マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

サマリー

ここで潜在的な糖尿病誘発異物化学物質を識別するために、化学物質によって ROS の帰納法をスクリーニングするためのマウスの膵島細胞を分離するためのプロトコルを提案する.

要約

人間や動物の特定の環境化学物質への暴露は、2 型糖尿病 (2 型糖尿病) の開発につながる膵臓 β 細胞の細胞損傷を引き起こす発見されています。化学的に誘導 β 細胞障害のメカニズムが明白でなく、複雑になる可能性があります、1 つの定期的な発見は、これらの化学物質への損傷を引き起こす過剰な活性酸素種 (ROS) の生成につながる酸化ストレスを誘発します。β 細胞。C57bl/6 マウスの膵島細胞および 96 ウェルの細胞培養プレートに培養膵島細胞は、潜在的な糖尿病誘発環境化学物質を識別するに分離されました。膵島細胞が化学物質を投与し、2', 7'-ジクロルフルオレッセン (DCFH-DA) 蛍光色素による活性酸素生成が検出されました。このメソッドを使用すると、我々 は [] ピレン (BaP) やポリ塩化ビフェニル (Pcb) そのビスフェノール A (BPA)、ベンゾを発見、彼らは潜在的膵島細胞の損傷を引き起こす可能性があります示唆 ROS の高レベルを引き起こすことができます。このメソッドは、糖尿病誘発物質をスクリーニングするために役立ちます。さらに、培養された膵島細胞膵臓細胞に毒性を化学的に誘導の in vitro解析の適応もあります。

概要

2 型糖尿病の有病率の増加は、近年公衆衛生¹に深刻な脅威に地球規模の健康危機をなっています。多くの要因が見つかっている間、2 型糖尿病の開発にリンク作因的に定期的な示唆これらの要因の 1 つの一般的な収束点である過剰な活性酸素²の世代につながる酸化ストレス誘導^,3。

Pcb、ダイオキシン、BaP など環境化学物質の広いスペクトルは、膵 β 細胞の機能を損なうし、インスリン抵抗性と 2 型糖尿病⁴につながる可能性のある酸化ストレスを誘導するために発見されています。活性酸素の生理学的なレベルでは、細胞機能に重要な役割を果たしている、抗酸化システムの容量を超える ROS への暴露細胞/組織に損傷の結果、⁵疾患に 。膵 β 細胞抗酸化酵素の低レベルを表現、従って酸化ストレスを介した損傷^6、7のための敏感なターゲット。ストレスによる膵細胞機能不全⁵が発生する活性酸素の高レベルへの慢性露出が示されている⁸の肝臓や脂肪組織でのインスリン抵抗性と同様。

このプロジェクトの全体的な目標は、膵臓の細胞内活性酸素の誘導に基づく彼らの糖尿病誘発電位のスクリーン化学物質に細胞ベースのアッセイを開発することです。膵臓は、代謝解毒を欠いているし、異物による損傷^6,7の重要なターゲットであります。したがって、膵臓細胞で生成された ROS を直接測定することにより、この試金は化学的に誘導膵損傷の直接近似を提供しなければなりません。このメソッドを開発するには、マウス膵ランゲルハンス島の分離、化学物質、細胞培養条件下で分離膵島を培養し、読み出しとして化学誘導活性酸素生成を利用します。この手順はシンプルで孤立した小島に ROS を誘発する化学物質を識別するに効果的膵臓体外に固有の毒性発現機構の解明にはさらに開発できます。

プロトコル

すべての動物実験は、すべての関連するガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行されました。例示されているプロトコルは、指導と承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、テキサス A & M 研究所のゲノム医学の下で行った。

1. ソリューションの準備

1. ダブル蒸留 H₂O, 1 x 10 x ハンクのバランスの取れた塩溶液を希釈し、4 ° C で保存
2. HEPES (10 mM)、MgCl₂ (1 mM)、グルコース (5 mM) を追加して、分離ソリューションを準備します。PH 7.4 に調整して氷の上。
3. コラゲナーゼ タイプ 4 からコラゲナーゼの解決を準備します。
   注:具体的には、コラゲナーゼ タイプ 4 には、乾燥重量の mg 当たり 160 U が含まれています。1 グラム コラゲナーゼ タイプ 4 は 5 mL 二重蒸留 H₂O 200 Mg/ml の濃度で希釈しました。30 mL の氷冷分離ソリューションに希薄のコラゲナーゼの 2 mL が追加され、コラゲナーゼ溶液 6 mL が各マウスの 50 mL チューブに転送されます。
4. 1 mM CaCl₂を分離ソリューションに追加することで洗浄液を準備します。
5. 浄化液の冷たい polysucrose/ナトリウム diatrizoate (1.1119 g/mL、5 mL) を準備します。
6. RPMI 培地への L-グルタミン (20 mM)、(100 U/mL) ペニシリン、ストレプトマイシン (100 μ g/mL)、ウシ胎児血清 (FBS) (10%) の追加によって膵島培養液 500 mL を準備します。
7. 蒸留水 200 μ M で、-20 ° C で店で粉体を溶解することにより DCFH DA 原液を準備します。
   注:染色液ロスたて、DCFH DA RPMI で 5 μ M の最終的な集中に原液を希釈することによって行われます。この試薬は、光から保護する必要があります。

2. 手術の準備

1. 腹腔内注入 (i. p.) タヴェルタン (2.5% タヴェルタン、0.4 mL/20 g) 付きのマウス。マウス麻酔が完全に応答しなくなった後ハインドに足をつまみ、マウスを安楽死させるし、生物のフードに移動します。
2. 腹部側を上に euthanized のマウスを置き、殺菌のための 70% のエタノールで皮膚をスプレーします。
3. 腹部に 1 cm U 切開で腹腔内を開き、腹腔内を公開する胸の上の吻側方向に皮膚を撤回します。

3. 膵灌流と除去

1. 図 1に示すように、乳頭部の場所を見つけます。オディ括約筋の位置の近くに十二指腸をクランプするのにカーブタイプ鉗子のペアを使用します。十二指腸に胆汁経路をブロックするのに十二指腸の壁をクランプするのにカーブタイプ鉗子の別のペアを使用します。
   注:この手順では、乳頭が挿入されていません。この手順は、十二指腸で胆汁の経路をブロックするものです。
2. 頭の近位と遠位研究者に関しての足を使って、マウスの位置を変更します。
3. 総胆管を見つけるし、30 G 針、5 mL 注射器でゆっくりとコラゲナーゼ溶液 3 mL を注入します。総胆管と膵臓注入後膨張していることを確認します。
4. 下降結腸、腸、胃と脾臓から分離するカーブタイプ鉗子と罰金のはさみを使用して膨張した膵臓を削除します。コラゲナーゼ溶液 3 mL を含む 50 mL チューブに膵臓を置く氷の上保管してください。

4. 膵消化

1. 37 ° C の水浴に各 50 mL チューブを配置します。15-20 分間インキュベート (ひずみとマウスの年齢時間異なります)。
2. 渦を使用して管を振動させます。
3. 4-5 大型滅菌シンク ストレーナーの消化膵臓をプール、スクープを使用して、徹底的にバラバラ膵臓。強制的に画面オフ消化細胞をピペットに 23 G 針、10 mL シリンジを含む洗浄液を使用します。50 mL チューブの洗浄ソリューションを収集します。
4. 4 ° c 1 分 97 x g でチューブを遠心し、上清をデカントします。
5. チューブに洗浄溶液 25 mL を追加し、再穏やかなボルテックスによって組織を中断します。4 ° c 1 分 97 x g で組織をスピンし、上清をデカントします。3 回繰り返します。ペレットの組織が外れないように注意してください。

5. 島の精製

1. 洗浄組織ペレットに浄化溶液 10 mL を追加し、軽く内容を再懸濁します。
2. 優しく浄化ソリューションに分離溶液 5 mL をオーバーレイします。2 つのソリューション間の鋭い液体インターフェイスを保つように注意します。
3. 低速の加速と 15 分のための 4 ° C で g x 560 でないブレーキ管を遠心します。インターフェイスにピペットを挿入し、新しい 50 mL チューブに小島層を収集します。
4. 3.5 の手順で説明されているように島を洗います。

6. メッキと膵島細胞の治療

1. 膵島培養液の 10 mL で小島を再懸濁します、ゆっくり、混ぜると、96 ウェル プレートにマルチ チャンネル ピペットを 100 μ L/ウェル。まあ 96 あたり約 5 小島を配置します。
2. 12 h の組織文化のインキュベーターでプレートを配置します。
3. 遠心分離機 (112 x g) の 96 ウェル プレート、培養培地を取り外します。
4. 膵島培養液中の環境汚染物質を希釈します。プレートの別の井戸に化学の希釈剤のそれぞれの 100 μ L を追加します。各ウェル中の小島を再懸濁します、37 ° C (異なる環境化学物質の濃度変化) で 12 時間孵化させなさい。

7. ROS 染色と測定

1. 1x PBS で洗浄小島治療後 (各 96 ウェルの 200 μ L)。
   注:化学物質の濃度は以下の通りです: AFB1: 3 μ M、アトラジン: 100 μ M、BaP: 10 μ M、BPA: 100 μ M, PCB126 β エストロゲン: 10 μ M、ノニルフェノール、ビスフェノール A: 100 μ M。
2. 活性酸素を抑制するのに抗酸化物質として N アセチルのシステイン (NAC) を使用します。ROS 誘起化学希釈剤に NAC の 5 mM を追加し、37 ° C で 12 時間インキュベート
3. 112 x g で 96 ウェル プレートを遠心し、37 ° C, 60 分で蛍光プローブ (H2 DCFH DA RPMI メディアで解散) の 5 μ M 溶液で孵化させなさい。
4. PBS で 3 回処理した膵島細胞を洗浄し、488 のマイクロ プレート リーダーで蛍光を測定 nm。
   注:530 で蛍光性の増加によって測定されるセルの DCF の蓄積サンプルは 488 で興奮すると nm nm。
5. 活性酸素を誘発する異物にグルコース刺激によるインスリン分泌 (GSIS) 試金⁹を実行膵島の生理機能上異物の影響を測定する未処理の島と島を扱われます。

結果

健全な分離膵島の顕微鏡写真に示す図 2小島が (ただし、サイズ均一性ひずみに異なります) サイズを比較的均一に円形または楕円形をしています。次に膵島を分離し、文化島のインスリン分泌を刺激することでの in vitroアッセイにおける膵島機能を調べた。3.3 〜 16.7 mM グルコース⁹による C57BL/6 マウス孤立島から情報科学研究科試金の典型的な分析を図 3に示します。

プレート形式画面メソッドを使用して、膵島細胞 (図 4) で ROS の重要な誘導を引き起こしたいくつかの化学物質を同定しました。Β エストロゲンが膵島を^10、

ディスカッション

環境化学物質への曝露を示唆している証拠の蓄積 2 型糖尿病の開発の重要な役割を果たしています。化学物質による活性酸素は、2 型糖尿病の発展に貢献する潜在的な病因因子として認識されています。人間は、生体異物の化学薬品の広い範囲にさらされている、膵毒性物質を効果的に識別し、膵臓の細胞に固有の毒性のメカニズムを調査する新しい研究技術のための大きい必要があります。

パブリッシュされた手順¹⁴、に基づいて、本研究で我々 は膵細胞への酸化ストレス誘起損傷の生体異物の化学物質と細胞マウスと画面から膵島を分離するためのプロトコルを開発しました。我々 はまた異物化合物による膵の特定の毒性反応を調査するのにこの手順を使用します。マウスから膵臓を取得、血糖値は変わりませんし、膵臓^15,16,17の血管には影響しませんので、他の麻酔上タヴェルタンを使うことが望ましい。密度勾...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10回;ハンクの平衡塩溶液	GIBCO	14185-052
コラゲナーゼ 4型	Worthington Biochemical Corporation	CLS-4
ポリスクロース/ジアトリゾ酸ナトリウム溶液	Sigma	10771
2',7'-ジクロロフルオレセイン (DCFH-DA)	Sigma	D6883-50MG
蛍光マイクロプレートリーダー	Biotek
L-グルタミン	Σ	G8540-25G
ストレプトマイシン	GIBCO	15140148
FBS	GIBCO	26140079
RPMI 1640	GIBCO	11875-085
アバーチン	Σ	T48402-25G
ラット/マウス インスリン ELISA キット	ミリポア	EZRMI-13K
遠心分離機	Sorval	Sorval RT7	96ウェルプレート用 遠心分離
マイクロプレートリーダー	Biotek	Epoch 2	蛍光読み取り用

機