マウスで横方向の大動脈狭窄を誘導するために閉じて胸モデル

サマリー

ここでは、側方開胸による横方向の大動脈狭窄 (TAC) のプロトコルを提案します。この手法は、圧負荷および TAC 研究室の標準設定を利用したマウスの心臓障害をシミュレートすることを目指して低侵襲、閉胸手術です。

要約

心肥大・心不全研究頻繁、TAC による圧力オーバー ロード マウス モデルに基づいています。標準的な手順は、横方向の大動脈弓を視覚化する部分的な開胸手術を行うことです。ただし、開胸モデルにおける開胸手術による外科的外傷は、肋骨を切除し、左開胸後未接続呼吸生理を変更します。これを防ぐためには、側方開胸による低侵襲、閉胸アプローチを設立しました。ここに取り組んで大動脈弓 2^nd肋間間隙を介して胸部キャビティを入力せず少ない外傷から回復すると、マウスを残しています。等しい生存率で開胸タック プロシージャの標準的な実験室の設定を使用してこの操作を行います。閉胸アプローチのための生理学的な呼吸パターンを維持し、離れてマウスは外傷後の免疫反応を減らすために高速治癒過程を容易にする表示されます低侵襲技術として急速な回復を示すことによって恩恵を受けるようです。

概要

マウス モデルは人間の病気¹を模倣するために使われます。圧負荷を誘発する横方向の大動脈狭窄 (TAC) を使用し、左心室肥大²。ロックマンらによって検証されたマウスにおける開胸タック モデル³外科的処置は DeAlmeidaらによって、詳しく説明します。⁴します。 横方向の大動脈のバンディングは腹部大動脈狭窄と比較してより有利な循環のより大きい部分は、この後者の手順²の負の影響を補うことができますので。

昇順大動脈および腕頭動脈で、増加する動脈圧につながる大動脈横のバンディングが、(すなわち左総頸動脈、左鎖骨遠位血管を介して臓器の十分な血流を葉動脈および大動脈)。これは向上心後負荷と昇格した心臓壁のストレスに します。壁応力は、その後繊維肥厚⁵による減少します。慢性心臓血行動態変化は不適応と左の心室の膨張の結果します。こうすると、TAC は、最終的に心不全につながる心臓肥大の再現モデルを作成します。

DeAlmeideらによる記述で TAC の標準的な手順⁴肋骨または胸骨と縦隔と胸腔に入る郭清による部分上部開胸による大動脈弓に近づきます。大動脈弓とその側枝の良い表示が可能になります。残念なことに、切り裂かれた肋骨を再アタッチできません、それらの葉が浮遊していると、呼吸のダイナミクスを変更すること。

、我々 はしたがって、2^nd肋間間隙を介して横外科的アプローチを使用して大動脈弓へ低侵襲閉じた胸アプローチを確立しました。このモデルの最大の利点は、肋骨を介しても切断せずに TAC を実行する機能です。周手術期は皮膚の切開と肋間筋の解剖に限定されます。このプロシージャは自体外傷を最小限に抑える、十分な胸の安定性を維持するのに役立ちます。

ここで我々 はマウスの合計または上部開胸を行わず TAC 手術を実行する詳細な手順をについて説明します。高周波ドップラーは、TAC の成功は前述した^6,7を確保するためだった。

プロトコル

このプロトコルは、動物実験 LANUV レックリングハウゼン (#84-02.04.2016.A374) の倫理委員会によって承認されました。成体マウスでこの手順を実行する一般的には、> 10 週齢。しかし、若い動物と同様にこの手術を行うことが可能です。手術器具は、使用前に滅菌する必要があります、すべてのステップが無菌条件の下で実行されます。

1. 麻酔の挿管誘導

1. 痛みを軽減するため腹腔内ブプレノルフィン 0.1 μ g/g の体重を注入します。手術後の次の 3 日にブプレノルフィン 0.1 mg/kg 8 時間毎の投与を繰り返します。
2. 誘導、イソフルランの 3.0 の巻 %1 L/分の酸素流量の設定気化器に接続されている麻酔誘導ボックスにマウスを配置します。
3. 触覚刺激を誘導することによって深い麻酔を確認します。
   メモ: イソフルランの増加 Vol % まで 5%、麻酔導入に失敗した場合は麻酔は十分に深くないです。
4. 反射がないことを確保するのには、マウスの尾をピンチします。反射の完全な不在は、最適な人工呼吸器設定のマウスの重量を量る (1.12 を参照)。
5. プロシージャ全体で 37 ° C の体温を維持するために温度制御オペレーティング テーブルにマウスを移動します。
6. 麻酔の維持麻酔誘導ボックスに接続されているプラスチック製のコーンに、マウスの鼻を配置します。
7. ナイロン縫合糸で、マウスの上顎を固定します。粘着テープで手足を固定します。
8. 十分な麻酔を再び確保する鉗子の先端で後肢に圧力を適用します。逃避反射の不在で、次の手順に進みます。
   注: は麻酔導入が失敗するか、麻酔は十分に深くない場合イソフルランの容積 % を増加し、逃避反射の不在を待ちます。
9. 麻酔下での乾燥を防ぐために角膜に滅菌眼科用潤滑剤を配置します。
10. 直腸の外傷を避けるため直腸プローブを塗ります。37 ° C の体温を確保するための直腸温度プローブを挿入します。
11. 喉と胸の上部と製造元の指示に従って脱毛クリームを depilate します。1 分後、クリームを拭き取る。必要な場合は、成功するまでこの手順を繰り返します。
    注: は、出血した場合は綿棒を使用します。
12. 70% のエタノールの depilated 領域を清掃します。ポビドン ヨードは、皮膚消毒 3 回、少なくとも 3 分を適用します。
13. 生理学的パラメーターに人工呼吸器の設定を調整します。150/分と 8-10 μ L/g 体重 (BW) 換気量に呼吸速度を設定します。
14. 滅菌手袋の新しいペアに置きます。手術顕微鏡下にマウスを置き、マウスより滅菌穴開きドレープを配置します。
15. 正中 2^ndリブまで下顎で約 3 mm の皮膚を切開します。正中線や顎下腺の結合組織を識別します。関節包内鉗子を使用して優しく 2 つの鉗子で露骨に正中線で腺を分割し、気管筋を探索します。
16. パラ気管の筋肉を関節包内鉗子で露骨に離れて引っ張って気管をゆっくり準備します。
17. 簡単に挿管条件の喉をまっすぐにし、気管内挿管カニューレ (外径 1.2 mm) をそっと挿入鉗子で舌を引っ張ってください。気管内チューブの直接可視化し、適切な胸の動きをチェックして、挿管を確認します。
18. 1.0 L/分、100% O₂の流れと 2% イソフルランに対する挿管後イソフルレンの濃度を調整します。
    注: 呼吸運動が停止しない場合、マウス移動を開始最初 180/min まで呼吸数を増加します。必要に応じて、濃度を高めるイソフルラン 3.5% 第二マウスが独自に呼吸を停止するまで。最も一般的な問題として、漏出または気化器の不十分な詰物を評価します。
19. また、次の sub 手順で推奨されている気管挿管を行います。
    1. 60 ° の角度でテーブルの上のマウスの位置。
    2. 固執粘着テープでマウスの四肢と頭部のリクライニングします。
    3. 喉頭の上肌に直接冷光光源を配置します。
    4. 声帯を視覚化するための鉗子で、舌を優しく引き出します。
    5. 声帯を介して IV 型カニューレ (24 G) のプラスチック製のチューブを挿入し、人工呼吸器設定にプラスチック製のチューブを接続します。
    6. シンクロン胸の動きによって挿管を確認するためカニューレに人工呼吸器を接続します。
       注: 呼吸運動が停止しない場合、マウス移動を開始最初毎分 180 まで呼吸数を増加します。必要に応じて、濃度を高める二次イソフルラン 3.5% までマウスが独自に呼吸を停止するまで。最も可能性の高い問題として漏出または気化器の不十分な詰物を評価します。

2. 術前計測法

1. 鉗子で結合組織を軽く引き離すによって気管を置く補助の両方の頸動脈を準備します。
2. 左右 45 ° より小さい角度で左内頚動脈にいくつかの滅菌された超音波ゲル 20 MHz ドップラー プローブの先端を配置します。
3. 外側と内側に検索しドップラー信号を信号を最適化するためにプローブを傾斜移動するプローブをゆっくりと回転させます。
4. ドップラーのソフトウェアを使用して表示し、右と左総頚動脈コンピューター上で流速を格納します。

3. 開

1. 手術部位感染を防ぐためにそれぞれの個々 のマウスの滅菌手袋のセットを使用します。
2. ハサミで 2^nd肋下切開を展開します。
3. 肋骨を数えることで、2^ndの肋間スペースを視覚的に識別および関節包内鉗子でこのスペースをにべもなく浸透します。
   注: 1^st肋骨、鎖骨の下にある、したがって表示されません最初目に見えるリブ (すなわち2^ndリブ) と 3^rdリブ間 2^nd肋間スペースを見つけたので。
4. 鉗子のヒントの助けを借りて 2^nd肋間スペースを開き、リトラクターを挿入します。
5. 胸腺の明確な見解を持っているオペレーティング テーブルに接続されているゴムバンドで、リトラクターを調整します。
6. 出血の場合綿の先端を使用し、2 分の表在性の血管に押します。

4. 横方向の大動脈の縞模様

1. 正中線や結合組織を識別するために 200% に倍率を調整します。鉗子を使って優しく胸腺を分割します。大動脈弓は明らかに見ることができるまでは、脂肪組織を削除します。
2. 斜め下 (図 1参照) 腕頭動脈と左総頚動脈間横断の大動脈鉗子を結ぶトンネルを準備します。微細鉗子の助けを借りて 6.0 縫合糸の端を保持し、大動脈のアーチの下のスレッドを渡します。
3. アーチの反対側から 2 番目の鉗子でスレッドを取る。
4. 27 G の針を使用する長さは 3 mm 長い部分を切断、マウス マウス用スペーサーとして 19 25 g 体重 26 G 針と計量用 TAC 結紮用スペーサー > 25 g BW。
5. 横方向の大動脈に平行スペーサーを慎重に配置します。
6. スペーサーを緩い二重結び目を準備し、大動脈に平行にスペーサーの最適な配置を確保します。最初のスローを結び、すぐに 2 番目の逆スローを実行します。スペーサーを速やかに削除します。
7. コントロールで偽マウスを実行するには、大動脈結紮を省略する同じプロトコルに従います。
8. 6.0 ポリプロピレン縫合糸で 2^nd肋を閉じます。縛ること鎖骨下動静脈に特別な注意を払います。
9. 連続縫合パターンで 6.0 ポリプロピレン縫合糸を使用して皮膚を縫合します。

5. 横大動脈結紮の確認

1. セクション 2 のように 45 ° の角度で首の両側に 20 MHz ドップラー プローブを配置します。
2. それぞれの側に流速を文書化します。
   注:図 2に示すように、成功した TAC はドップラー流速によって検証できます。左右の内頚動脈は通常間 4 - 10 フロー速度比により十分な TAC (図 2参照)。

6. 心の収穫

1. 1.2 の手順に従って酔いを誘発します。1.3。
2. 安楽死室にマウスを置き、ボリューム/分の 10-30% を転置する炭酸ガスの流量を調整します。
3. 手術テーブル上でマウスを固定します。詳しく分析するためカニューレと下大静脈からハサミと収穫の血と腹部を開きます。
4. 強力なハサミで、横隔膜と胸骨の骨をカットし、中心部を削除します。
5. 心を計量する前に、すべての動脈と結合組織を削除します。
6. 右心室と左心室の中隔を分離し、両方のサンプルの重量を量る。
7. 両方の組織サンプルを液体窒素で凍結します。

結果

成功した TAC は、圧負荷、左室肥大の誘導を保証します。圧負荷のアドホック検証は、図 2に示すように、ドップラー流速測定を使用して実現できます。術前の血流速度は両方の頸動脈に等しいが、TAC は、拡張血速度左心室および大動脈圧の上昇により右頚動脈後狭窄弱毒血流速度を起こしながら、左頚動脈。

TAC とその結果肥大の効果は、心重量/体重比 (HW/BW; mg/g) c57bl/6 j 日 3、6、および 21 日後手術で男性マウスの計算によって検証されました。TAC マウス マウスの非バンドに比べて術後後 6 日目に有意に増加した HW/BW 比 (4.78 ± 0.18 vs7.66±1.43 mg/g, p < 0.0001)。21 日後、この比率はほぼ一定 (4.8 ± 0.11 vs7.81 ± 0.65 mg/g, p < 0.0001) (

ディスカッション

TAC による高血圧の急激な発症は、大動脈弁狭窄症や高血圧によって引き起こされる臨床的に関連の肥大によって異なります。それにもかかわらず、心不全を誘発する小さな動物モデルの使用は多くの利点し、は、したがって、多くの調査官¹¹によって選ばれています。この閉胸モデル マウス⁴で横方向の大動脈狭窄を誘導する手技の既存モデルが向上します。

最も重要なステップは、大動脈のアーチの下の通路です。きつすぎる縫合腹部大動脈周囲腎臓など重要な臓器への血流の低下が致命的な可能性があります。ハーゲン ・ ポアズイユの法則に従って流れは主に半径に依存です。したがって、いくつかの体重に適応したスペーサーは、我々 のプロトコルで使用されました。この手順は、個々 の実験のセットアップに応じて、非常に若いまたは古いマウスについて、特により普遍的に適用可能なこのモデルを作る。

外科的外傷自体免疫応答を誘導して防ぐために絶対的な最小値に還元すべき歪曲的な効果。高速リカ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
圧力量カテーテル	Millar Instruments, USA	SPR-839
Mouse ventilator	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Minivent - TYPE 845
Mouse vent	Harbord Apparatus GmbH, Germany	管カニューレ付きY接続 OD 1.2mm 73-2844
気化器	Dräger Medical AG&CO.KG、ドイツ	19.3イソフルラン気化器(新しいバージョンはカタログ番号 で入手できます。D-877-2010)
顕微鏡	ライカマイクロシステムズ、ドイツ	MZ 7.5
光源	Schott AG, Germany	KL 1500 LCD
6-0 Prolene	Ethicon, USA	手術用ポリプロピレン縫合糸 BV-1 9.3 mm 3/8c	手術用縫合
Seraflex	Serag Wiessner, ドイツ	USP 5/0 schwarz; IC108000	狭窄用縫合
ホモエオザーミック制御手術台	ハーバード・イスラーム社(ドイツ	) Typ 872/3 HT 三脚スタンドとホモエオザー・コントローラー タイプ874; 73-4233
フレキシブル・レクタル・プローブ	ハーバード・イスラー・エクス	外径1.6mm; 55-7021
ドップラー信号視覚化装置	インダス・インスツルメンツ社(米国	) ドップラー信号処理ワークステーション(DSWP)、20MHzパルスドップラーモジュール
アルーガ嚢内鉗子	アルトムド、英国	A5400
ドップラープローブ	インダスインスツルメンツ、米国	20MHz チューブマウントプローブ
ジャッフェリッドリトラクター	アルトメッド、英国	A3513

挿糸 糸クルーシブ社(ドイツ)