住セルイメージ投射は、固定細胞イメージングだけで達成可能ではない単一セルまたは全体人口の豊富な情報を提供します。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング プロトコルを説明します。
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この記事について
サマリー
要約
住セルイメージ投射は、直接時間の長時間にわたって単一のセルの生物学的現象を視覚化するために使用できる強力な手法です。過去 10 年間新しい、革新的な技術は、大きく住セルイメージ投射の実用性を強化しています。セルでフォーカスで保つことができるようになりました、継続的に細胞培養条件の下で維持された 37 °C と 5% CO2しながら数日間かけてイメージします。さらに、異なる実験条件を表す複数のフィールドの表示を取得できます、同時に高スループット実験データを提供します。住セルイメージ投射は、直接可視化と細胞の動的イベントの一時的な定量を可能にする、固定細胞のイメージングに重要な利点を提供します。住セルイメージ投射もだろうそうでなければ見逃している人口に基づく試金を使用して単一のセルの動作の変化を識別できます。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング プロトコルについて述べる.逮捕されたのかどうか有糸分裂を可視化する有糸分裂または中間期にタイム スリップから直接セルは死にを紹介します。蛍光ユビキチン化による細胞周期のインジケーター (FUCCI) システムを使用して、細胞周期を入力し直すことができる分裂すべりから生まれた間期細胞の割合を評価する方法についても述べる。最後に、核膜破壊イベントを識別するために生細胞イメージング法について述べる。
概要
抗有糸分裂薬各種固形腫瘍の化学療法で用いられてきた、しばしば素晴らしい効果1,2,3を表示します。機械論的に、これらの薬は、通常の細胞分裂の進行を妨害、急速に増殖の細胞分裂の逮捕を促進する癌細胞。しかし、分裂逮捕に応答細胞の運命は非常に変数: 有糸分裂終了など四倍体細胞 (分裂のスリッページと呼ばれる、プロセス) として中間期に戻る一方、細胞の一部を経る有糸分裂から直接細胞死、4、 5,6,7,8。これらの間期細胞がアポトーシスを実行、永久的な細胞周期停止を受けるまたはも細胞周期4,5,6,7,8
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プロトコル
このプロトコルは非変形および染色体安定した網膜色素上皮 (RPE-1) 細胞株を用いた生細胞イメージング実験に焦点を当てています。ただし、このプロトコルは培養条件は、必要に応じて調整されます限り、付着性のセル行に合わせることができます。すべてのプロシージャは、バイオ セーフティ制度と倫理的なガイドラインおよび規制遵守しなければなりません。
1. 住セルイメージ投射のためのセルの準備
-
人間ヒストン H2B 焼付蛍光蛋白質 (例えばH2B GFP)、または (参照45FUCCI 発現細胞を生成する方法の詳細なプロトコルを見つけることができます) FUCCI システムを表現する新鮮な解凍と早期通過 RPE 1 セルを使用します。分裂細胞の運命を評価します。
- 核破壊の周波数を測定するには、RPE 細胞 H2B GFP とタンデム ダイマー単一核局在化信号 (NLS-TDRFP) に溶ける赤の蛍光蛋白質の表現を使用します。
注: 3 つの緑色蛍光タンパク質の構造単一の核局在化信号にタンデムで融合 (GFP3NLS) (参照42) のように破断を示すにも使用されています。 - 適切な培地に 10 cm 組織培養皿の細胞を維持します。網膜色素上皮細胞に保持さ....
- 核破壊の周波数を測定するには、RPE 細胞 H2B GFP とタンデム ダイマー単一核局在化信号 (NLS-TDRFP) に溶ける赤の蛍光蛋白質の表現を使用します。
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結果
上記プロトコルを使用して、H2B gfp RPE 細胞は抗有糸分裂または車両コントロール (DMSO) と扱われ、住セルイメージ投射によって分析されました。解析では、100% コントロール分裂 RPE 細胞の有糸分裂 (図 1 a, 1 D) を入力した後後期は平均 22 分を開始することを明らかにしました。対照的に、パクリタ キセルで治療網膜色素上皮細胞は、深い分裂逮捕数時間 (図 1) を展示しました。イメージング明らかにしたこれらの有糸分裂逮捕された細胞の 48% が有糸分裂細胞死 (図 1 b1E) を受けたと残りの 52% は分裂すべり (図 11E) を施行しました。
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ディスカッション
長期住セルイメージ投射の最も重要な側面は、イメージされている細胞の健康を確保することです。細胞が温度・湿度・ CO2のレベルについての不良条件など、最小限の余分な環境ストレスにさらされることが不可欠です。50セルの動作に影響を与える知られているストレスをイメージングにも蛍光励起照明から光損傷を制限することが重要です。光損傷を制限することは、48の詳細に関する説明と複数の方法で実現できます。一般的には、十分明るい蛍光信号を生成する必要な最短露光時間を使用して効率的に光毒性を抑えたり、細胞を追跡することをお勧めします。ただし、セルが 10-20 分毎 (つまりピクセル飽和に近づく) 長い露光とは、1 回だけ作成されますだけ容認 (ただし、これは、蛍光体や細胞の種類ごとに経験的に決定する必要があります)。イメージ化された細胞は環境・ イメージングのストレスに敏感なので、それは制御の細胞を常に生細胞イメージング実験に含まれ、通常の増殖を確認するために監視は不可欠です。
長期.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
AFB、MAV NJG 原稿とエイドリアン TDRFP NLS コンストラクトの Salic コメントありがとうライアン クインしたいと思います。AFB、MAV は、日の出生体分子薬理学研修助成金 5T32GM008541 によって賄われています。NJG は、Shamim とアシュラフ Dahod 乳房がん研究所のメンバーであるおよび NIH 助成金 GM117150 と CA 154531、カリン Grunebaum 財団、スミス家族賞プログラム、サール学者プログラム、および悪性黒色腫研究に支えられて同盟。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| フェノールレッドフリー、DMEM:F12培地 | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml ペニシリン、および 100 mg/ml ストレプトマイシン。 | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass-bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmentalチャンバー | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL コニカルチューブ | フィッシャーブランド | 05-539-12 | |
| 10 cm ポリスチレン組織培養プレート | ファルコン | 08772E | |
| 10 mL 使い捨て血清ピペット | フィッシャーブランド | 4488 | |
| 5804R 15 アンペア 遠心分離機 | エッペンドルフ | 97007-370 | |
| 1000 マイクロリットル ピペット | ギルソン | ピペットマン クラシック | |
| 20 マイクロリットル ピペット | ギルソン | ピペットマン クラシック | |
| p1000 ピペットチップ | シャープ | p1126 | |
| p20 ピペットチップ | シャープ | p1121 | |
| RPE-1 セル | ATCC | CRL-4000 | |
| インキュベーター Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| 血球計算計 | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS 倒立顕微鏡 for Live Cell | Imaging Micro Video Instruments, Inc. | ||
| 従来機X-Yステージシステム、白色光LEDイルミネーター | マイクロビデオインスツルメンツ | 500-H117P1N4 | |
| Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500 H31XYZE | |
| アンドールデジタルカメラ | マイクロビデオインスツルメンツ | D10NLC | |
| ニコン NIS Elements ARソフトウェア | マイクロビデオインスツルメンツ株式会社 | ||
| マイクロビデオ機器 | 用LEDイルミネーター | SOLA-E | |
| InVivo 環境チャンバー with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS パーフェクトフォーカス電動ノーズピース | マイクロビデオインスツルメンツ株式会社 | ||
| Ti-Cシステムコンデンサータレット | マイクロビデオインスツルメンツ(株) | ||
| Ti-C LWD LWD システムコンデンサータレット用レンズユニット | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Te-C LWD Ph1モジュール | マイクロビデオインスツルメンツ(株) | ||
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. (英語) |
参考文献
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3
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