腸の部分的な閉塞のマウス モデル

イレウスは、腸¹を介して移動から消化された食品・液体・ ガスを防止する小規模または大規模な腸の部分的または完全な閉塞です。、閉塞するため、閉塞はルーメン²を縮小に厚くなる腸壁を誘導します。腸閉塞は腹部癒着組織形成を引き起こす腹部や骨盤内の手術の結果として、または炎症性腸疾患 (クローン病)、憩室炎、ヘルニア、捻転、狭窄など消化管疾患から発生することが腸重積症、便秘、宿便、偽閉塞、癌および腫瘍の^3,4,5。これらのケースでのイレウスはしばしば腸⁶筋肥大に します。

内腔の PO 腸の膨満感を誘発して蠕動運動機能^{7,8,9,10を続ける必要性への応答で閉塞の周りの平滑筋層の厚さを増加させる 11,12,13}。猫¹³内同様肥大を一貫して開発、犬¹²、モルモット¹¹ラット¹⁰マウス⁷平滑筋肥大を研究する腸の PO の動物モデルが開発されました、腸管の筋層。

腸 PO のマウス モデルは、生成し、生体内でのイレウスの勉強に最も費用効果的な方法です。小腸障害マウス回腸を囲むために外科シリコーン リングを使用して実行されます。PO マウスは、PO 手術^8,15後、筋膜厚 (肥大) の初期 (過形成)、細胞数の増加と増加を示した。SMC は、¹⁴肥大条件に応えて平滑筋層内で成長している主なプラスチック製の電池が ICC など他のセルおよび SMC に密接に関連付けられて、また再設定 PDGFRα⁺セルです。PO マウスが、小腸の肥大を開発について報告した smc が、増殖性が高い^7,15,16PDGFRα⁺細胞に脱分化型します。逆に、ICC は退化、肥大した平滑筋層内腸 obsruction⁷の開発中に失われました。PO モデルのもう一つの主要な利点は、腸神経系と伝達を行う神経因性の運動パターンの変化を誘導する能力です。主要な伝播マウス小腸の神経因性の運動パターン移行するモータです複雑な (MMC) 神経因性は、ICC や電気的徐波¹⁷は必要ありません。PO モデルは、部分的な閉塞で Mmc や腸の神経を改造する方法に明確な洞察力を提供できます。

ここでは、シリコン リングを使用して腸の PO 手術のためマウス プロトコルを提案する.確実に PO 手術を受けるマウス小腸の筋の肥大を生成します。肥大筋肉内 SMC、ICC、PDGFRα⁺、および神経細胞は劇的に改造しました。

次のプロトコルは機関動物ケアとネバダ大学リノ校動物資源使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、研究の動物の使用に関するすべての制度的倫理的なガイドラインに準拠しています。

1. 動物。

1. 20-30 g. 再発胃癌動物資源で一元的な動物施設で実験室マウスのコロニーの家間の重量を量る成熟した (4-6 週古い) c57bl/6 マウスを取得します。

2. 部分的な閉塞の手術

注: 手術は専用の手術室で行われます。すべての手術器具は、手術前にオートクレーブ。滅菌ガウンと手袋は、すべての回で手術室のすべてのスタッフが着用する必要があります。

1. 手術のマウスのための準備
   1. 酸素の供給を確保するため麻酔の配信システムをチェックし、イソフルランはプロシージャの適切です。供給酸素を入れます。ガス流量計をオンし誘導室で動物の 500-1000 mL/分の場所にそれを調整し、上部をシールします。
   2. 5% にイソフルラン気化器をオンにし、側臥位になるまで動物を監視します。鼻の円錐形に麻酔の配信システムを切り替えます。
   3. 酸素は、任意の残留ガスの誘導部屋をフラッシュし、開いている鼻の円錐形のラインを維持しながら誘導室線をオフにします。
   4. 商工会議所から動物を削除し、動物の目に眼軟膏を慎重に配置します。
   5. ガスが流れ続けると、予熱した暖かいパッドに鼻の円錐形を配置します。
   6. 100-200 mL/分、2-3% イソフルランと酸素の流れを変更します。動物を移動する場合、gentlyrestrain までに鼻の円錐形の動物完全に麻酔再び。
   7. 呼吸およびプロシージャ中の刺激への応答を監視し、イソフルラン (2-5%) の割合を調整して、必要に応じて。手術を行う前に、動物の anesthetization レベルはつま先ピンチ反射の欠如によって監視されます。
   8. 鎮痛薬 (ブプレノルフィン、体重の 1 μ g/g) を切開部位から腹腔内に注入します。
   9. きれいな綿棒を使用して腹部にローションを適用します。ローション坐るようにマウスを 3-5 分のため、ガーゼや綿の綿棒を使って髪を削除します。マウスの腹部からすべての髪を削除するまで、この手順を繰り返します。
   10. 70% エタノール ガーゼと綿の綿棒を使って皮膚をきれい。腹部をきれいにする swabsticks またはポビドン ヨードのソリューションを適用します。
2. 部分的な閉塞の手術
   1. 手術エリアの真ん中で開く 2.5 × 2.5 cm 25 × 50 cm 滅菌紙を使用して手術部位をドレープします。開口部と皮膚の境界で滅菌ストリップを配置することによって動物にドレープを保護します。
   2. 縦皮膚だけを切開することを確保し、この時点で musculoperitoneal 層に切断を回避する第 15 刃メスを使用して ~3.0 cm の腹部切開を確認します。
   3. 鉗子、手術用のはさみを使用して、皮膚の musculoperitoneal レイヤーに任意の切開を引き起こすことがなく慎重に musculoperitoneal 層から区切ります。レイヤーには、(約 1 cm × 4 cm) を十分に分離されている、特定、リネア musculoperitoneal 層と白線に沿ってカット 〜 2 cm にアルバ アルバ マイクロ鉗子、はさみを使用して腹腔を公開します。
   4. 慎重に検索し、盲腸を識別します。ゆっくりと優しく、マイクロ鉗子、近位結腸と滅菌ドレープに外盲腸と回腸をもたらすことで腹腔から盲腸を削除します。すぐに 0.9% 滅菌生理食塩水浸したガーゼで腸のティッシュを湿らせ、腹部キャビティの外、彼らすべての回で湿らせた露出した組織を維持します。
   5. 検索し、回腸と結腸の間の腸間膜を識別します。腸間膜のすぐ下、回腸に平行に、切開 (~ 1 cm) をして、血管を切断しないでください。
   6. オートクレーブのシリコーン リング (長さ、外装の直径を 4 mm、3.5 mm の内部の直径 6 mm) を取る。管を開き、マイクロ鉗子でリング縦カットします。
   7. 腸間膜組織に切開して開かれたリングの一方の端を挿入します。リングに囲まれた回腸と別の接触の 1 つの端を持って来ることによって完成したリング状にリングを返します。
   8. シリコン リングが回腸を完全に囲まれていることを確認、縫合糸でリングを閉じるし、慎重に腸を腹腔内の空洞に戻る場所します。
3. 外科閉鎖
   1. 単純な実行白線に沿って musculoperitoneal 層に連続縫合吸収性縫合糸巻きアルバ、musculoperitoneal を閉じます。縫合が完了したら、任意の 0.9% 滅菌生理食塩水浸したガーゼで出血をクリーニングします。
   2. 完全に独立したナイロン縫合糸で、傷を閉じるため皮膚に単純な連続縫合を実行します。
   3. 両方の縫合が完了した後は、新しい swabstick またはポビドン ヨードと傷をきれい。
   4. 抗生物質 (ゲンタマイシン、20 ~ 30 g 体重に基づいてマウスあたり 150 μ L) を腹腔内注入します。
   5. プロシージャが完了イソフルラン気化器をオフにして流れる呼吸する動物を許可するしたらそれまで酸素開始意識を得ています。
   6. 動物は目を覚まし、一度熱をサポート完全に回復するまで別のリカバリ領域に動物を配置します。

3. 術後観察。

1. 手術を終えて、温度・湿度が調整される回復室のインキュベーターに動物を移動します。動物、インキュベーターの中 2 番目の時間最初の 1 時間 30 分に、15 分ごとに術後の動物を監視します。
2. 所定の観測が完了すると、すぐに彼らの自身の個々 のケージに動物を移動し、痛み¹⁸、手術の傷が (合併症の兆候なく適切に治癒ができるように臨床徴候のために毎日監視裂) 存在します。

部分的な閉塞 (PO) 手術 1 ヶ マウス回腸盲括約筋の近くに周りのシリコン リングを配置することによって誘導されました。このリングは、回腸の部分的な閉塞を作成しました。偽オペレーション (SO) 年齢/性別もリングなし行った一致するマウスとこれらのマウスは徴候を示さない PO マウスで見つけられるそれらのよう。マウスはすぐには数時間以内 PO の手術から回復しました。彼らは示さなかった明白な行動の変化や弱さ、最初の週の内で、最初の週後に、彼らは徐々 に PO の兆しを見せ始めた: 腹部が膨らんで、少ないと小さく糞便のペレットの生産。PO マウスがポスト PO 外科手術などコントロール マウスと一緒に 8 13 日で犠牲になった。小腸だった部分的にいっぱい、ポスト PO 手術の 8 日間で膨張し完全に満たされて、制御 (図 1 a) マウスと比較して 13 日間ポスト PO 手術で膨張します。8 と 13 日ポスト PO 手術マウスの結腸に糞便ペレット形成 (図 1 b) などコントロール マウスと比較して減少しました。切開しリングの上流は回腸組織と平滑筋は、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色を用いて解析しました。平滑筋層は 8 日ポスト PO 手術で肥大され、13 日間ポスト PO 手術 (図 2) で大いにそれ以上に肥大します。また SMC、ICC、PDGFRα+、および免疫血清を使用して PO マウスにおける筋内神経細胞の変化が観測されました。各セルは特定の細胞タイプ マーカーが付いていた: PGP9.5 PDGFRA (PDGFRα+細胞)、キット (ICC) MYH11 (SMC) (神経細胞)。SMC は組織の 3 層に見られる: 縦筋 (LM)、輪状筋 (CM)、回腸 (MM) 粘膜筋板。SMC は徐々 に 8 と 13 日ポスト PO 手術 (図 3) ですべての 3 つの層で急速に育っていた。Icc、に関してはその亜集団は深い筋肉神経叢 (DMP)、腸管領域 (MY)、および漿膜下層 (SS) 地域に位置します。しかし、ICC DMP、ICC-私と ICC SS いた内/筋間層 (図 3) 内に堕落しました。ICC の集団と同様に、PDGFRα+細胞 (PαC) の集団は、DMP、私、SS にあります。PO マウス PαC DMP、PαC-私と PαC SS が動的に PO マウスの筋間層内改造した: 彼らはポスト PO 手術の 8 日間でだんだんと退化する 13 日間のポスト PO 手術 (図 3)。最後に、腸管神経叢 (MP)、粘膜下神経叢 (SP)、ニューロン漿膜下層 (SS)、および腸の運動ニューロン (:EMN) 大幅 PO マウス 8 と 13 日ポスト PO 手術 (図 3) の間/筋肉内の地域で失われました。

図 1。マウス モデル内腸の部分的な閉塞の外科的誘導。PO が PO 手術によって誘導されました。1 ヶ月古いマウス麻酔をかけられました、その腹部が切開によって開かれた、シリコン リングは、回腸を周囲に置かれた、開口部は縫合閉鎖。手術を受けたマウスは、8 または 13 日間の回復を許可されました。年齢、性別一致リングの配置がないを除けば、マウスが PO マウスと同じ方法でに作動しました。(A)総 PO を受けたマウスの消化管の画像や手術など。8 マウスの画像し 13 日 A. 小腸上流リングのマウス解剖手術後(B)の消化管は 8 と 13 日ポスト PO 手術で膨張したし、結腸に糞便のペレットは両方 8 時も小さかったと 13 日ポスト PO 手術として部分的に閉塞性シリコーン リングのため 13 日間ポストなど手術マウスと比較されました。スケール バーは、0.5 cmこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

図 2。手術マウス モデルでは平滑筋層変更します。代表 H & E 染色だから腸 PO から回腸断面のと操作 (NO) マウスではないです。平滑筋 (SM) と粘膜 (Mu) 層は、8 と 13 日ポスト PO 手術で PO マウスでなど、マウスではないよりも厚いです。スケール バーは、50 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

図 3。腸の部分的な閉塞による平滑筋肥大における動的細胞改造します。代表的な共焦点レーザーだから PO からの肥厚性回腸断面の画像をスキャンおよびマウスではないです。免疫組織化学的染色抗体 (レッド) MYH11 (SMC)、キット (ICC)、PDGFRA (PDGFRα+細胞) または (NC; 神経細胞), PGP9.5 共同で染色 DAPI (青)。粘膜筋板 (MM)、輪状筋 (CM) 縦筋 (LM) レイヤーで SMC と同様、深い筋肉神経叢 (DMP)、腸管領域 (MY)、および漿膜下層 (SS) 地域で PDGFRα+細胞は 8 と 13 日間ポスト PO で肥大性回腸で育ってください。腸の運動ニューロン (:EMN) NC (SS)、漿膜、粘膜下神経叢 (SP) DMP、私と SS は、腸管神経叢 (MP) ICC 中手術いた退化しました。スケール バーは、50 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

図 4。大規模な小さすぎるかコロンに見当違いもシリコン リングの結果。(A)平滑筋肥大成長しない回腸閉塞を引き起こすには、リングが大きすぎる場合。回腸のない閉塞に少し作ったリング。(B)リングが小さすぎる場合に、回腸の腸管虚血が開発しています。リングは、組織が損傷し、肥大を開発する前に早期死亡につながる回腸のほぼ完全な閉塞で行います。(C)見当違いリングのために大腸の平滑筋肥大を開発しました。コロンのリングは内腔側のコンテンツ (糞便)、腸間膜血管を損傷し、コロンで大量出血の原因によって下へ移動されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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