方法論記事

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

18K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/57382

⸱

2018年5月12日

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Swiss Federal Institute (ETH) Zurich

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

シュプリンガー依存組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) の脊柱の注入は、脊髄内の任意の遺伝子組み換えラベル セル型を操作する使用できます。ここで我々 は腰椎の脊髄後角のニューロンを変換する方法をについて説明します。このテクニックは、操作神経細胞サブタイプの機能の尋問を使用できます。

要約

脊髄神経細胞集団の選択的操作は主に 2 つの方法で達成されている: 1) 交差形遺伝学、記者やエフェクターの選択的表現を達成するためにダブル、トリプルのトランスジェニック マウスを生成するという目的の脊髄の人口の遺伝子 (例えばRosa26 の軌跡から)。Cre 依存組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV); 2) 脊柱の注入ここで好みの記者やエフェクターの遺伝子のコーディングの Cre 依存 AAV のベクトルは、目的の神経細胞集団に Cre リコンビナーゼを発現するマウスの脊髄に挿入されます。このプロトコルは、Cre 依存下さい rAAV ベクトルを生成する方法を説明し、腰椎の脊髄後角のニューロンを変換する方法は、rAAVs と L3 ・ L5 をセグメントします。L3 ・ L5、後肢からの感覚情報を送信それらの末梢感覚神経によって支配されています腰椎脊髄のセグメントとして自発的な行動と感覚のテスト注入側と同側の後肢に適用する応答することができます。感覚処理の操作のニューロンの機能を調べるために分析しました。この手法を使用して、遺伝子を分析する方法の例は、脊髄ニューロンのサブセットを定義を提供します。古典的なレポーター マウスの誘導発現に比べて Cre トランスジェニック マウスにおけるウイルスを介する遺伝子発現の主な利点は、次: 1) 異なる Cre 依存 rAAVs 様々 な記者やエフェクター蛋白質をコードすることができますこうして行いくつか複数のトランスジェニック マウスを作成する必要性を克服する単一の Cre トランスジェニック行に注入します。2) 脊柱の注入は、Cre 発現細胞注射部位と注射後時間の操作を制限します。主要な不利な点: 1) rAAVs からレポーター遺伝子発現は多くの変数。2) 手術へと興味の脊髄の神経細胞を変換する必要があります。2 つの方法であるより適切な対処するニューロンの人口と研究の質問に依存します。

概要

背側脊髄は体の周囲と脳との間の情報交換は欠かせません。暑さ、寒さなど感覚的な刺激に触れる、または侵害刺激は、脊髄後角のニューロンにこの情報を伝える専門の末梢神経によって検出されます。ここでは、抑制性および興奮性の介在神経の複雑なネットワークを調節して、最終的に脊髄を脊髄投射ニューロンを介してリレー感覚情報サイト1,2。脊髄によって実施計算間- および投射ニューロン ゲート感覚については、こうして情報が抑制またはどの強度で中継を決定します。過敏やアロディニア (通常非痛み刺激によた後痛みの感覚) など感覚機能障害抑制と励起、バランスの変化など、感覚的な刺激の統合の変更可能性があります。これらの変更は、様々 な慢性的な痛みの根本的な原因を示す3,4をすると考えられています。したがって、脊髄回路は、感覚の処理で重要度の高い、したがって生物の環境と自己の認識の。最近登場して分子、遺伝子の組み合わせと遺伝的に識別された脊髄ニューロン集団の正確な操作を許可する手技、科学者は、基になる脊髄回路を理解し始めている今異なる感覚の処理を担当します。

野生型やトランスジェニック マウスに下さい rAAV の脊柱の注入が大きく貢献して、操作、分析、および脊髄ニューロン5,6,7,の特定のサブセットの機能を理解する8,9,10,11この手法により、マーカー蛋白質の配信 (GFP など/GFP の融合蛋白質)、(GCaMP) などのレポーター蛋白質またはエフェクター蛋白質 (細菌毒素、チャネルロドプシン、薬理遺伝学的受容体など)、空間的。脊髄の神経細胞に制限的な方法。脊髄の神経細胞の特定のサブセットに Cre リコンビナーゼを発現するトランスジェニック マウスに Cre 依存性 rAAVs の局所注射では、それぞれのニューロン集団の特定の分析をことができます。我々 は、ラベル、アブレーション、抑制または脊髄ニューロンの示す痛みを制御する脊髄のゲートの不可欠な一部であり、トランス ミッション7をかゆみグリシン作動性神経をアクティブにするためにこの手法を採用しています。これらの実験では、GlyT2::Cre マウスに Cre 依存下さい rAAV の脊柱の注入には腰椎の脊髄におけるグリシン作動性神経ニューロンの選択的操作が有効になります。これにより、グリシン作動性神経ニューロンの動物の生存のために重要なを含む中枢回路の同時操作を避けることができます。

RAAVs の脊柱の注入は、注入のサイトに感染を制限、局所介在ニューロンのみならず、神経細胞の軸索投射を介して注入のサイトに接続するウイルスの伝達が発生します。後者はよく脳の特定の核への神経入力を提供するトレース中枢神経系領域に使用されます。軸索投射の感染、ただし、また、交絡因子ニューロンの定義された人口は特定のサイトで勉強しなければならないとき。これらの問題に対処するため最近 AAV 血清型と血清型といずれかを最小化または逆行性伝達を最大化するためのプロモーターを識別する式カセットの包括的な分析を実施しています。逆行性後根神経節 (DRG)、吻側の腹内側核延髄 (RVM) と体性感覚皮質のニューロンをヘッジホッグ異なる血清型およびプロモーターの機能を行った脊髄回路でこの特定の研究の中で、12. 注射部位の脊髄を分析する脊髄の注入されたサイトへの入力を提供する投射ニューロンを分析したり、このプロトコルで説明されているテクニックを使用したがってことができます。ここで説明したプロトコルでは、腰椎の脊髄の左側に下さい rAAV の 3 注射は 3 腰椎セグメント (L3 ・ L5) における神経細胞の伝達を有効にするのに実行されます。L3 ・ L5 セグメントは、同側の後肢から注射部位に感覚入力の大半を受け取る。従ってそのような遺伝的標識神経細胞サブタイプの回路関数の機能の証拠を提供する L3 ・ L5 の遺伝的標識細胞の機能操作堅牢な行動の変化を呼び起こすに十分であることを紹介します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての動物実験はスイスのカントン獣医のオフィス (チューリッヒ) で承認された、やすべての関連する規制・制度のガイドラインの遵守。

注: それぞれのメーカーやベンダーと一緒にすべての材料は、材料表に表示されます。

1. Cre 依存 AAV のベクトルの生成

注: さまざまな別のプロモーターで Cre 依存ベクトルを購入ことができます (材料の表を参照してください) または、目的の式構文を使用できない場合は、AAV の既存の構造を変更することによって生成できます。プロモーターと血清型ウイルスの伝達の広がりに影響を持つことができますに注意してください ( 12参照)。このプロトコルの最初の部分は簡単にそれぞれの利益のために適した 2 つの異なる Cre 依存 AAV ベクターの生成と機能実験の損失に示します。

  1. 薬理遺伝学的活性化 (関数のゲイン)
    1. PAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq) を注文-mCherry (材料の表を参照してください) デザイナーの薬 (DREADD) によってのみ活性化されるデザイナーの受容器のための活性化を介した。
    2. 細菌刺し文化を受け取ったら、LB の版 (ルリア ベルターニカミラ液体培地の溶解細菌学的グレード寒天培地) に細菌を連勝は適切な抗生物質を添加しました。37 ° C で一晩インキュベートし、次の日に単一コロニーを拾います。
      注: プラスミド AAV を含むベクトル ゲノムが不安定になり、特にウイルスの逆のターミナル内のウイルスのゲノムの再結合を繰り返す (ITR)、エシェリヒア属大腸菌の増幅中に発生します。私達はこのような系統の recA 欠損/抑制を使用して提案する AAV のゲノムを含んでいるプラスミッドの内で再結合を避けるためには MDS42 または Stbl3 として。
    3. 選択したベンダーによって与えられた指示に従って細菌を増幅する DNA マキシ キットと市販の DNA マキシ キットと高品質プラスミド DNA を準備 (例えば、材料表を参照してください)。整合性とプラスミッド DNA のプラスミッド DNA の制限のダイジェストのアイデンティティを確認することによってプラスミッド DNA の準備の品質管理を実行します。
      注: ITRs 内 SmaI 制限の endonuclease の認識部位があります。ITRs の整合性を確認する品質管理、SmaI ダイジェストがあります。
    4. 高品質下さい rAAV を生成するためにウイルスのベクトルの中核施設に DNA を送信します。
      注: 高価、高品質ウイルス preps がウイルスの準備の汚染によって引き起こされる表現型の混同を回避するため重要です。したがって、AAV の生産研究室で確立している場合を除き、確立されたベクトルのコア施設では、生産の選択下さい rAAV を持っていることをお勧めします。
  2. アブレーション (関数の損失)
    注: 細菌毒素や毒素の受容体は、細胞切除または神経サイレンシングを仲介する使用できます。私たちは、Cre 依存的に特急ジフテリア毒素断片 A (DTA) に pAAV.EF1α.flex.DTA を生成しています。
    1. Cre 依存ウイルス ベクターを生成するには、選択 (例えば、pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP) 適切なプロモーターで Cre 依存ベクトル。アスキーと NheI または互換性のある制限の endonuclease の認識部位に (フォスターらを参照してください彼らのオーバー ハングは、プライマーとポリメラーゼ連鎖反応による選択 (例えばDTA) のコーディング シーケンスを増幅します。7)
    2. 標準的な分子生物学の技術を使用して、実行ベクター DNA の制限のダイジェスト (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP)、PCR 増幅の制限エンドヌクレアーゼ アスキーと NheI と (NheI-DTA-アスキー) を挿入します。精製の断片を縛る。
    3. 選択、有能な細菌の製造業者によって与えられるプロトコルに従って適切な細菌に ligation の反作用を変換や LB プレートに細菌を板します。RecA 欠損/抑制を使用してクローニングのために MDS42 や Stbl3 などの系統とプラスミド DNA の後続の増幅。
    4. 変換の後の日、クローンをピックアップし、37 ° C で適切な抗生物質一晩で補われた LB 培地でそれらを接種します。次の日には、培養細菌からプラスミド DNA を抽出します。成功した制限のダイジェストでクローン作成および抽出プラスミド DNA のシーケンスを確認します。
    5. 高品質、細菌プラスミド DNA を増幅 (1.1.3 の手順を参照してください)。ウイルスの生産のためのウイルスのベクトル中核施設に増幅された DNA を送信します。

2. 脊髄の細胞の情報伝達

  1. ウイルス溶液の調製
    注意: ウイルス感染試薬は、関連するガイドラインに従って処理する必要があります。ほとんどの場合、rAAVs は、バイオ セーフティ レベル 1 (BSL1) で処理できます。
    1. 注射の日、氷の上必要な純化ウイルスのストック因数を解凍して注入直前まで氷の上おきます。これらはウイルスの効果的な力価を減少させる繰り返し凍結-融解-サイクルを避けてください。
      注: 必要に応じて、割り切れる吉濱ウイルス保存できます 4 ° C で最大 3 日間。
    2. 滅菌の 0.9% のウイルス粒子を希釈塩化ナトリウム又はリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。
      注: 適切な価実験目的に依存し、実験的に決定する必要があります。良好な総ウイルス負荷は、3 × 109ゲノム コピー (3.33x1012 GC/mL、3 x 300 nL 注入) を開始です。過剰な撮影といくつかの損失に毛細血管の読み込み中のアカウント、各マウスのウイルス ソリューションの約 2.5 μ L 必要になります。
  2. 脊髄内注射用マイクロ ピペットの準備
    1. '' 薄壁ガラス管を引く (外径 1 mm) ~5.5 mm 長いを作成するマイクロ ピペットの引き手の浅いすね。P(A) は表 1のように適応と 3.0 mm ヒーター フィラメントと 00 のプログラムの設定を使用します。
      注: が事前に行われる引くことができます。引っ張られた毛細管ピペットを詰まらせる可能性があります後でほこりを避けるために粘土で密閉容器に格納してください。マイクロ ピペットのオートクレーブに入れることは必要ではありません。
    2. 25-35 μ m の内径を開くヒントを作成する約 4.5 ~ 5 mm の長さに椎弓切除鉗子で引っ張られた毛細血管のシャンクをクリップします。マイクロ メートルのスケールで顕微鏡を使用して、どのように大規模なを開く必要があります、またはすべてピペットの測定のための感じを得るにいくつかのマイクロ ピペットの内径を測定します。
      注: 小さい先端は目詰まり; につながる組織の損傷と脊髄を貫通する難しさ、大きなヒントがあります。
  3. 手術のセットアップとツールの準備
    1. 装置は清潔ですぐに使用できるを確認します。70% のエタノールで拭くことによって作業領域を消毒して、滅菌オートクレーブまたはそれらのウイルス駆除ツール.使用するウイルス ベクターを害することとなる 1 マイクロリットルの注射器に、消毒剤を放置しないでください。
  4. 動物の外科手術のための麻酔と
    注: 手術の合計時間は 60-90 分です。
    1. 手術を容易にする 6 に 10 週齢のマウスを選択します。
      注: 実験的なデザインは、それを必要とする若いまたは古い動物の注入可能です。任意のひずみと男女ともに、原則として使用できますが、異なるトランスジェニック マウス線間の動作の比較のため同じ背景の緊張 (例えば, c57bl/6 j) を使用します。性差がされるか、または調査が別のグループの男性そして女性を分析する場合。
    2. ~ 5% イソフルランを用いた麻酔を誘導します。熱マットの固定フレームに動物を置き、1 2.5% イソフルレンで麻酔を維持 (空気流量 900 mL/分)。手術中の呼吸数を監視します。
    3. 手術中に角膜の乾燥を防ぐために潤滑剤の眼軟膏を適用します。
    4. 動物の背中をそるし、ウェットティッシュで丁寧に髪を削除します。ヨード溶液による剃毛の皮膚を消毒して皮膚が乾燥を許可します。
    5. 鎮痛治療を与える (例えば、0.1 0.2 mg/kg ブプレノルフィン皮下)。
  5. 腰椎脊髄レベルで脊柱の露出
    注: 脊髄と脊柱の差分の開発によりそれぞれのレベルが揃っていないが、L4 腰椎脊髄セグメントは、胸椎 T13 と同じレベル。
    1. 脊柱に沿って触診で最も尾側のリブのペアを探します。メスを使用して、最も尾側のリブ組にちょうど吻側から肌に 1.5 〜 2.5 cm 縦カットを作る。
    2. ピンセットで皮膚を持ち上げ、ハサミで基になる筋肉からデタッチします。手術を通して露出した組織の滅菌の 0.9% と潤いを保つ塩化ナトリウム。
    3. 微細鉗子と小さなハサミを使って、正中線のすぐ隣に次に、薄い膜の層に切開を行います、棘突起から切ってください。基になる棘筋から独立したが、棘突起に接続されています。
  6. 腰椎脊髄レベルで脊椎骨の同定
    注: 一度、脊柱を公開すると、横突間靭帯、背の棘突起が表示されます。いくつかの解剖学的ランドマークはターゲット (図 1 b) に正しい椎骨を特定するに役立ちます。
    1. 腸骨稜を公開する尾部へ皮膚を引っ張る。同じレベルでは、目に見える横突間靭帯の最も尾側のペアは L6 棘突起を結合します。興味の椎体を識別するために吻側方向に尾びれの後方に数えます。
    2. 脊柱に沿って触診しなさい。最も尾側のリブ組はちょうど T13 椎骨に吻側に位置する、腰のレベルで骨盤の骨は L6 椎体のレベルでは。
    3. 白くおよび最も内側の脊柱の側面に沿って腱のあるスポットを探します。T13 椎はちょうど吻側に位置します。この椎骨 L4 腰椎脊髄セグメントです。
  7. 脊柱と脊髄の露出の固定
    1. 脳定位固定装置のフレームの脊髄のクランプに昇格する重ね組織のクッションの上に動物を配置します。
    2. 呼吸による脊柱の動きを避けるためにターゲットの椎骨を修正します。この目標に向けて、ターゲット脊椎に隣接するクランプを合わせ、位置に 1 つのクランプを修正、アドソン鉗子で脊柱を押しながら 2 番目のクランプを固定します。
      注: 列射出面に垂直であるべきで、それが上からの圧力に移動しないようにしっかりと固定します。必要に応じて、クランプの 2 番目のペアは脊柱に固定できます。この場合、ターゲットの脊椎に隣接する 2 つの骨にクランプの 2 つのペアを修正することをお勧めします。
    3. 興味の脊椎の上棘筋を削除します。メスを使用する垂直切開と同様、平行切開、脊柱に平行な腱の内側吻側と尾側ターゲット椎。あまり深く切らないように注意してください。涙/カット rongeurs を用いた筋。必要に応じて残りの椎体や椎間腔で硬膜上組織を削除する鉗子を使用します。
    4. 椎間腔の背側の血管が脊髄の正中線をマーキング表示されているはず。一方的な注射のため椎体のターゲット側の真ん中に穴をあける部分椎弓切除術を実行します。罰金歯科ドリル 0.5 mm の球面カッター装置を使用し、脊髄に近づくとき特に慎重にドリルします。26 G 斜め針脊髄を公開する任意の残りの骨片を削除します。
    5. 26 G 斜め針を使用すると、ドリル穴、椎間腔吻側と尾椎骨のターゲット、背側の血管すべて約 200 μ m 外側に硬膜を穿孔します。脳脊髄液は穴から脱出する必要があり、脊髄を若干膨らんだする必要があります。
  8. 注射器の準備
    注: 注射器は、ダスト粒子のマイクロ ピペットを目詰まりの危険性を減らすために注入の開始の直前に準備する必要があります。
    1. フィッティング キット リムーバブル ニードル圧縮を使用して 1 マイクロリットル注射器にガラス管をマウントします。しっかりと堅く、安全な適合を保障するナットを固定します。
    2. 滅菌蒸留水 1 マイクロリットル注射器を入力し、プランジャーでそれを押して起動します。
      注: 先端から水が簡単に付属していませんので、あまり抵抗がある、マイクロ ピペットがブロックされている可能性が高いと交換する必要があります。
    3. 電子制御マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに注射器をマウントします。マイクロ ピペットで何かに触れないように注意してください。
    4. ガラスシリンジを水とウイルス間のバブルを作成する空気の約 1 μ L を描画します。
    5. 脳定位固定装置のフレームを用いた液滴にマイクロ ピペットの先端を移動慎重にパラフィン フィルムの一部にウイルス液の 2.5 μ L 液滴を配置し、描画します。、その後、慎重にプレス調剤ウイルス ソリューションのビットは、先端に現れるまで。
    6. 注射器を撤回し、ペンを使用して、スケールでピペットをマークし、ウイルス ソリューションのレベルに注意してください。これはプログラムに注入が進んでいるかどうかの監視を促進します。
  9. 脊髄内注射
    1. 硬膜の穴の上、マイクロ ピペットの先端を移動して、硬膜のわずかなくぼみを指摘するまでダウンします。脊髄の後角への注入を対象とするには、組織の機械的な安定のために (速度 1 mm/s) 100 μ m の連続した単位で 500 μ m とし、200 μ m を下に移動します。
      注: 先端の最終深さ 300 μ m をここでは、対象領域に応じて適応することができます。
      1. 組織が侵入に抵抗力がある、マイクロ ピペットが硬膜に引くかもしれない。この場合、撤回、穴を覆うまたは浸透の試みを繰り返す前に正しく硬膜を穿孔する針を再度使用に少し移動します。
    2. 300 のターゲット注入量をポンプをプログラム 50 nL/min とスタート ボタンを押しての注入速度で注入を開始する nL。
    3. 注入が完了した後は、ウイルスのレベルが減少しているかどうかを参照してくださいし、ゆっくりと注射器を取り消す前に平衡に圧力を許可する追加の 3 分の場所に、マイクロ ピペットを残すスケールを確認してください。
    4. ステップ 2.9.1.-2.9.3 を繰り返します。他の 2 つの注入のサイト。
  10. 縫合と回復
    1. 脊髄のクランプとマウスの下のクッションを取り外します。
    2. 非吸収性縫合糸の吸収性縫合糸で表在組織層と皮膚を縫合、中断の stiches 層で傷を閉じる。縫合の傷にヨウ素消毒剤を適用します。
    3. 麻酔を終了し、それがその家のケージに戻る前に回復するまで熱マットに動物を残します。
  11. 術後のケア
    1. 手術当日、次の日、その後 2-3 日毎に動物の健康を監視します。動物は、通常の歩行、(体重、目、毛皮、および動作)、健康的な外観があり、創傷を治癒します。
    2. 鎮痛治療を続ける (例えば、0.1 0.2 mg/kg ブプレノルフィン皮下) に応じて、1 日 3 回。

3. 行動および形態学的解析

  1. 行動分析
    注: は、新しい実験環境に適応するように測定を開始する前に、少なくとも 30 分のそれぞれのセットアップに対応するために動物を許可します。
    1. von Frey テストします。
      1. についての個々 のコンパートメントに動物を個別に配置金属格子の床に 10 cm × 10 cm。
      2. 動的 von Frey フィラメントを注射部位に同側の後足の足底の表面を刺激します。動物が刺激から前足を撤回する力を注意してください。
      3. 5 回を繰り返し、それぞれの動物のための六つの測定から平均撤退しきい値を計算します。
    2. ピン プリック テスト
      1. についての個々 のコンパートメントに動物を配置金属格子の床に 10 cm × 10 cm。
      2. 肌の浸透せず鈍化 26 G 針、注射部位に同側の後足の足底の表面を刺激します。動作のスコアとしてゼロ (反応しない) または 1 (反応)。
      3. 9 回刺激間 3 分の間隔で繰り返し、各動物のため 10 の測定からの回答率を計算します。
    3. DREADD リガンド クロザピン N-オキシド (CNO) の注入
      1. 室温で保存することができますジメチルスルホキシド (DMSO) 0.2 mg/μ L の原液を作成する CNO を溶かしてください。
      2. 実験の日、希釈原液滅菌の 0.9% の塩化ナトリウム 0.2 μ g/μ L と 10 μ L/g 体重を腹腔内に注入します。車両制御動物を注入 (0.2% DMSO 0.9% の NaCl)。
        注: 経験によるとピーク挙動に及ぼす影響ことが予想される 1-3 h 注入後、でき効果が完全に治まる 24 h 後。グリシン作動性神経ニューロンのアクティベーションの場合痛みやかゆみの応答が減少を含む行動を観察しました。DREADD を介したニューロンの活性化により誘発される行動は、脊髄ニューロンのターゲット サブセットに依存します。
    4. かゆみを誘発する掻痒の注入
      1. 0.9% の掻痒を溶かす塩化ナトリウム 8 mg/mL (クロロキン) または 10 mg/mL (ヒスタミン) のソリューション。CNO 投与後 2 h は、脊髄注射部位に同側の後足の足底の表面に皮下 pruritogen または車両ソリューションの 10 μ L を挿入します。また、注入、pruritogen 掻き自体シェービングによる忌避行動を削減する 1 日前に剃られているふくらはぎ。
    5. 自発的な Nocifensive や Pruritogen によるかゆみの動作を分析する録画
      1. 少し床に彼らのそれぞれの家ケージから寝具の透明なコンパートメント (直径約 10 cm) に個別に動物を配置します。
      2. Pruritogen 誘起挙動を記録する動物の自発のレコードに 5 分と 30 分のビデオテープに録画します。5 分の箱にオフライン動画を分析します。
    6. 痛みかゆみ行動対
      1. 観察し、尻込み、舐めると行動をかむことに注意してください。
        注: は、かゆみに関連付けられてをかむに対し、痛み、レスポンスを考慮尻込みと患部をなめます。
      2. 通常の速度で動画を分析、舐めるか、または影響を受けるサイトをかむマウスするのに費やした時間を測定、またはより正確な区別をなめると反射をかむのスローモーションで測定します。また、なめる・かむ/尻込み発作の数をカウントします。
  2. 形態素解析
    1. 1 ウイルスの行動実験の終わりに注射後 3 週間から形態素解析を実行します。
      注: 紹介して注入後、48 h としてすぐに eGFP 発現を検出が、数日、あるいは数週間、このような式に増加大幅以内が分かった。強い記者式とセル、インキュベーション (灌流まで脊髄内注射) からの 1 週間は十分にあります。弱い遺伝子発現、弱いプロモーターや弱い蛍光物質、ウイルスと細胞の長い式は、検出可能なレベルを確保するため必要があります。
    2. ティッシュの固定
      1. 各マウス transcardially を灌流最初に 100 mL とし、冷たい人工髄液 (アプライド) 溶液 (塩化ナトリウム 125 mM、NaHCO3 NaH2PO4 1.25 mM、D-グルコース KCl 2.5 ミリメートル、および CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM 20 mM 25 mM)、20 mL の4% (0.1 M リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.4) の冷たいパラホルムアルデヒド。
        注意: パラホルムアルデヒドは毒性があり注意して処理する必要があります。
      2. すぐに腰椎の脊髄を分析し、後氷の上 4% パラホルムアルデヒドで 2 h のための組織を修正します。0.1 M リン酸ナトリウム緩衝 (pH 7.4) と固定後の組織が簡単に洗って、4 ° C で一晩 (0.1 M リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.4) の 25% ショ糖液でインキュベート
      3. クライオスタットに 30 μ m cryoprotected 組織を切り取って顕微鏡のスライドのセクションをマウントします。
    3. 免疫蛍光染色
      1. PBS で簡単な洗浄後適用ソリューションをブロックの 300 μ L (0.3% の 10% 通常ロバ血清トリトン PBS) 室温で 1 h のセクションに。
      2. 解決を妨げるの一次抗体の組み合わせでそれぞれ 300 μ L とスライドを孵化させなさい (材料表参照) 4 ° C で 1 泊以上PBS の各 5 分のための 3 回のセクションを洗います。
      3. 室温で 1 時間ブロッキング液で二次抗体のそれぞれの組み合わせでスライドを孵化させなさい。PBS の各 5 分のための 3 回のセクションを洗います。
      4. 簡単に ddH2O、スライドをリンスし、蛍光灯取り付け媒体を用いた coverslips をマウントします。
      5. 20 x、40 x 目的を搭載した共焦点顕微鏡を用いた蛍光画像を取得します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

下さい rAAV マーカー蛋白質の脊柱の注入によって得ることができる表現のレベルを説明するために最初に AAV1 を注入しました。野生型マウスの腰椎の脊髄に CAG.eGFP。3 注射間隔を約 1 mm 離れて生産 L5 腰椎脊髄セグメント L3 のほぼ連続的な感染症 (図 1A-C)。脊髄の表面から 300 μ m の深さでウイルス注入は、脊髄後角細胞の支配的な感染に します。ただし、感染した細胞も見つかりませんでした腹側角 (図 1)。次に、目標は、Cre トランスジェニック マウスに注入すると Cre 依存下さい rAAV 下さい rAAV による発現の違いを説明するためにだった。したがって、Cre 依存 AAV1 を注入しました。GlyT2::Cre トランスジェニック マウスの脊髄に CAG.flex.eGFP ベクトル。として前に、eGFP 発現が背側と腹側のホーンにみられました。しかし、予想通り、eGFP ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

通気の脊柱の注入は、高時間・空間のソリューションと脊髄細胞の解析を有効にする研究所の強力な技法になるかもしれません。このプロトコルにより、後肢、末梢神経を拡張するニューロンによって支配されている 3 つの主要な脊髄セグメントの伝達です。3 つのセグメントを伝達堅牢かつ再現可能な行動データを生成します。また単一脊髄内投与後可能なより大きい感覚領域のテストができます。同じインジェクション政権により足をテストするため、たとえば、(von Frey、ハーグリーブス、等) と太もも (皮内注射、メカノ受容体の刺激)、従って拡大に対処できる感覚。

重要なステップ:

堅牢な形態および行動データを取得するため、人工物を避けるために重要ないくつかの手順があります。ウイルスのベクトルのデザインとプロモーターと血清型の選択は、伝達効率と導入された領域の範囲に強力な影響を持つことができます、したがって行動の結果に (ウイルスの拡散と伝達効率の詳細についてを参照してください

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品への厚い支援をハンス ・ ウルリッヒ通が惹起されるを感謝いたします。ヘンドリック ・ Wildner は、オルガ Mayenfisch 財団によって支えられました。我々 は Lmx1b 抗体のカルメン ビルヒマイヤーを感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
機器
マイクロピペットプーラーDMZ-Universal-Electrode-PullerZeitzNA
麻酔ユニット:Oxymat3酸素濃縮器WeinmannNA
麻酔ユニット:VIP 3000獣医用気化器MidmarkNA
ヒートマット:Mio Star Thermocare 100Migros
電気シェーバーリップスBT9290
手術用顕微鏡(OPMIピコ)ツァイスNA
小動物定位固定装置KopfNA
ニューロスターステレオドライブ(オプション)ニューロスターNA
モデル51690カニンガムマウス脊椎アダプターハーバード装置72-4811
ド装置70-3601PHDウルトラシリンジポンプ
l ガラス マイクロリットル シリンジハミルトン7635-01
ハミルトン 取り外し可能な針 (RN) 圧縮フィッティング 1 mmハミルトン55750-01
細かい歯科用穴あけ装置: 長田成功 40長田OS-40
球面カッター、0.5mmブッシュ12001005B
電子フォン フレイ麻酔計IITC23905
flexible von Frey hairsIITC#7
LSM710 Pascal 共焦点顕微鏡ZeissNA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat 対物レンズZeissNA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar 油浸対物レンズZeissNA
名Companyカタログ番号コメント
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cmFine Science Tools10004-13
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08
Adson Forceps, 1 x 2 teeth, 12 cmFine Science Tools11027-12
Friedman-Pearson rongeurs、湾曲、0.7 mmカップFine Science Tools16121-14
Dumont #2 椎弓切除鉗子Fine Science Tools11223-20
Olsen-Hegar ニードルホルダー、鋸歯状、クランプ長 8.5 mmFine Science Tools12002-12
Fine Forceps #5Fine Science Tools11254-20
Name会社名カタログ番号コメント
消耗品および化学薬品
薄肉ガラスキャピラリー、外径1mmWorld Precision InstrumentsTW 100-3
リンジ(1、5、20 ml)B.ブラウン(9166917V、4606051V、4606205V)
26G 斜めの針B. ブラウン4665457
滅菌メスの刃B. ブラウンBB523
外科用縫合糸 Safil Quick+ 4/0, 吸収性B. ブラウンC1046220
外科用縫合糸 Premilene 5/0, 非吸収性B. ブラウンC0932191
滅菌 PBS または生理食塩水 (0.9%)NA
エタノール、70%(消毒剤)NA
ヨウ素溶液(例:Braunol)B.ブラウン18380
薬(例:アタンイソフルラン)Provet2222
AldasorberProvet333526
鎮痛薬(例:ブプレノルフィン:テムゲシック)個別GTIN:7680419310018
眼科軟膏(例:vita-pos)Pharma medicaGTIN:4031626710635
綿棒(例:体外受精Hartmann1628100
顔面ティッシュ(例:から)Uehlinger AG2015.10018
Superfrost plus microscope slidesThermoScientific
Namestrong>Companyカタログ番号コメント
マウス
C57BL/6Jマウス(野生型)ジャクソン研究所RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/Jマウス(RORβCre)ジャクソン研究所RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/Jマウス (R26Tom)ジャクソン研究所RRID:IMSR_JAX:007914
名会社名カタログ番号コメント
Viral vectors
AAV1です。CB7です。CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)ペンベクトルコアAV-1-PV1963
AAV1。CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)ペンベクトルコアAV-1-ALL854
AAV1。CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)		ペンベクターコアAV-1-ALL864
AAV1。EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)Penn Vector Coreカスタム生産
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))Penn Vector CoreCustom production
NameCompanyカタログ番号Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFPAddgene20298
NameCompanyカタログ番号Comments
Bacteria
MDS42ScarabGenomics
Stbl3ThermoScientificC737303
名前会社カタログ番号コメント
Reagents
EndoFree プラスミド マキシ キットQuiagen12362
NucleoBond PC 500Machery &ナーゲル740574
クロザピン-N-オキシド(CNO)Enzo Life SciencesBBL-NS105-0025
クロロキン二リン酸塩SigmaC6628
ヒスタミンSigmaH7125
DapiInvitrogenD3571
名前会社カタログ番号コメント
抗体(希釈)
ウサギ抗GFP (1:1000)分子プローブRRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000)アブカムRRID:AB_10711153
ヤギ抗Pax2 (1:200)R &D SystemsRRID:AB_10889828
モルモット抗Lmx1b (1 : 10 000)Dr Carmen BirchmeierMuller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)DakoCytomationRRID:AB_10013382
ロバで産生された二次抗体 (1:800)Jackson ImmunoResearch LaboratoriesNA
717614700000フィナノマイトハーバーハミルトン701 RN 10 &muとシ麻酔から) J1800AMNZ

参考文献

  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413(2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313(2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306(2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

CreGlyT2 Cre

関連記事