定します。 、重複での井戸に接種文化の 400 μ L を追加し、すべての実験条件をメッキまで繰り返します。 静的に 37 ° C で 4-24 時間インキュベートします。 TSB 条件、成長および EPS 沈殿物 (白) TSB + BS 状態で成長ない成長および滅菌コントロール ウェルズに白い沈殿物を視覚的に確認します。培養上清を削除します。 1x PBS でのホルムアルデヒド ・ グルタルアルデヒド溶液 200 μ L/ウェルを使用して RT で 15 分を修正しました。 修正プログラムを削除し、有害廃棄物の処分します。 200 μ L/ウェル滅菌 pbs で 2 回井戸を優しく洗います。真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。 25 μ g/mL ConA FITC の 150 μ L/ウェルを追加し、室温に 15 分間インキュベート 軽く 200 μ L/ウェルの PBS で 2 回洗います。 DAPI と antifade フィルターとフィルター ソリューションをマウントします。注: ソリューションは、同時に、対比染色として、可視化細菌の細胞内の DNA を染色しながら蛍光ラベルを保持するために DAPI を含む既製、グリセリン ベース マウント ソリューションです。イメージングのサンプルの前にインキュベーション時間のキットの方向と推奨事項に従ってください。DAPI が含まれていない antifade フィルターとフィルター ソリューションを適用する前に、プロシージャを汚す DAPI を実行できます。 共焦点顕微鏡による評価します。共焦点顕微鏡レーザーを 495 nm/519 nm 励起/蛍光 FITC 可視化のために設定します。2 番目のレーザーを 360 nm/460 nm 励起/蛍光 DAPI を視覚化するために設定します。DAPI チャネルに焦点を当て、バイオ フィルムを探します。DAPI と FITC の両方のチャンネルを使用して完全な厚さを判断して上限を設定し、罫線を下部イメージングします。Z スタックの上下に境界を設定した後すべての 0.25 μ m の画像をキャプチャすることにより完全な厚さ Z スタック画像を記録します。共焦点顕微鏡の詳細についてを参照してください文書パドックらによって17,18,19,20 ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) によるバイオ フィルム形成を視覚化し、バイオ フィルムの厚さを計算で 3 D 画像を再構成します。S. 菌胆汁酸塩によるバイオ フィルムの取得平均厚さ 14 μ m4であった。 5. 分散分析 注: このアッセイでは、バイオ フィルム細菌の分散性を介しての逆アセンブリが検出されます。ここでは、成熟したバイオ フィルムが確立され、その後 (通常翌日)、メディア、PBS に置き換えられますまたは PBS を添加しました。培養上清中のコンポーネントをバイオ フィルムから分離した細菌の数を量的に評価します。 2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + BS 付きのラベル。 それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。 一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 で希釈)。 滅菌、クリア、平底、組織培養治療 96 ウェルのプレートで空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 130 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。テストする各メディアの種類のための 3 つのコントロール井戸を設定します。 3 つの井戸に接種した培の 130 μ L/ウェルを追加し、すべての実験条件が 3 通でメッキまで繰り返します。 37 ° C で 4 24 h のプレートを静的にインキュベートします。 前に、PBS、PBS + ブドウ糖、PBS + 胆汁酸塩と PBS + 胆汁酸塩 + 37 ° C にグルコースを暖めるこれらの試薬の新鮮な毎日を準備します。 プレート リーダーを使用して、外径600を記録します。’Blank’ として制御井戸を設定します。濁度の証拠と明確な媒体を確認します。任意の濁度が検出された場合は、実験を破棄します。菌株間の成長率に有意差がある場合、データを正規化する外径 φ600の値を使用できます。 真空ラインを使用して培養液を削除します。必ずプラスチック表面に付着性の人口を中断させることがなくすべての培養液を収集してください。 200 μ L/ウェル滅菌 pbs で 2 回井戸を優しく洗います。真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。 3 つの井戸に次の 130 μ L/ウェルで洗浄を置き換えます: PBS、PBS + ブドウ糖、PBS + 胆汁酸塩と PBS + 胆汁酸塩ブドウ糖。これらの試薬は、あらかじめ 37 ° C に加温する必要があります。 37 ° C で 30 分の版を孵化させなさい 37 ° C の定温器からプレートを慎重に取り外します。新鮮な生殖不能の 96 ウェル プレートに培養上清を転送します。 96 ウェルのプレートまたは希釈のブロックを使用して準備を 10 倍 (1:10) 滅菌 PBS に上澄みのシリアル希薄。注: 希釈系列ではテストする菌株によって 10-6原液から範囲する必要があります。パイロット実験は、最適な希釈範囲を決定する実行できます。 スポットは、マルチ チャンネル ピペットを使用して LB 寒天培地の上にそれぞれの希釈の 5 μ L をプレートします。37 ° C で一晩インキュベートします。回復コロニー (CFU) の単位を形成を決定する際、翌日と希釈倍率のアカウントにコロニーを数えます。(100% で設定) PBS コントロール x 1 基準 % 分散を計算するには、1 × PBS コントロールのサンプルから CFU の回復によって各処理条件から回復 CFU を割ります。注: 興味の細菌の緊張のためのルーチン メディア プレートを使用もできます。たとえば、赤痢菌は、コンゴ赤板にめっきすることが。プレートが適切なスポットめっき技術の乾燥を確認します。

Representative Results

図 1、胆汁酸塩を含んでいる媒体で六つの腸病原体テスト次の成長のほとんどのバイオ フィルム形成が誘導されます。付着性細菌の胆汁酸塩の露出はほぼすべての株で観察される後の大幅な増加をテストしました。例外は絋エシェリヒア属大腸菌(EAEC);ただし、Δaaf変異4の誘導の観察。結果を示すこと追加接…

Discussion

バイオ フィルム形成の分析は、バイオ フィルムとアッセイ研究所、材料株間変動の動的な性質のために挑戦です。ここでは、再現性を促進するために提供される実験的洞察力と胆汁酸塩の露出に続く腸管病原体のバイオ フィルム形成を決定するいくつかの方法が掲載されています。再現性を確保するための追加の考慮事項があります。第一に、それぞれの観測と発生する変動の統計的有意?…

Materials

Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
Crystal Violet	Sigma	C6158-50
Concanavalin-A FITC	Sigma	C7642-10mg
Glucose	Sigma	G7021-1KG
Bile Salts	Sigma	B8756-100G
LB Agar	Sigma	L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile	Fisher	14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635-500
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear)	TPP	92696
Flat-bottomed 96-well plates (black)	Greiner Bio-One	655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear)	TPP	92424
Glass coverslips 12mm, round	Fisher	08-774-383
96-well plate reader	Spectramax
Flourescent plate reader	Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope	Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator	New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator	Thermolyne Series 5000