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方法論記事

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

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DOI:

10.3791/57346

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2018年9月12日

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1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

この記事について

サマリー

人間の脳組織から分離脳の毛細血管は、生理学的および病態生理学的条件下でバリア機能を研究する臨床モデルとして使用できます。ここでは、新鮮な人間の脳から脳の毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルを提案する.

要約

脳保護を改善し、脳を扱う脳ドラッグデリバリーを強化する約束を保持する新しい治療上の作戦の開発の重要な生理学的および病態生理学的条件下で血液脳関門の機能を理解、障害。ただし、ひと血液脳関門の機能を勉強するは困難です。したがって、適切なモデルの重要な必要性があります。この点で、人間の脳組織から分離した脳の毛細血管は、できるだけ人間体内の状況に近いとバリア機能を勉強するユニークなツールを表します。ここでは、高収率に一貫した品質と純度で人間の脳組織から毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルについて述べる。毛細血管は、機械の均質化、密度勾配の遠心分離、ろ過を使用して新鮮な人間の脳組織から分離されます。分離後、脳毛細血管のタンパク質発現と機能、酵素活性や細胞内シグナル伝達の研究に漏れの試金、ライブセル イメージング免疫アッセイなど様々 な用途に使用できます。分離脳の毛細血管は、ひと血液脳関門の機能調節を解明するユニークなモデルです。このモデルは、中枢神経系疾患を治療するための治療戦略の開発を助ける中枢神経系 (CNS) の病因に洞察力を提供できます。

概要

血液脳関門は、血液と何が入るし、脳から出てくるを決定する脳の間厳重に管理されたインターフェイスです。解剖学的, 血管内皮細胞は血液脳関門を作成し、複雑で、連続的な毛細血管網を形成します。生理、この毛細血管網は同時に炭酸ガスや代謝の廃棄物を処分しながら脳に酸素と栄養素を供給します。重要なは、証拠は、バリアへの変更が多数の病理学、アルツハイマー病、てんかん、脳卒中1,2,3,4,5などに貢献することをサポートしています,6,7. 脳血管内皮細胞はまた、例えば脳に薬剤の吸収をブロックすることによって治療にバリアとして役立つ、膠腫瘍切除術8,9,を次の化学療法。10. 分離脳毛細血管がバリア特性生体内でバリア機能と健康障害の研究では、これとよく似たユニークな体外血液脳関門モデルを表現するこの点では、疾患。この記事では、一貫して高品質の毛細血管で人間の脳から脳の毛細血管を分離し、血液脳関門の研究をもたらすのためのプロトコルを提供します。

1969 年に Siakotosら。11は、脳の毛細血管密度勾配遠心分離とガラス ビーズ列分離を用いたウシと人間の脳組織からの分離を報告する最初でした。その後、ゴールドスタインら12は、脳毛細血管グルコース輸送の代謝活性を維持しながら、ラットから分離された研究に必要な組織の量を削減する複数の濾過手順を追加することによってこの方法を改善しました。その後、研究者は何度もキャピラリー分離手順を最適化し、各イテレーション13,14,15法と脳毛細血管モデルを改善します。たとえば、Pardridgeら。16機械の均質化ではなく、酵素消化を使用して牛の毛細血管を分離し、210 μ m のメッシュ フィルターとガラス ビーズの列を介して毛細血管の懸濁液をその後渡されます。これらの変更は、分離脳毛細血管のトリパン ブルー色素排除汚れを改善し、したがって、内皮細胞生存率を増加します。1990 年代初頭にダレールら。17は、γ - グルタミルトランスフェラーゼ (γ-GTase) およびアルカリホスファターゼの代謝活性を維持され神経汚染の明確なウシおよびラットの毛細血管を分離しました。2000 年、ミラーら。18毛細血管の内腔に輸送基質の蓄積を共焦点顕微鏡との組み合わせでラットとブタ脳毛細血管を使用しました。その後、当研究室は、脳毛細血管分離手順を最適化するために続けているし、P-糖タンパク質 (P gp)19,20,21, 乳癌を決定する輸送アッセイを設けて抵抗蛋白質 (BCRP)22,23日、多剤耐性蛋白質 2 (Mrp2)24交通活動。2004 年、我々 は様々 なシグナル伝達経路を調査するラット脳毛細血管を用いて 2 つのレポートを公開しました。ハルツら。21、そのペプチドのエンドセリン 1 急速かつ可逆的減少 P gp トランスポート機能 (PKC) エンドセリン受容体 B (エB) 受容体、一酸化窒素合成酵素 (NOS) および蛋白質キナーゼ C を介して作用することにより脳の毛細血管でわかりました。バウアーらで19、我々 は核内受容体有する X レセプター (PXR) の発現と脳の毛細血管で P gp 式とトランスポート機能の示した PXR 変調を実証しました。遺伝子組換えヒト PXR マウスでの実験、研究のこのラインを拡大し、体内バリアにより骨折 P gp hPXR 活性化25まで引き締めを示した。2010 年にハルツら。26 P gp タンパク質発現を復元し、トランスポート ノザン ハップ トランスジェニック人間アミロイド前駆体タンパク質 (ハップ) マウスの動作このアプローチを使用します。また、ハップの P gp を復元するマウス大幅削減アミロイド β (a β)40と a β42の脳レベル。

シグナル伝達経路を検討するほか、分離脳の毛細血管は毛細血管漏出として参照する毛細血管の透過性の変更を確認する使用できます。特に、テキサス赤の漏出試金は、時間とこれらのデータで毛細血管の内腔からテキサス赤は漏洩率を分析に使用し、蛍光色素の漏出を評価するために使用されます。コントロールの毛細血管からのそれらと比較して増加した毛細血管漏出率は、血液-脳関門2の物理的な整合性の変化を示します。バリア、例えばに関連付けられている多くの病気の状態があるので、これは貴重な、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、外傷性脳傷害27,28,29、。 30です。他のグループはまた蛋白質の表現、蛋白質31,32,33,34,の輸送活性を調節するシグナル伝達経路を識別する孤立した毛細血管を利用します。 35,36,37。最後に、人間の脳の毛細血管を分離するためこのメソッドを最適化してまいりましたし、最近、我々 はてんかん発作のない制御個人38 に比べて患者におけるひと血液脳関門で P gp 発現の増加を示した.一緒に取られて、これらの開発は、分離脳の毛細血管がバリア機能を勉強する汎用的なモデルとして使用できることを示します。

様々 な体外体内、および体外血液脳関門モデルの基礎研究および産業創薬スクリーニング、脳39,報40,41 への薬物送達をテストの目的で主に使用されています。 ,42,43,44。脳毛細血管分離前のヴィヴォに加えてには現在血液脳関門モデル、インシリコモデル、分離脳毛細血管内皮細胞の様々 な由来不死化細胞株の in vitro細胞培養種の培養脳内毛細血管内皮細胞とマイクロ流体チップのモデルに区別するひと多能性幹細胞 (hPSC) の文化。

インシリコモデルは、予測吸収、分布、代謝、排泄 (ADME) プロパティに基づく新薬候補を選択するため医薬品開発で最も一般的に使用されます。定量的構造物性相関 (QSPR) モデルなど量的な構造活動関係 (QSAR) モデル メソッドは、脳浸透薬剤の候補者を予測するライブラリの高スループット スクリーニングで使用される人気のあるメソッド45,46. これらのモデルは、バリア貫通性の分子を画面に便利。

ベッツら47は、体外血液脳関門モデル システムとしての培養脳内毛細血管内皮細胞の単分子膜を設立しました。人間の脳微小血管内皮細胞 (hCMECs) など新鮮な組織や不死化血管内皮細胞を用いて細胞文化モデルの in vitro脳浸透または機構研究のための別の高スループット スクリーニング ツールをすることができます。ただし、脳毛細血管内皮細胞培養モデル毛細血管の内腔内の血流の生理学的な剪断応力がない、全体的な生物学的複雑さに限られている、重要なバリア成分の発現や局在の変化を受けタイト結合タンパク質など表面の受容器、トランスポーター、酵素、イオン チャンネルは48,49,50。逆に、内皮細胞膜に由来する hPSCs hCMEC/D3 の文化と比較して低糖透磁率がある、いくつかの血液脳関門輸送、接着分子、タイトな接合51,の偏光式が含まれて52です。 しかし、これらの細胞も文化でのプロパティの変更は、体内バリアのプロパティ52・のシステムを検証する必要があります。

血液脳関門の研究の新しい動向、マイクロ流体デバイスを生成する臓器・ オン ・ チップ技術を使用してまたは中空繊維技術53,を利用した人工の毛細血管を作成する 3 D 培養システムを利用54,55。 人工の毛細血管、脳毛細血管 (3-7 μ m) よりも大幅に大きい直径 (100-200 μ m) があります。したがって、せん断力、体外で完全に似ていない体内状況。これは、"blood-brain-barrier-on-a-chip"マイクロ流体デバイス、マイクロ流体せん断力を生成するこれらのデバイスを人工膜フォームの「血」と「脳」のコンパートメントと流体を励起しているに扱われます。同様に、アストロ サイトのさまざまな組み合わせで血管内皮細胞や血管平滑筋細胞の共培養もで使用されている中空繊維技術体内条件56下の粘弾性パラメーターを再作成するには,57,58です。 ただし、わかりにくい方法もこのモデルは血液脳関門輸送、代謝、シグナル伝達、などなどの他のプロパティを反映します。これらの人工毛細血管とチップのモデルは薬の高スループット スクリーニングに適したが、文化の中に、これらのモデルを生成するために使用するセルが予告なく変更も。

冷凍と固定脳スライスまたは原発性脳毛細血管内皮細胞の文化は人間の血管を研究5,59,60,61に使用することができます追加のモデル。たとえば、固定脳組織の免疫組織化学を使用して蛋白質のローカリゼーションを決定、健康式は病気にかかったティッシュと比較します。

組織スライスとの in vitroモデルに加えて上記、新鮮な分離脳の毛細血管は血液脳関門の機能を研究する利用できます。この孤立した毛細血管モデルの制限新鮮な人間の脳組織を取得する難しさを含んで比較的時間のかかる分離プロセスと神経細胞、アストロ サイトの不在。分離脳毛細血管モデルの利点は、このモデル体内状況を密接に似ているし、したがって、バリア機能不全の評価に使用できます。重要なは、試金および分子生物学手法3,19,,6263の多数を使用してシグナルを見分けることも使用することができます。

加齢に関するサンダース ブラウン センターを介して両方の生鮮、冷凍人間の脳組織へのアクセス研究室 (IRB #B15-2602-M)64。このコンテキストで解剖標準プロトコルに従う、脳には求め < 4 h、およびすべての手順は NIH ラット ベスト プラクティスのガイドライン65に適合。人間の脳組織へのこのユニークなアクセスを与えを設置し、そのまま、実行可能な人間の脳の毛細血管の高収率の結果人間の脳から脳の毛細血管を分離するためのプロトコルを最適化します。関心の 2 つの一般的なエンドポイントは、タンパク質の発現と活性を決定します。この点で、我々 と他の蛋白質の表現および活動レベルを勉強する分離脳の毛細血管で使える様々 なアッセイを設けてください。これらのアッセイは、西部にしみが付くこと、シンプルなウエスタン アッセイ、酵素免疫測定法 (ELISA)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)、ザイモグラフィー、輸送活動のアッセイと毛細血管漏出試金。これらの試できる研究者が人間の病理学的条件でバリア機能の変化を研究、蛋白質の表現や活動を支配する経路を決定する、関連付けられている血液脳関門の治療のための薬理学的ターゲットを特定するには病気。

一緒に、新鮮な分離脳の毛細血管は血液-脳関門の堅牢かつ再現可能なモデルとして利用できます。特に、このモデルは、さまざまなバリア機能を勉強するエンドポイントを決定する多くの異なるアッセイと組み合わせることができます。

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プロトコル

以下の情報は、現行の安全およびケンタッキーの大学, レキシントン、ケンタッキー、米国で規制の基準に基づいています。安全対策として人間の組織で作業する前に機関の生物学的安全プログラムと最新の規則と推奨事項を参照してください。

注意: 人間の組織は、ひと免疫不全ウイルス (HIV)、B 型肝炎ウイルス (HBV)、C 型肝炎ウイルス (HCV) を含む血液媒介病原体の源をすることができます。人間の組織での作業血液媒介病原体からの感染リスクがあります。したがって、研究者を保護するために人間の組織を操作するとき、特定の規制や安全性は不可欠です。米国における人の組織のバイオ セーフティ レベル 2 の実験室と同様、安全上の注意と NIH のセクション IV B 7、1970年句 5(a)(1) とユーザーの制度的生物学的安全性プログラムの OSHA の法律に従ってトレーニングが必要です。一般に、人間の材料 (組織、体液) を含む任意の研究を行う前に機関のバイオ セーフティ委員会や治験審査委員会の承認を得なければなりません。訓練は全員人間材料での作業に必要な基礎実習安全教育など、化学衛生学および実験室の安全と同様、生物学的安全性、有害廃棄物、人間の特定のトレーニングが含まれています血液媒介病原体。人間の材料とすべての職員は、人間の材料で作業する前に、B 型肝炎の予防接種を取得する一押しです。人事は人間の材料、例えば作業中の特定の保護具を着用する必要。、カフ付き白衣とシールド、および手袋を着用してすべての回での顔。バイオ セーフティ キャビネット (クラス 2) で、すべての作業が実行されます。ひと由来資料から人間の材料との接触や、廃棄物は、すべての装置は、汚染や職員への感染を防ぐために適切に処理されます。すべての機器と表面は人間の材料を含む各手順に従って 10% 漂白剤と 75% エタノールで洗浄します。ひと由来資料の流出はすぐにクリーンアップする必要があります。ガラス製品は使用後オートクレーブです。固定されていない人間の組織を含む廃棄物はラベル バイオハザード廃棄袋に収集され、オートクレーブです。シャープは、ラベルとしてバイオハザード穿刺と漏れ防止コンテナーにまとめられます。人間の材料からすべての廃棄物は、機関の生物学的安全規則に従って破棄されます。

注: 当研究室の高齢化・ サンダース ブラウン センターを通じて故人個人から新鮮な前頭葉サンプルを取得 (IRB #B15-2602-M)。包含の規準がある: 英国 ADC 縦剖検例のコホート研究と Post Mortem 間隔 (PMI) ≤4 登録 h64。解剖標準プロトコルに従う、すべてのプロシージャが NIH ラット ベスト プラクティスのガイドライン65に準拠します。4 h 未満の短い PMI 分離後キャピラリーの生存を保証するために最も重要です。新鮮および凍結組織を使用ことができます。新たに得られた人間の脳組織ショック液体窒素で凍結する必要があります、-80 ° C で保存凍結が必要な場合新鮮なまたは解凍組織を分離バッファー (下記参照) に格納され、迅速に処理する必要があります。我々 は、新鮮な人間の組織利回り脳毛細血管 (湿重量) の約 100 mg の 10 g を見つけます。

1. セットアップ

  1. 緩衝液調製
    注: 必要なバッファーの量は、組織の量に依存します。次のプロトコルのすべてのバッファーのボリュームは、人間の脳皮質組織の 10 グラムに基づいています。
    1. L 分離バッファー: 使用ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS; 2.7 mM KCl、1.47 mM KH2PO4、136.9 mM NaCl、Na2HPO48.1 mM、0.9 mM の CaCl2、0.49 mM MgCl2) の 1.5 L 5 mM D-グルコース (1.35 g で補うと) と 1 mM ピルビン酸ナトリウム (0.165 g)。追加するとグルコース、ピルビン酸、水酸化ナトリウムで pH 7.4 に調整します。クールは、使用する前に 4 ° C にバッファーを格納します。
    2. ウシ血清アルブミン (BSA): は、BSA の最終濃度 1% の分離バッファーの 1 L に BSA 粉末 10 g を追加します。泡を避けるため、pH 7.4 に調整、一晩 4 ° C で保存するゆっくりとかき混ぜます。すぐに使用前に軽くかき混ぜます。アルブミンの変性を避けるために気泡を形成しないでください。
    3. 密度勾配媒体: ガラス瓶の中に密度勾配媒体の 18 グラムの重量を量るし、電磁攪拌棒を追加。60 mL の分離バッファーを追加し、すべての粉末が中断されるまでに 5 分は積極的に振る。溶解する密度勾配媒体を許可する 4 ° C で一晩ストア。使用前に 10 分間かき混ぜます。
    4. 4 ° C ですべてのバッファーを保存します。全体の分離のプロシージャの間にすべてのツールおよび氷の上のバッファーを維持します。使用する前にすべてのバッファーをかき混ぜます。
  2. 実験のセットアップ
    1. 電子オーバーヘッド攪拌にポッター エルベジェム組織グラインダーの杵をマウントします。フードの下で氷の上杵・ ポッター エルベジェム組織グラインダー、Dounce ホモジナイザーを配置します。300 μ m フィルター メッシュ (5 × 5 cm2) を準備、円錐形に折ると挿入し、50 mL ファルコン管テープ (図 1 a) に添付します。
    2. 接続リングを置き、セルの歪みフィルター (細孔サイズ: 30 μ m) 50 mL の隼の管に。バイオハザード廃棄物バッグを準備します。キャビネット、バイオ セーフティに必要なすべての機器を配置 (材料の表を参照してください)。

2. 脳サンプル準備

注:図 1 aは、以下の全体の分離手順のワークフロー グラフを示します。人間の脳組織は皮質の任意の部分に由来することが、新鮮なまたは冷凍に使用することができます。冷凍脳組織は、(バッファーがありません; 10 g ~ 30 分) 室温で解凍できます。同等の結果を達成するために脳組織は各実験のため同じ脳の領域から取得必要があります。新鮮なこのプロトコルを最適化 (PMI < 4 h) 凍結されていない人間の大脳皮質。

  1. 人間の脳組織の準備: 脳組織の重量を文書化します。次のプロトコルのすべての数値は 10 g の新鮮な人間の脳組織に適しています。100 mm のペトリ皿に脳組織を配置します。すべての髄膜をピンセットで慎重に取り外します。白質を切断するには、メスを使用します。
  2. 人間の脳組織のミンチ: 慎重に脳組織をカットし、メスでミンチします。約 5 分 (2-3 mm 個) をみじん切り。・ ポッター エルベジェム組織グラインダーに脳組織を転送します。30 mL の分離バッファーを追加します。
    注: みじん切りの組織部分、肉挽きのプロセスをドロドロに脳組織を回すので参照してくださいすることは困難。

3. 均質化

  1. ・ ポッター エルベジェム組織グラインダー (クリアランス: 150-230 μ m): ホモジナイザー速度 50 rpm で 100 ストロークで各サンプルをホモジナイズしてください。すべての 25 のストロークと 100 ストロークに必要な合計時間は、時間を記録します。提案された均質化プロトコル; の表 1を参照してください。ヒトの前頭皮質の 10 g を均質化の合計時間は、約 22 分です。気泡を防ぐために空気で攪拌しないでください。
  2. Dounce ホモジナイザー (クリアランス: 80-130 μ m): 氷上 Dounce ホモジナイザーにホモジュネートを転送します。20 ストローク (~ 6 秒/ストローク、〜 2 分の合計) で懸濁液をホモジナイズしてください。泡を避けるため。

4. 遠心分離

  1. 4 つの 50 mL の遠心管とドキュメント磨砕液の総量に脳乳剤を均一に分散します。遠心分離管 (チューブあたり 12.5 mL) に 50 mL の密度勾配バッファーを配布します。10 mL の分離バッファーを使用して、杵、ホモジナイザー、リンスし、4 つの遠心分離管 (~2.5 mL チューブあたり) に配布します。
  2. キャップと遠沈管をしっかりと閉じます。チューブを活発に揺することによって乳剤、密度勾配媒体、およびバッファーをミックスします。4 ° c (固定角ロータ); 15 分 5,800 × gで遠心分離します。チューブに接続されているペレットを維持する中減速速度を選択します。上澄みを廃棄し、1 %bsa の 2 mL にペレットを再懸濁します。

5. ろ過

注: 赤い血液細胞と他の細胞の残骸から毛細血管を分離、ろ過のいくつかの手順が必要です。

  1. 300 μ m メッシュ: ペレットを再懸濁後、300 μ m メッシュを介して懸濁液をフィルタ リングします。毛細血管がメッシュでろ過する大きな船や大きな脳の破片は、メッシュに対し。最大 50 ml の 1 %bsa のメッシュを慎重に洗います。メッシュを破棄します。
    注: このろ過ステップは、大きな血管や脳の破片の塊から毛細血管の懸濁液をクリアします。
  2. 30 μ M の細胞の歪みフィルター
    注: このろ過ステップは、赤色の血液細胞や他の脳の破片から毛細血管を分離します。
    1. 6.1 またぎ 5 30 μ m セル歪みフィルター (キャピラリー濾液セル歪みフィルターあたり約 10 mL) から毛細血管の濾液を配布します。このフィルターでは、フィルターを通過し、濾液に集められ赤い血液細胞、他の単一セル、および小さな脳の破片に対しに戻って毛細血管を開催します。
    2. 25 ml の 1 %bsa の各フィルターを洗浄します。その後、全ろ液を収穫を増加する 6 番目のフィルターに注ぐ。1 %bsa; の 50 mL の各フィルターを洗浄します。維持の細胞毛細血管を含むひずみフィルター、濾液を廃棄します。

6. 毛細血管コレクション

  1. フィルターを裏返し、50 mL の管に 50 ml の各フィルターに対して 1 %bsa の毛細血管を洗います。慎重に 5 mL pipettor のピペット先端部で圧をかけ、脳の毛細血管を洗浄するフィルターに移動します。
  2. 特にフィルターの縁から、すべての脳毛細血管を洗浄することを確認します。このろ過プロセスが難しくキャピラリーの損失の可能性が高くなりますので、泡を避けるため。

7. 洗濯

  1. 毛細血管を収集した後、1,500 × g (スイング バケツの回転子) 4 ° C で 3 分間ですべてのサンプルを遠心します。上澄みを除去し、再分離バッファーの約 3 mL にペレットを中断します。15 mL コニカル チューブに 1 つのサンプルからすべての再懸濁のペレットを組み合わせて、分離バッファーでそれを埋めます。再び 4 ° C で 3 分間 1,500 × gで遠心分離し、さらに 2 回を洗ってください。
  2. 顕微鏡 (100 倍) とカメラ (図 1 b) キャピラリーの純度を文書化します。
    注: 人間の脳組織の 10 g から脳の毛細血管収量は通常約 100 mg です。分離脳の毛細血管は処理の実験のため今すぐ使用ことができます (e.g。、ライセート、膜分離)、またはフラッシュ凍結し、(複数の凍結融解サイクルを避けるため) 6-12 ヶ月の最小のため cryotubes には-80 ° C で保存されます。

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結果

人間の脳組織から分離は、大きな船、赤の血液細胞、他の単一セル、いくつかの細胞の残骸の量が少ない人間の脳毛細血管 (図 1 b) の濃縮懸濁液をもたらします。いくつかの毛細血管を分岐すると、そして、いくつかは、赤血球が毛細血管の内腔に捕捉されました。典型的な毛管 3-7 μ m の直径を持つ、約 100-200 μ m; オープン ルーメンと長いほとんどの毛細血管の先が折りたたまれています。共焦点の顕微鏡を使用して、孤立した人間の脳の毛細血管は、鋼管、そのままの構造と形態を明らかにします。図 2 aは、代理送信添付周皮細胞内腔で赤の血液細胞と毛細血管の人間の脳の画像を示しています。形態、サイズ、直径に関する知見のすべて、分離脳毛細血管12,17,18の構造前のレポート。図...

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ディスカッション

この議定書では、新鮮な組織からそのままで、実行可能な人間の脳毛細血管の分離について説明します。次の詳細に議論我々 このセクションで: 1) プロトコル、2) の一般的なエラーのトラブルシューティング、手法の限界 3)、4) に関して、既存モデルと代替血液脳関門モデルの意義への変更と 5)。分離脳毛細血管の潜在的なアプリケーション。

ここで説明されているプロトコルは、新鮮な人間の前頭皮質の組織 10 g に最適です。しかし、それは比較的単純なためこのプロシージャを変更する: 1)、多かれ少なかれ組織、2) 冷凍脳組織、または 3) 脳前頭葉以外の脳の領域からの 10 g より。まずと脳組織の 10 g 以上バッファーに必要な量だけ拡張できます組織の利用可能な量の上下。したがって、脳組織の 5 g だけの場合、バッファーのボリュームは半分に減少する必要があります。第二に、新鮮な脳組織を使用するキャピラリー分離について述べるが、新鮮な組織が利用できない38の場合、凍結するティッシュを使用可能性があります。第三に、前頭皮質から採取した新鮮な脳...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は感謝し、ピーター ネルソン博士とすべての人間の脳組織サンプルを提供するため英国 ADC 脳組織銀行でソニア ・ アンダーソンを認める (NIH 付与数: 国立老化研究所から P30 AG028383)。グラフィカルな援助、マット ・ ハザードとトム ・ ドーラン、情報技術サービス、学術技術と学部婚約、ケンタッキー大学に感謝しますこのプロジェクトはだった (B.B.) に国立神経疾患と脳卒中から許可番号 1R01NS079507 によって (A.M.S.H.) に国立老化研究所から許可番号 1R01AG039621 でサポートされています。内容は著者の責任と高齢化に関する国立研究所の神経疾患と脳卒中や国立研究所の公式見解を必ずしも表さない。著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
個人用保護具(PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636PPE
Disposable Protective LabcoatsVWR, Radnor, PA, USA470146-214PPE; 人的資源の性質上、使い捨ての白衣の使用をお勧めします
フェイスシールド, 使い捨てThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA19460102PPE; 人的材料の性質上、使い捨てフェイスシールドの使用をお勧めします
安全材料
Clavies 高温オートクレーブバッグ 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20"サーモフィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国14-206-32作業エリアをカバーする
VWRシャープスコンテナシステムサーモフィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国75800-272使用メス漂
白剤8.2%クロロックス殺菌剤64オンス。英国供給センター、レキシントン、ケンタッキー米国 323775
Equipment
4 °C 冷蔵庫サーモフィッシャーサイエンティフィック、ペンシルベニア州ピッツバーグ、米国13-986-148
Accume BASIC AB15 pH メーターサーモフィッシャーサイエンティフィック、ペンシルベニア州ピッツバーグ、米国AB15
ハイドルフ RZR 2102 コントロールハイドルフ、エルクグローブビレッジ、イリノイ州、米国501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR 遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック、ペンシルベニア州ピッツバーグ、米国75004521
ライカL2解剖顕微鏡Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA髄膜の除去に使用
POLYTRON PT2500 HomogenizerKinematica AG, Luzern, Switzerland9158168
Scale P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, USA0191392
Standard mini StirThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA1151050
サーモフラスコ液体窒素デュワーサーマルサイエンティフィック、マンスファイル、テキサス州、米国11-670-4C、組織を凍結するために使用されましたか?
Voyager Pro Analytical BalanceOHAUS, Parsippany, NJ, USAVP214CN
ZEISS Axiovert MicrocopeCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA分離されたキャピラリーのチェックに使用
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377823T1ウォッシュ・キャピラリー・オフフィルター
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µLサーモフィッシャーサイエンティフィック、ペンシルベニア州ピッツバーグ、米国21377821T1BSA
ピペットボーイインテグラ、ハドソン、ニューハンプシャー739658
50 mL ファルコンチューブ 25/ラック - 500/csVWR、ラドナー、ペンシルバニア州、米国21008-951
EISCO メスブレードサーモフィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国脳組織をミンチする
S95938C パラフィルムVWR、ラドナー、ペンシルバニア州、米国52858-000ビーカーと容積フラスコをカバーする
Thermo Scientific Finntip ピペットチップ 5 mLサーモフィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国21-377-304フィルターから毛細血管を洗い流す
60 mL シリンジ、Luer-Lokサーモフィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国BD309653キャピラリーをろ過するためのコネクタリングと併用
メスハンドル #4Fine Science Tools, Foster City, CA, USA10060-13for mincing
Dumont Forceps #5Fine Science Tools, Foster City, CA, USA11251-10髄膜の除去に使用
Potter-Elvehjem Tissue GrinderThomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3431E2550 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce HomogenizerVWR, Radnor PA USA62400-64215 mL 容量, クリアランス: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven フィルター (300 & micro;m)スペクトラムラボラトリーズ、ランチョドミンゲス、カリフォルニア州、米国146424毛細血管懸濁液をろ過して、残っている可能性のある髄膜を除去するために使用されます
pluriStrainers (細孔サイズ:30 & micro;m)pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany43-50030-03
Connector RingpluriSelect Life Science, Leipzig, Germany41-50000-03multiple time
1 L Volumetric Flaskfor preparation of Isolation Buffer
1% BSAおよびFicoll®の調製用;
Schott ボトル (60 mL)(Ficoll®
氷のバケツ冷たく保つ
ために100ミリメートルのペトリ皿
組織培養細胞スクレーパーVWR、ラドナー、ペンシルバニア州、米国89260-222遠心分離後に上澄みを除去する
Chemicals
BSAフラクションV、A-9647グマアルドリッチ、セント。ルイ、ミズーリ州、米国A9647-500g、Ca2 + < / sup>&を使用してDPBSで調製しますMg2+前日。準備中の泡を避けてください。冷蔵庫に保管してください。使用前に10分間ゆっくりと攪拌してください。
Ca2+ &Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - アイソレーションバッファの一部
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF4375ここでは正確な測定が重要です。攪拌棒付きのボトルで計量します。DPBSを追加した後、激しく振ってください。冷蔵庫O/Nに保管してください。午前中には晴れ間が出るでしょう。使用前に10〜15分間静かにかき混ぜてください。使用するまで氷の上に置いてください。
グルコース (D-(+) デキストロース)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAG7528グルコース (D-(+) デキストロース) 濃度: 5 mM
水酸化ナトリウム標準液Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA71474DPBS の pH を調整するため
ピルビン酸ナトリウムSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP2256濃度: 1 mM
州、は州、米国 Used Reuse 1% BSA Stir Bar1 L Beaker for preparation of 1% BSA Stir Bar (分離バッファーの調製のための 1 L ビーカーの調製に使用)は、脳組織のミンチのためのすべてをためにシは

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