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方法論記事

プラズマ凝固体内大動物モデルの肝臓組織の評価

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DOI：

10.3791/57355

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2018年8月4日

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1Department of Surgery, University of Bonn, 2Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 3Department of Anesthesiology, RWTH Aachen University

この記事について

サマリー

実験的肝組織体内のプラズマ凝固法を評価するためにプロトコルをご紹介します。ブタのモデル レーザードップラー微小循環を検討、組織凝固深度を測定、凝固サイト赤外線放射温度計とサーモグラフィ カメラとダクトのシール効果で温度は圧力によって文書化されます。実験。

要約

プラズマ凝固焼灼の一形態としては、後の段階で出血を防ぐために主要な肝切除後大きい肝カット表面をシールする何十年も肝臓手術で使用されます。プラズマ凝固肝組織の厳密な効果は単に不十分検討しました。ブタのモデルでは、臨床応用に近い凝固効果を調べることができます。組み合わせたレーザー ドップラー流量計、分光光度計ドキュメント微小循環は非侵襲的、組織深さ 8 mm で凝固時変更臨床印象を超えて止血について定量的な情報を提供します。凝固過程で評価サーモグラフィ カメラと赤外線温度計前およびポスト凝固凝固サイトで温度、ガス ビーム温度の測定デバイスの上限のしきい値のために可能ではないです。凝固の深さは、ヘマトキシリン ・ エオシン オブジェクト マイクロメータの校正後染色標本の顕微鏡は測定し、電源設定凝固深度の関係について正確な情報を与えます。シール効果を胆管に調査する大きな血管をシールするプラズマ凝固装置のため不可能です。バースト圧力実験を血圧を除外する explanted 臓器に関連した効果。

概要

アルゴン プラズマ凝固法 (APC) は、三十年1,2以上の腹部手術で広く使われている楽器です。肝臓のシールによる主要な肝切除後の出血3を防ぐために表面をカット後、二次止血の達成のための標準的な技法です。プラズマ凝固法は、高周波電気焼灼器、イオン化されたガスのアークを介して電気エネルギーを提供の特殊な形式です。モノポーラ電熱止血を提供し、この非接触技術組織4に固執する電極を防止する利点があります。イオン化されたガスのビームは自動的に最低の電気抵抗の領域に送られます、抵抗上昇乾燥のため他の地域がまだ乾燥して離れになっています。これは凝固5,6の制服の限られた深さを生成します。凝固効果に影響する要因は活性化凝固装置とプローブから組織までの距離の電源設定の時間します。ヘリウムは別のキャリア ガスをプラズマ凝固7に使用することができます。最近の臨床研究に集中して成績ではなく、機能的な組織学的所見3,8,9,生体外で調査10 に焦点を当てた実験中または分離臓器11実験。

基になるプロトコルにより、豚の人間の標準的な装置を使用して臨床応用に近い大規模な動物モデルのプラズマ凝固法の効果に関する研究: 微小循環がレーザーのドップラー流量計による非侵襲的評価と分光光度計、この表示12,13の標準的な臨床ツールです。凝固過程での温度変化は、赤外線放射温度計とサーモグラフィ カメラで監視されます。凝固の深さは、組織学的ヘマトキシリン ・ エオシン組織サンプルの採取後のセクションを染色で測定されます。二次止血のための他の手段との比較、バースト圧力実験を行った。血圧を除外する explanted 器官で実施されますが前述のテクニック14とは対照的に関連した効果。プラズマ凝固のローカル影響の調査の説明に加えてブタモデルで標準的な血液検査を実施することもできます。

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プロトコル

原則研究所動物ケアの (健康の国民の協会文書編 8、2011) と同様、動物研究のドイツの立法によって支配される規則に従っていた。政府の動物の世話のオフィス (Landesamt für Natur 環 und Verbraucherschutz ノルトライン ・ ヴェストファーレン州、レックリングハウゼン、ドイツ) から公式許可します。

1. 動物

  1. オープンケージで収容 (25-30 kg) 女性ドイツ在来種豚を使用します。
  2. 5 動物群 (アルゴン ・ ヘリウム) を使用します。
  3. 実験する前に、少なくとも 1 週間、環境に順応する動物を許可します。水への無料アクセスと手術前に 24 h の高速動物。

2. 麻酔

  1. Premedicate (15 mg/kg 体重 [BW]) ケタミン ・ キシラジン (10 mg/kg BW)、アトロピン (0.1 mg/kg BW) 筋肉内注射と動物麻酔導入前に 10 分。
  2. 22 ゲージ カニューレの耳静脈に配置によって末梢静脈アクセスを設立します。
  3. プロポ フォール 2 mg/kg の静脈注射による麻酔を誘導します。
  4. 仰臥位で動物を置き、2 cm。 皮下組織の鈍的準備を通じ検索静脈の長さの頸静脈の溝に縦切開を実行します。セルジンガー ワイヤー、カニューレを挿入します。
  5. カニューレを撤回し、ガイドワイヤー 14 神父カテーテルを挿入します。ガイドワイヤーを撤回します。拡張機能にカテーテルを接続し、ストラップや縫合糸でカテーテルを固定します。
  6. 舌を抜くし、まっすぐ喉頭鏡を挿入します。喉頭鏡のヒントを使用して、喉頭蓋をプルダウンします。声帯からチューブを挿入します。声門下カフを配置し、膨らませます。
  7. 36 と 42 の mm Hg の間呼気終末部分炭素二酸化炭素の張力を維持する 40% 酸素 20 26 呼吸/分で 10 ml/kg の一回換気量と換気します。
  8. 1 1.5% の濃度でイソフルランと 3-4 μ g/kg/h の濃度でフェンタニル麻酔を維持します。
  9. 4 mL/kg の初期速度で乳酸リンゲル液を供給/h、8 mL/kg の持続注入率を開腹後増加/h。

3. 手術とプラズマ凝固

  1. 標準的な手術台に仰臥位に動物を配置します。
  2. 標準的な手術の消毒薬を適用することによって皮膚を消毒 (2-プロパノール 45 g/100 g、1-プロパノール 10 g/100 g、ビフェニル-2-オール 0.2 g/100 g) を 3 回手術綿棒。
  3. 剣状突起からメスと恥骨へ広い正中開腹を実行し、手術リトラクターをインストールします。
  4. プラズマ凝固装置のスイッチは、使用キャリアガスによって、アルゴンまたはヘリウムのガスのボトルを開きます。3 L/分に応じて選択凝固デバイス出力へのガス流を調整します。
    注: プラズマ凝固の両方の気高いガス、アルゴンまたはヘリウムを使用できます。凝固効果はほぼ同等です。詳細については文献7を参照してください。
  5. 上記7として左肝葉でプラズマ凝固を実行します。チタン金型 (正方形開口 1 × 1 cm2) を使用して、凝固ゾーンを標準化します。5 凝固プローブ距離 1 cm で s。それぞれ異なる電源設定と凝集は、短い間隔 5 mm (図 1) の凝集と並行実行できます。
  6. 肝臓の収穫のため肝臓にすべての靭帯接続を分割します。分離し、門脈と胆管の長い部分を残して優れた十二指腸曲げ上肝椎弓根を分割します。大静脈上と下の肝臓を分割し、器官を取得します。
  7. 肝臓を採取後、豚は 0.16 g/kg BW ペントバルビ タールの投与によって安楽死されました。
  8. バースト圧力実験のための鋭いはさみで左の内側の肝葉の半分を切除します。プラズマ凝固させ、カット面 (100 w 出力) またはフィブリン (図 2) でカット表面をシールします。

4. 微小循環測定

注: レーザー ドップラー分光は、赤血球の移動によるドップラー シフトの測定を通じて組織の血流を確認できます。レーザー信号移動赤血球の数と相関します。レーザー ドップラー分光法は臨床使用 (例えば移植医学) とされている複数回15を検証します。

  1. レーザー レーザードップラー血流計や分光光度計に切り替えます。フラットのプローブを使用します。
  2. 流れと速度の基準測定値を取る。保存または値に注意してください。
  3. 前述の下 3.5 凝固を実行します。
  4. 速度とメジャー流凝固サイトにフラットのプローブを配置します。もう一度、保存または値に注意してください。
  5. 凝固装置装置のすべての電源設定について繰り返します。

5. 温度測定

  1. (サーモグラフィ カメラ、ノートブック、および赤外線温度計) にシステムを切り替え、測定を実行する前に少なくとも 1 時間を実行します。
  2. フォーカスを調整し、凝固敷地サーモグラフィ カメラのフレームを表示します。20 よりも大きい温度解像度 1024 x 768 ピクセルの空間分解能で検出できる赤外線シーケンス mK。考慮する凝固や周囲の組織の地域-熱伝達によって影響を受ける-ビューの途中であります。
    注: それは可能な限り最適な空間解像度のフレームのピクセル数を含める必要があります。
  3. 2 分にわたって肝表面にプラズマ凝固装置、サーモグラフィ カメラで凝固プロセスを記録します。
  4. サーモグラフィー解析ソフトウェアで画像を分析: 興味の領域を定義します。
    注: ソフトウェアは、時間をかけて対応する平均温度のコースを計算します。

6. 凝固深度測定

  1. シャープはさみ左内側肝葉を収穫します。
  2. 1 cm の厚さで凝固サイトを切除します。さらなる処理のため 3 mm 厚の経度方向のセグメントにカットします。
  3. 一晩で中立的な 10% の 4 ° C で修正組織サンプルは、ホルマリンをバッファリングします。パラフィン 2 ° C、融点以上に加熱し、スライスを埋め込みます。一晩プロセス。
  4. ヘマトキシリン ・ エオシン染色を実行します。
    1. Deparaffinize し、その後を 2 に浸すことによって組織をメタンハイド レート x キシレン 100% エタノール (エタノール)、95% エタノール、70 %etoh, 脱イオン H2O 2 分。
    2. 3 分のマイヤーのヘマトキシリン液と組織標本を染色します。
    3. 今、5 分間水道水ですすいでください。
    4. エオシン溶液 3 分間で組織を染色します。
    5. 3 分の 2 の x EtOH 95%、キシレンですすいでください。メディアを標準マウントをマウントします。
  5. (顕微鏡接続カメラ、イメージング ソフトウェア) のシステムに切り替えます。40 倍の倍率ですべてのセクションを表示します。
  6. 40 倍の倍率でオブジェクト マイクロメータのイメージを取る。再目的ウィンドウでボタンを押します。手動校正を選択します。入力 0, 1 mm] ダイアログ ボックスでは、100 μ m のマイクロメータ イメージ上に線を描画し、OK を押します。
  7. ビューで長さを選択 > 解析コントロール > アノテーションや測定ウィンドウ。マウスを使って凝固余白に肝臓表面から測定します。エクスポートまたは結果に注意してください。同じスライド上の別の場所で測定を繰り返します。
    注: 凝固深度は、通常肝細胞コードと縮められた細胞質、核濃縮核出血ゾーンと壊死のゾーン間のシャープなマージンによって通常の肝組織から簡単に区別できます。
  8. 2 つの測定の平均値を計算します。

7. バースト圧力測定

  1. スイッチ (自動ポンプ、圧力計) のシステム。ステップ 3.7 によると肝臓のサンプルを準備します。
    注: 3 方法活栓を介して接続された 2 つの並列ポンプを使用します。シングル ポンプで 1,500 の mm Hg の最大圧力が得られません。
  2. 触覚の茎にはさみで門脈、肝動脈、胆管を分離します。門脈を喀鉗子でクランプし、4-0 monofil 縫合糸で結紮します。総肝動脈 overholt 鉗子をクランプし、4-0 monofil 縫合糸で結紮します。
  3. Ch 16 カテーテルを胆管に挿入し、2-0 絹縫合糸で結紮します。圧力計 (図 3) と三方活栓をインストール、自動ポンプにカテーテルを接続します。
  4. 生理食塩水で灌流注射器を満たしなさい。
  5. 99 mL/h の配信率の自動ポンプを開始します。
  6. 漏れとレコードの破裂圧力の肝カット面と圧力計を監視します。
    注: を漏れの簡単に認識、特許の青は生理食塩水 (2 mL 特許ブルー + 18 mL 生理食塩水) を追加できます。圧力計の圧力の損失の時に気付いて、破裂圧力を確認しやすいです。

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結果

微小循環:次のプラズマ凝固止血診断装置を利用したは、微小循環の変化によって発揮できます。142.7 ± 76.08 のベースライン値から毛細血管血流 (任意の単位 (AU) として表示) が減少 57.78 ± 49.57 AU 25 W デバイス、出力 48.5 ± 7.26 で AU AU 5.04 ± 1.31 と 50 W で 100 W (図 4) で AU。

温度:凝固のサイトで温度をサーモグラフィ カメラ (図 5) で測定しました。些細だけ温度変化は赤外線温度計を使って文書化されました。32.42 ± の基準温度を示した 2.27 ° c.25 W で凝固後気温は 33.33 ± 1.81 の ° c.50 W レーザー凝固をもたらした 31.17 ±...

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ディスカッション

長い時間16肝臓手術の齧歯動物モデルが確立されます。大動物モデルがある特定の利点を提供するにもかかわらず、: 人間のための標準的な手術機器を適用できる、手術手技、臨床使用に匹敵する、標準的な臨床的評価方法は、顕微鏡の装置は必要ありません実験に移ります。特別な実験室試験方法 (図 10) を必要とせず標準臨床血液検査が実施されることができます。

豚は、自分の生理機能によく似た人間17呼吸循環の研究のための適切な実験動物です。サイズ、分節構造および組織学の類似性のため豚がまた実験的肝手術18標準実験動物の一つです。プラズマ凝固は、利点 (人間の生理と標準的な臨床機器の評価に類似)7のためブタのモデルで評価した.手術方法と対照をなして学管理を容易に推定することはできません。特に気道管理困難な17

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者の謝辞があります。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
キシラジン 20 mg/mLVetoquinol GmbHキシラパン
ケタミン 100 mg/mLCeva GmbHセバ ケタミン注射
アトロピン 100 mg / 10 mLフランツ博士 Köhler Chemie GmbHAtropinsulfat Köhler 100mgアンプ
PropofolFresenius Kabi GmbHPropofol 1% MCT Fresenius
FentanylKG Rotexmedica GmbHフェンタニル 0.5mg Rotexmedica
IsofluraneAbbot GmbHForene 100% (V/V) 250 mL
リンゲル乳酸溶液Baxter Deutschland GmbHナトリウム 131mmol/l、カリウム 5 mmol/l、カルシウム 2 mmol/l、クロライド 111 mmol/l、乳酸 29 mmol/l
外科的ディファクタラントSchülke &Mayr GmbHKodan Tinktur forte gefäRBT 1L 104804
電動顕微鏡Nikon Instruments Europe EclipseTE2000-E
顕微鏡カメラNikon Instruments EuropeDigitalsight DS-Qi1Mc
イメージングソフトウェアNikon Instruments EuropeNIS elements Vers. 4.40
Plasma coagulatorSöリングGmbHCPC-1000
アルゴンガスLinde AGアルゴン4.8 
ヘリウムガスLinde AGヘリウム 4.8
O2CLEA Medizintechnik GmbHO2C バージョン 1212LF-2またはLF-3プローブ付き
赤外線温度計VoltcraftVOLTCRAFT IR 260-8S
サーモグラフィーカメラInfraTec GmbHVarioCAM HDヘッド 820
サーモグラフィー分析ソフトウェアInfraTec GmbHIRBIS 3
メイヤーのヘマトキシリンソリューションメルク 1.09249
EosinソリューションVWRインターナショナルGmbHメルク1.09844
ローラーポンプ マスターフレックス L / S イージーロードコールパーマー 楽器会社モデル7518-10
パフューザーポンプB. ブラウン メルスンゲンAGパフューザー セキュラ FT
デジタル圧力計グライジンガー電子GMH 3161
パフューザーシリンジ、50 mLB. ブラウン メルズンゲン AGREF 8728810 F
パフューザー ライン、タイプ IV スタンダード、PVC ルアーロックB. ブラウン メルズンゲン AGREF 8722960
3 ウェイ ストップコック、ディコフィックス C35CB. ブラウン メルズンゲン AGREF 16494 C
シルク 2-0. 3 メートルResorbaREF H5F
Vicryl 4-0 SutupakEthiconV1224H
NaCl 0.9 %B. Braun Melsungen AG
法

参考文献

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