このプロトコルでは、ラベルおよび Histone2B GFP BacMam 2.0 ラベルおよび回転のディスク共焦点顕微鏡システム使用して分裂期の細胞で生きている染色体の視覚化に簡単で便利な方法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
染色体分離されねばならない確実かつ均一に娘細胞に細胞分裂の間に。染色体分離の再現性は、紡錘アセンブリ チェックポイント (SAC) を含む複数のメカニズムによって制御されます。SAC は、有糸分裂を通して細胞の進行の防止のため、すべての染色体がスピンドル微小管に接続している場合を除き、複雑なフィード バック システムの一部です。染色体のラギングおよび異常な染色体分離機能不全の細胞周期制御チェックポイントの指標し、細胞分裂のゲノムの安定性を測定する使用ことができます。SAC の規制緩和は、染色体の分離中にエラーの蓄積により悪性細胞に正常な細胞の変形で起因できます。SAC の実装と複雑な動原体の形成は、キナーゼとホスファターゼ プロテインホスファターゼ 2 a などの相互作用で厳しく規制 (PP2A)。このプロトコルでは、遅れていた PP2A B56γ 調節サブユニットのノックアウト マウスから分離されたマウス萌芽期繊維芽細胞における染色体の生きているセルイメージ投射について説明します。このメソッドは、その他細胞周期制御イメージング技術フローサイトメトリーなど免疫細胞化学染色体の動的な時空間の可視化ではなく、細胞分裂の状態のスナップショットを提供するだけの欠点を克服します。有糸分裂の間。
概要
次のプロトコルでは染色体の分離とヒストン 2B GFP、BacMam 2.0 のラベリングおよび生きているセルイメージ投射使用してマウス萌芽期繊維芽細胞の細胞周期の間に細胞分裂の進行を可視化する便利な方法をについて説明します。
細胞周期制御チェックポイントは、染色体分配を監視し、セル1,2,3の遺伝的整合性の維持に重要な役割を果たします。誤隔離された染色体の蓄積異数性、ほとんどの固体腫瘍4の認刻極印である可能性があります。したがって、染色体不安定性を勉強する方法として染色体の遅れの検出を使用できます。
蛍光標識タンパク質ライブ染色体分配を視覚化するために使用される、mCherry タグの生成が遅れている染色体または H2B GFP タグ付きタンパク質遺伝子配達および分子生物学5相当な知識が必要です。ここで簡潔にするため、CL HB リージェントを呼びます CellLight Histone2B GFP BacMam 2.0 試薬の使用について述べる。この試薬は、すぐに使用することができます、従ってベクトル品質と完全性の心配がありません。さらに、この試薬では、潜在的に有害な治療または脂質や色素負荷化学物質の使用は必要ありません。従来の蛍光ラベルとは異なり CL HB リージェント汚れとは無関係 (すなわち。、膜電位)。CL HB 摂政を単にセルに追加し、タンパク質発現の夜通し孵化することができます。CL HB リージェントは、哺乳動物細胞ではレプリケートされません、バイオ セーフティ レベル (BSL) 研究所 1 の設定で使用できます。また、最もダイナミックな細胞分析を遂行する 5 日前まで、十分な時間のため一晩インキュベートした後このトランスフェクションを検出できます。
また、染色体の異常は、フローサイトメトリー、免疫組織化学または蛍光性の現場の交配 (魚) の6のなど様々 な技術によって調査できます。フローサイトメトリーは、異数性、測定することができる DNA 含量と細胞周期の細胞の位相に基づく研究に使用できます。フローサイトメトリーは、異数性を測定する使用できますが、染色体の誤った分離に関する情報は記載していません。魚および免疫組織化学の手法は、DNA や染色体に結合する蛍光プローブを使用します。これらの技術は細胞の人口の状態のスナップショットを提供する、彼らは生細胞イメージングにより行方不明の期間続く特定の細胞分裂の時空間的可視化を通じて取得する情報を許可しません。
このプロトコルは、遅れて染色体やノコダゾール扱われるマウス萌芽期繊維芽細胞 (MEFs) で PP2A-B56γ-マウスから分離した誤偏析染色体研究に使用されました。上記のアプリケーションのほかは、このプロトコルは、ラベルおよび細胞周期制御を研究するために使用できる様々 な細胞タイプにおける染色体分離または腫瘍細胞の染色体不安定性を視覚化するシンプルなツールを提供します。さらに、それも使用できますさまざまな薬物治療によって引き起こされる染色体不安定性の研究、遺伝子が染色体の誤った分離の結果ノックアウトの効果を研究します。
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プロトコル
食品医薬品局 (FDA) の研究施設で機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従い、これらの研究実験を行った。
1. 分離と培養マウス胚性線維芽細胞 (MEFs)
- 標準プロトコル7,8,9PP2A B56γ マウス系統と野生型の同腹仔からマウス萌芽期繊維芽細胞 (MEFs) を分離します。
- 3 通路の ExpandMEFs は凍結し、実験8必要になるまでを格納します。
2. 培養 Mefs 2 ウェル カバーグラスチェンバー用のライブ イメージング
- 500 ml ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM/f12 キー) を 10% 含む MEF 成長媒体の胎仔ウシ血清 (FBS)、1 X ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質、L-グルタミン (200 mM)、非本質的なアミノ酸 (NEAA) メディア 500 mL ボトル × 1。
- 37 ° C で予め温めておいた水風呂通路 3 野生型から冷凍 MEFs、PP2A-B56γ-マウスのバイアルを解凍します。
- 15 mL チューブに解凍 MEFs を転送し、ゆっくりと 10 mL のピペットを使用して 15 mL チューブに DMEM/F12 メディアの 20 mL の滴を追加します。
- T75 フラスコに DMEM/F12 成長媒体の 20 mL と共に MEFs を転送し、細胞が 70% 合流までそれらを展開します。密度は 4 倍または 10 倍の倍率で逆の顕微鏡を使用して推定されます。
- 吸引ガラスの牧草地を使用して培ピペットのボンネットの真空システムに接続された 0.25% トリプシン/EDTA の 3 mL を加える、DMEM/F12 成長媒体の反作用を停止する 5 分追加 3 mL 37 ° C で孵化させなさい。
- 室温で 5 分間 (300 x g) を低速度で細胞を遠心します。慎重に上澄みを除去し、再 37 の ° C の水浴中で加温 DMEM/F12 成長培地 1 mL の細胞ペレットを中断します。
- トリパン ブルー排除法またはその他の適切なセルを数える方法8を使用して細胞を列挙します。
- MEFs/ウェル 2 ウェル カバーグラスチェンバーの種子約 20,000。200 μ L/ウェル/F12 DMEM 培を追加し、37 ° C、5% CO2でそれらを一晩インキュベートして接続するセルを許可します。
3. 同期
- G0/G1 期で 0.1 %dmem/F12 成長培地で細胞を培養して MEFs を同期 G0/G1 期のセルの最大数を取得する、24 時間 FBS。
注: 血清飢餓は、好みの方法として使用された、さまざまな方法を逮捕10に必要な細胞の分裂の段階に応じて使用できます。
4. ラベリング
- 1.5 mg/mL の DMSO でノコダゾールの原液を準備します。ノコダゾールは G2/m 期で10微小管形成を阻害することによって細胞を逮捕します。
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結果
野生型と PP2A-B56γ-マウスから MEFs 2 よくチャンバー カバー ガラスのシードし、の接続を許可しました。2 日目、MEFs は 0.1% を使用して同期された FBS の 24 h。200 ng/mL メディアで MEFs 第 3 日ノコダゾールと 30 PPC CL HB regentwere は 37 で 18 時間培養° C、5 %co2。4 日目、回転するディスク共焦点顕微鏡システム (図 1) を使用してセルをイメージしました。生きている細胞イメージングが有糸分裂 (図 2) を NEBD からきて、個々 の細胞の運命を視覚化に使用されました。ノコダゾールは、G2M 段階で微小管形成阻害による野生型細胞を逮捕する知られています。そのポスト、ノコダゾール治療の野生型細胞が中期アッパー パネル (図 2) で逮捕されたことがわかっ...
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ディスカッション
正確な染色体分離を確保する細胞周期制御チェックポイントは、異数性とセル変換1,2,3を防ぐため。本研究でわかったその不活性化 PP2A B56γ 弱体化した紡錘アセンブリ チェックポイントで起因しました。ライブセル イメージング ノコダゾール9奏効した PP2A B56γ MEFs における有糸分裂時誤偏析染色体を観察することができました。
このプロトコルは、生きているセルイメージ投射のためのラベル染色体 BacMam 2.0 技術で生成された Histone2B GFP ラベルを利用しています。ラベルに重要な手順の 1 つは十分な表示を達成するために (PPC) のセルごとの粒子の右の量を計算します。10-50 PPC が最適な滴定を通して分かった。この試薬は、細胞に有毒であるかもしれないそれ故にラベルとラベル付きセルに毒性の間のバランスを達成する...
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
博士郭 Chiuan hung さんと博士 Bharatkumar 女子の原稿を改善した貴重なコメントをありがとうしたいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-グルタミン | Gibco | 25030081 | |
| MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X) | Gibco | 11140050 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水 | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| ウシ胎児血清 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| 極低温バイアル収納ボックス | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| 極低温バイアル | Corning/costar | 431416 | |
| T75フラスコ | Cellstar | 658175 | |
| 2ウェルチャンバーカバーガラス | Nunc | 155380PK | |
| セロメーター ビジョン セルプロファイラー | Nexcelom Bioscience LLC | セロメーター ビジョントリオ | |
| ノコダゾール | シグマ | M1404 | |
| セルライト ヒストン 2B-GFP、BacMam 2.0 | サーモフィッシャーサイエンティフィック インク | C10594 | |
| ツァイス細胞観察器 スピニングディスク共焦点顕微鏡システム | カールツァイス顕微鏡 | ツァイス細胞観察 SD | |
| ウォーターバス | サーモサイエンティフィック | 280シリーズ | |
| インキュベーター | 三洋商業ソリューション | MCO-18AIC(UV) | |
| クラスII 生物学的安全キャビネット | ベーカーカンパニー | SterilGard | |
| Axiovisionソフトウェア | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJソフトウェア | 国立衛生研究所 | Ver.1.51r |
参考文献
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