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方法論記事

RNA 干渉法の活用: ゴキブリのリポソーム キャリアで二本鎖 RNA の経口デリバリー

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DOI：

10.3791/57385

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2018年5月1日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Biology Centre, Institute of Entomology, Czech Academy of Sciences, 3Faculty of Science, University of South Bohemia, 4Institute of Evolutionary Biology, CSIC-UPF

この記事について

サマリー

この原稿は、リポソームにカプセル化された二本鎖 RNA の経口摂取によってドイツのゴキブリの中腸における遺伝子発現の減少を示しています。

要約

RNA 干渉 (RNAi) 多数の遺伝子の生物学的機能を暴くため広く用いられてきた、重要な遺伝子発現の中断動作害虫コントロール ツールとして想定されました。二本鎖 RNA (dsRNA) を正常に配信のインジェクション、給餌と、浸漬など、さまざまな方法が報告されている dsRNA の経口デリバリーによる RNAi の効率は非常に異なる昆虫グループ間で可変。チャバネゴキブリチャバネゴキブリは、以前発表された多くの研究で示されている dsRNA の注入に非常に敏感。本研究では、リポソーム キャリアとカプセル化された dsRNA が腸ジュースで dsRNA の劣化を遅らせるに十分であることを示す方法について説明します。とりわけ、大幅リポソームによってカプセル化された dsRNA の連続的供給、中腸におけるチューブリンの発現を減少させる、ゴキブリの死をもたらした。結論としては、定式化と核酸に対して dsRNA を保護する dsRNA リポプレックスの利用かもしれない害虫制御のための RNAi の実用的な使用、将来的に。

概要

RNAi は、多くの真核生物1の dsRNA の分子によってトリガーされる転写後サイレンシング経路の機構を通じてノックダウン遺伝子発現する効果的な方法として実証されています。過去の研究では、RNAi オゾン注入を介して特定の遺伝子発現および/または昆虫2,3のさまざまな分類群の dsRNA の供給によって動作する開発から遺伝子の機能を研究するための有用なツールとなっています。特異性と破壊効果の頑健性のため、RNAi のアプリケーションは現在害虫制御管理4、5のための潜在的な戦略として検討されています。ただし、RNAi の効率は昆虫種間対象別の遺伝子と配信方法によって異なります。証拠の成長するボディは、リボヌクレアーゼによる劣化は、dsRNA の不安定性 RNAi5,6の限られた有効性の重要な要因であることを示唆しています。例えば、 Manduca sextaの RNAi の感度が低いは、体液混合 dsRNA が 1 時間7内ですぐに劣化したという事実によって説明されています。同様に、効率的に摂取された dsRNA が低下する、中腸でアルカリ性の核酸分解酵素の存在の異なる昆虫8,9,10で RNAi 効率が低い相関が強い。

DsRNA の口頭配達は害虫制御戦略の RNAi のアプリケーションの特に興味深いですが中腸における核酸による dsRNA の劣化を遅らせる方法はまだ開発されていない、有効なことを確認する可能性のあるだろうRNAi を介して供給します。ただし、dsRNA、カイコ、例えば50 μ g の大量の餌やイナゴ種で 8 日間 (合計 8 dsRNA μ g)、継続的に供給で dsRNA の口頭配達する RNAi の応答が報告されています。チャバネゴキブリ germinicaチャバネゴキブリが dsRNA11,12,13,14、注入による RNAi に敏感を介して供給 dsRNA に敏感ではないです。最近では、林ら(2017) は dsRNA カプセルこと成功した rnai ノックダウンするリポソーム キャリア結果とα-チューブリン遺伝子発現15チャバネゴキブリの中腸とトリガー有意な死亡率を示しています。中腸における dsRNA の劣化は、口腔の RNAi のための制限要因は、リポソーム キャリア劣化は、腸内で強いヌクレアーゼ活動とその他の昆虫に適用が容易ですから dsRNA を保護する手段として役割を果たします。注特定のトランスフェクション試薬を選ぶ理由の現在のプロトコルのリポソーム キャリアはそれは毒性が少なく、昆虫の細胞ラインの transfection のためテストされていますを使いました (材料の表を参照) によると、節してください。Gharaviらの異なるリポソーム トランスフェクション システムとの比較によって(2013)16、株小さい干渉の RNA (siRNA) の効率はおよそこれと他の昆虫の17,18 dsRNA 配信システムに使用されている他の市販システム間で同じ.さらに、私たちの供給法は各ゴキブリで dsRNA の適切な量を摂取し、結果が得られる堅牢で確認をように十分注意してください。要約すると、議定書と結果を示す、dsRNA リポプレックスを使用して dsRNA の安定性を向上させる将来的に害虫駆除のための有望なアプローチである、RNAi の戦略の口頭配達のデザインへの扉を開きます。

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プロトコル

1 合成と dsRNA の準備

  1. 標的遺伝子の 3' 非翻訳領域の dsRNA のターゲット サイトを識別します。Α-チューブリン (浴槽) 遺伝子をターゲットに、dsTub を使用 (GenBank 受入番号: KX228233) と dsEGFP のシーケンスから否定的な dsRNA のコントロールは、強化された緑色蛍光タンパク質 (EGFP;GenBank の受入番号: LC311024)。
  2. T7 プロモーター配列を含む遺伝子特定のプライマーで dsRNA テンプレートを合成する標準 PCR 増幅を実行 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')。PCR 増幅条件と使用されるプライマー情報は、林らによってそれらで報告されました。(2017)12 (材料の表を参照してください)。
  3. T7 転写を用いた dsRNA 準備を進めるキット (材料の表を参照してください)、製造元の指示に従います。
    注:高数量 dsRNA、(合計 40 μ L) の 1 つの管の 2 つの反応をミックスし、37 ° C で一晩インキュベートします。
  4. DNase の 2 μ L を追加 (材料の表を参照してください) に dsRNA サンプル ダイジェスト DNA テンプレートを 37 ° C で 15 分間。
  5. 200 μ L の抽出試薬を追加 (材料表参照) 40 μ L のクロロホルムし渦。
  6. 4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心し、新しい微量遠心チューブに上清 (150 μ L) を収集します。
  7. 150 μ L のイソプロパノールを追加し、氷で 15 分間インキュベート dsRNA を沈殿させます。
  8. 4 ° C で 13,000 × g で 15 分間遠心し、上清を除去します。
  9. DsRNA ペレットを洗浄する 70% エタノール 200 μ L を追加します。4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心
  10. エタノールを削除し、エタノールの洗浄ステップを繰り返します。
  11. エタノールと、3 分間遠心濃縮、乾燥 dsRNA ペレットを削除し、RNase フリー水で dsRNA を再懸濁します。
  12. マイクロ ボリュームが紫外可視分光光度計を使用して精製された dsRNA の数量を決定 (材料表参照) 製造元の指示に従って、必要な濃度 (例えばの準備のための 0.25 μ g/μ L に調整dsRNA リポプレックス)。
  13. 3 ヵ月の-20 ° C で dsRNA のサンプルを格納します。

2. dsRNA リポプレックスの準備

  1. トランスフェクション試薬の 4 μ L を希釈 (材料表参照) 5% ブドウ糖溶液の 4 μ L を追加することによって。5% ブドウ糖液の 4 μ L を追加することで (1 μ g) dsRNA の 4 μ L を希釈します。
  2. 希釈したリポソーム試薬溶液すぐに希釈された dsRNA のソリューションにすべて一度に追加します。簡単に、それらをミックスし、25 ° C で 15 分間インキュベートする渦
    注:逆の順序でソリューションを混在させないでください。
  3. DsRNA リポプレックス使用の準備ができています。準備の 1 時間内で使用し、1 時間後に破棄します。
    注:製造元の指示に従って、リポプレックスをできるだけ早く使用必要があります。

3. 体液や腸ジュースから菌体外酵素のコレクション

  1. 昆虫生理食塩水バッファー (10 x の在庫)
    1. 109.3 g 塩化ナトリウム、15.7 g KCl、6.3 g CaCl2、および 8.3 g MgCl2·6H2O. 二重蒸留水 900 mL をミックスします。
    2. 6.8、pH 調整、1,000 mL までを記入してください。
  2. 体液コレクション
    1. 3 分の移動しないまで氷にゴキブリを麻酔します。
    2. 2 本の指 (親指と人差し指) でゴキブリを押しながらゴキブリの腹側を上げます。
    3. 解剖はさみを使用して、後ろ足の coxa の先端をカットします。
      注:Coxa と転子間の接続交差点をカットします。Coxa の他の部分の切除は体液を収集するために効率が低下します。
    4. 中指で軽く腹部を圧迫し、10 μ L マイクロ ピペットを使用して切開から出血体液を収集します。
    5. 微量遠心チューブにいくつかゴキブリ (5 人) から体液をプールします。
      注:マイクロ遠心チューブ用メラニン化を防ぐために氷の上を保ちます。男性のゴキブリから得られた体液量の平均は 2-3 μ L です。
    6. 10、ベンチトップ遠心分離と簡単に体液をスピン s。
    7. (すなわち、10 μ L)、体液の適切なボリュームを転送し、1 x 昆虫生理食塩水バッファーの 50 μ L でそれをミックスします。
    8. 血球スピンダウンに 4 ° C で 1,000 x g で 10 分間遠心します。きれいな遠心チューブに上清を転送します。
    9. A28015を測定することにより微量紫外可視分光光度計を使用して総蛋白質濃度を定量化します。
    10. 同じタンパク質濃度 (6 mg/μ L の総蛋白) を持っている各サンプルを調整します。
  3. 腸ジュース コレクション
    1. 氷の上のゴキブリを麻酔します。ゴキブリ腹側解剖皿の上で固定冷たい 1 x 昆虫生理食塩水バッファー昆虫ピンを使用します。
    2. 高級ピンセットで腹部を解剖します。昆虫生理食塩水バッファー × 1 新鮮な料理に全体腸 (フロント、中間、および後肢腸を含む) を削除します。
    3. 前部および後ろ足の腸を削除し、100 μ L 昆虫生理食塩水バッファーを含む微量遠心チューブに腸をすばやく転送します。
    4. 同じ管で 10 の渦 6 ゴキブリから蚊をプール s。
    5. スピン ・ ダウン血液細胞と腸の組織に 4 ° C で 1,000 x g で 10 分間遠心します。きれいな遠心チューブに上清を転送します。
    6. A28015を測定することにより微量紫外可視分光光度計を使用して総蛋白質濃度を定量化します。
    7. 同じタンパク質濃度 (6 mg/μ L の総蛋白) を持っている各サンプルを調整します。

4. dsRNA 劣化分析

  1. 新鮮な裸の dsRNA の dsRNA リポプレックス (1 μ g) 4 μ L を準備します。
  2. 体液、または腸から dsRNA 抽出ソリューション昆虫生理食塩水バッファー (コントロール) の 10 μ L の酵素ジュースをミックスします。
  3. 2 μ L の酵素活性を阻害するコントロールとして試料を分離するグリコールエーテルジアミン四酢酸 (20 mM) または RNase フリー水のいずれかを追加します。
  4. 1 時間 (6、12、または 24 時間以上) 25 ° C でインキュベートします。
  5. 200 μ L の抽出試薬と 40 μ L のクロロホルム、渦、追加します。
  6. 4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心し、新しい微量遠心チューブに上清 (150 μ L) を収集します。
  7. 150 μ L のイソプロパノールを追加し、氷で 15 分間インキュベート dsRNA を沈殿させます。
  8. 4 ° C で 13,000 × g で 15 分間遠心し、上清を除去します。
  9. DsRNA ペレットを洗浄する 70% エタノール 200 μ L を追加します。4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心
  10. エタノールを削除し、エタノールの洗浄ステップを繰り返します。
  11. エタノール、10 μ L の RNase フリーの水で 3 分再懸濁します dsRNA の遠心濃縮、乾燥 dsRNA ペレットを削除します。
  12. 1.5% の agarose のゲルの電気泳動によって扱われた dsRNA の整合性をチェックします。

5. dsRNA の内服

  1. ドライフード (犬の食事) の自由食事にゴキブリを維持します。DsRNA 摂取実験の前日、ゴキブリから水の供給を奪います。
  2. フレキシブル鉗子 (図 1、ステップ 5) でその翼を掴んでゴキブリを保持します。
    注:ゴキブリの体の部分をつかむか。
  3. セクション 2 の説明に従って、フィード dsRNA リポプレックスとして裸の dsRNA を準備します。
    注:前に餌、dsRNA リポプレックスをたて準備されるべき。
  4. フィードの dsRNA リポプレックスまたは裸の dsRNA の 4 μ L (250 ng) マイクロ ピペットで。
  5. ゆっくりピペット dsRNA ソリューションの液滴、ゴキブリの口器に近いし、ゴキブリは完全に液滴を摂取します。
  6. 8 日か 16 日間連続 (1 h 点灯後、消灯前に 1 h) は 1 日 2 回の摂取実験を実行します。
    注:ゴキブリは水だけ摂取実験中に dsRNA のソリューションまたはコントロール試薬 (例えば、ヌクレアーゼ フリー水、ブドウ糖溶液、リポソーム試薬) とマニュアル給餌を取得しました。
  7. ゴキブリに dsRNA 実験の摂取の 16 日後の水のボトルを提供します。

6. ノックダウンを評価します。

  1. 選択した時にポイント (dsRNA 摂取試験後 2、9、17 日) は dsEGFP と dsTub 扱われる昆虫を収集そして選ばれた組織 (例えば腸) を解剖します。
  2. 量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) を実行します。QRT PCR 増幅条件およびプライマー情報林らによって報告されました。(2017)12。
  3. コントロールと死亡を確認し、移動は、もはやゴキブリを削除は毎日昆虫 dsRNA 治療を評価します。

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結果

DsRNA の経口配信用プロトコルの簡易方式はで示した図 1、dsRNA リポプレックスの準備のため、主要な手順が表示されます。

チャバネゴキブリ、dsTub リポプレックス腸ジュースで培養を行った前のヴィヴォアッセイおよび dsRNA の整合性の中腸ジュースの dsRNA の劣化にリポソーム キャリアによって与えられる保護を調査するためにその後、1.5% の agarose のゲルに行った。図 2に示すリポソーム キャリア前のヴィヴォで 1 時間、少なくとも劣化に対して dsRNA を保護することができたに対し、強力な RNA のヌクレアーゼ活性チャバネゴキブリ(図 2A) の腸...

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ディスカッション

このプロトコルは、ドイツのゴキブリの中腸ジュースのリボヌクレアーゼ消化に対する保護を含む dsRNA リポプレックスの口頭配達を通じて効果的な RNAi のメソッドを示します。様々 な昆虫の種の他の研究のように、dsRNA8,9,10の劣化による dsRNA の口頭配達を通じて貧しい RNAi 効果がほとんどを占めています。このプロトコルには、腸内で分解に対して dsRNA の経口デリバリーにおける保護車としてリポソームが生成されます。さらに、dsRNA リポプレックスの準備は、簡単な口腔 RNAi として容易に適用できる特に腸内で強いリボヌクレアーゼ活性を持つ昆虫。

このプロトコルは異なる昆虫10,18,19で...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は台湾 (省の科学と技術、最も 100-2923-B-002-002-MY3、H.J.L.、106-2313-B-002-011-MY3) からの助成金によって支えられたチェコ共和国 (南ボヘミア州庁大学 GAJU 付与 065/2017/P Y.H.L) 付与、およびスペイン (スペイン経済省と競争力、CGL2012 36251 と CGL2015 64727 P コドーピング、およびカタロニアの政府への許可を付与 2014 SGR 619 コドーピングに);それはまた経済と地域開発 (コドーピング フェダーイン ・資金) の欧州基金から助成を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
GenJe Plus DNA in vitro トランスフェクション試薬シグナジェンリポプレックス製剤用SL100499
Blend Taq plusTOYOBO PCRBTQ-201
 4385612for qPCR
FirstChoice RLM-RACE KitInvitrogenAM1700for 3' UTR identification 
MEGAscript T7 転写キットInvitrogenAMB13345 dsRNA合成用
TURBO DNaseInvitrogenAM2239dsRNAからDNAテンプレートを削除
TrizolInvitrogen15596018 dsRNAまたはトータルRNA抽出用
RQ1 RNase-Free DnasePromegaM6101トータルRNAからDNAテンプレートを削除 
クロロホルム Sigma-AldrichC2432dsRNAまたは全RNA抽出用
2-PropanolSigma-AldrichI9516dsRNAまたは全RNA抽出用
エタノールSigma-Aldrich24102dsRNAまたは全RNA抽出用
ジエチルピロカーボネート、DEPCSigma-AldrichD5758RNaseフリー水調製
グルコース溶液Sigma-Aldrichリポプレックス製剤用
塩化ナトリウム、NaClSigma-AldrichS7653昆虫生理食塩水処方
塩化カリウム、KClSigma-AldrichP9333昆虫生理食塩水処方
塩化カルシウム、CaCl2Sigma-AldrichC1016昆虫生理食塩水処方
塩化マグネシウム六水和物、MgCl2.6H2OSigma-AldrichM2670昆虫生理食塩水処方
EGTA Sigma-AldrichE3889酵素阻害剤 
解剖ハサミF.S.T.ゴキブリ解剖
ファインピンセットF.S.T.ゴキブリ解剖
フレキシブルピンセットF.S.T.ゴキブリの抱え方 
ピペットマンレイニンP10サンプル調製
用微量遠心チューブAxygen MCT175C, PCR02Cサンプル調製
用ピペットチップ Axygenサンプル調製
vortexterDigisystemvm1000サンプル調製
Minispin 遠心分離機Gruffin GroupGMC 206液体スピンダウン用 
遠心分離機ALCPK121Rサンプル調製
pH メーター JENCO6071pH調整
マイクロボリューム分光光度計QuawellQ3000核酸定量
PCRサーマルサイクラーABI 2720テンプレートPCR用、または  dsRNA合成インキュベーション 
定量的リアルタイムPCRABI StepOne plus遺伝子発現量
真空濃縮器eppendorf5301dsRNA または total RNA extraction
Multipette eppendorfxstreamによるリアルタイムPCRサンプルローディング 
アガロース Iamresco0710核酸電気泳動
用 tub 遺伝子 specfifc フォワード プライマーtri-I バイオテクノロジーGGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
タブ遺伝子 specfifc リバース プライマートライ I バイオテックTCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub テンプレート フォワード プライマートライ I バイオテクノロジーTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA CAA GCC GGA GTG CAG 
dsTubテンプレートリバースプライマートライIバイオテクノロジーTAA、TAC、GAC、TCA、CTA、タグ、GGTT、GCT、GCT、GTC、TCG、CTG 
dsEGFPテンプレート フォワードプライマートライアイTAA TAC GAC TCA CTA タグ ggt atg gtg agc aag ggc gag
gag dsEGFPテンプレート リバースプライマートライアイバイオテクノロジーTAA TAC GAC TCA CTA タグ ggt ggc gga tca tga アグト TCA CC
タブ qPCRフォワードプライマートライアイバイオテクノロジーGGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
タブ qPCRリバースプライマートライ
ef1 qPCR フォワードプライマーtri-I biotechCGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCRreverse preimertri-I biotechCCT GCA GAG GAA GAC GAA G
Fast SYBR Green Master Mix ABI の G3285 遠心バイオテクノロジー アイ バイオテクノロジー

参考文献

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