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方法論記事

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

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DOI:

10.3791/57410

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2018年3月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

DNA 損傷修復機構研究で定義されたサブ核領域の病変を誘導するシステムが必要です。405 nm レーザー装備レーザー走査共焦点の顕微鏡を使用してローカライズされた二本鎖切断を作成し、これらの病変の修復因子のダイナ ミックスを定量化するための自動化された手順を提供する手法を提案します。

要約

DNA 損傷応答 (DDR) は、検出、信号、および DNA 損傷を修復するタンパク質の茄多を使用します。この応答の輪郭を描くがゲノム維持機構の解明を理解する重要です。募集と病変における蛋白質の交換は非常にダイナミックなので、彼らの研究には迅速かつ空間的区切りに DNA 損傷を生成する機能が必要です。ここでは、我々 はローカル 405 nm レーザー ライン装備一般的なレーザ走査共焦点顕微鏡を用いたひと細胞における DNA 損傷を誘導するための手順を説明します。ゲノム維持要因レーザ ストライプは、蛍光抗体法 (IF) またはリアルタイムで評価できますの蓄積は、蛍光レポーターが付いたタンパク質を利用しました。リン酸化ヒストン H2A を使用しています。(Γ-H2A.X) x マーカーとしての複製蛋白質 A (RPA), メソッドは、隣接するクロマチンの普及からローカル募集の要因を識別するための十分な解像度を提供しています。さらにサイト被害を効率的にタンパク質染色体 DNA での動態を監視する ImageJ ベースのスクリプトを提供します。これらの改良は、DDR のダイナミクスの研究を簡単になります。

概要

細胞は、DNA 損傷のゲノムの完全性を脅す内因性と外因性の源に常に公開されます。DDR は、シグナル伝達経路を検出、信号、およびゲノムの安定性を維持するために DNA の損傷を修復のアンサンブルです。DNA 二本鎖切断 (Dsb)、DDR が 2 つの相補的なプラットフォームを中心に発生: γ H2A.X ラベル クロマチンと ssDNA 結合複合体 RPA1,2でコーティングされた通常切除一本鎖 DNA 領域。

UV レーザー マイクロ - チミジン アナログ 5-ブロモ-2' デオキシウリジン (BrdU) または bisbenzimide エトキシド trihydrochloride (BBET、ヘキスト 33342) DNA 染料前感作細胞照射単鎖切断 (を含む DNA 損傷の混合物を作成しますSSBs) と Dsb をクロマチンと一本鎖 Dna の両方のプラットフォーム3,4ローカライズされた DDR を引き出します。前の仕事を示した場合2、5と組み合わせて高エネルギー紫外線 A レーザー (335 365 nm) を使用して、DSB でこれらの 2 つの異なるプラットフォームにゲノム維持要因の採用を差別することができます。装備されてこのようなレーザー顕微鏡は、高エネルギー レーザー、405 nm レーザを用いたレーザ走査共焦点顕微鏡よりも学術と製薬の設定でずっとより少なく流行し専用の UV A 送信目的必要と高価ですライン。蛋白質の募集とマイクロ照射サイトで交換の研究はゲノム維持要因の動的挙動を記述するために必要な骨の折れる手動画像解析による排除も。

ここでは、BrdU または BBET の核酸染色と細胞の前感作性マイクロ照射による DNA 損傷でゲノム維持因子の動態のモニタリングを可能に一般的な共焦点顕微鏡の 405 nm レーザー後に続くことを示します。改良された解像度にフィールドとデコンボリューションの大きい深さ z 積み重ねとともにプラットフォーム マーカーとして γ H2A.X または RPA 複雑な亜単位を使用できますローカルに広がるそれらから Dsb に補充される要因を区別する実験者初期病変を囲む大規模なクロマチン ドメイン。核内の異なるコンパートメントによるとこのサブ分類マイクロ照射サイトに募集される未同定蛋白質の潜在的な役割を絞り込むことができます。また、便利なプロトコルを提供し、オープン ソース ・ ソフトウェア (ImageJ 分布) フィジー6,7、8を使用してゲノム維持要因のダイナミクスをすばやく解析するパイプラインを最適化します。現在マイクロ照射方法にこれらの改良は、事実上すべての研究室の設定可能な DDR の研究をレンダリングします。

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プロトコル

1. 細胞の前感作性

  1. マイクロ照射実験前に 24 h 種 FB 8 も培養の 405 nm レーザ光と優れたイメージングの最大透過率を確保するため 170 μ m 厚 coverslip のようなガラス/樹脂底付きスライド 1 x DMEM 含む 10% の井戸あたり U2OS セルが 40,000 セルレーザー走査共焦点顕微鏡を反転します。8 も microslide を使用している場合、すべての後の治療とプロトコルの洗浄手順ウェルあたり 500 μ L のメディアまたはソリューションを使用します。
    注: 自分のフラットの形態のための密着が良好と大きな核の U2OS 細胞の発見を容易タンパク質マイクロ照射のサイトで募集が、必要に応じて、その他の付着性のセル型を使用できます。細胞が 80% を理想的にする約必要がありますの数を増やすにマイクロ照射時の confluency 照射実験ごとのセル。非常に高い合流9細胞周期の S および G2 段階で行われる相同組換えなど、特定の修復経路を混乱させることができる細胞周期変化可能性があります。
  2. 5% CO2、37 ° C で一晩細胞をインキュベートし、(手順 1.3) でセルをあらかじめ感光性 BrdU (手順 1.4) または BBET (ヘキスト 33342)。
    注: (ポイ) DNA 病変へのタンパク質のライブ募集を観察するには、transfect または細胞播種後蛍光タンパク質とポイ 24 h の融合を運ぶプラスミッド DNA を変換します。24 h 後-transfection/伝達、事前に敏感し、リアルタイムで DNA 損傷部位でポイの募集を監視する細胞をマイクロ照射します。
  3. 405 nm レーザーに博覧会によって生成される Dsb の数を増やす、BrdU の 10 μ M をマイクロ照射前に 24 h のメディアに追加します。マイクロ-照射、マイクロ ピペットを使用して前に 405 nm レーザーにセルの最大の露出を確保するためフェノールレッドなし中で 2 回細胞をすすいでください。
  4. また、10 μ g/ml 37 ° C で細胞培養のインキュベーターで適切な培地で BBET と 15 分のためのセルを扱う治療後、フェノールレッド マイクロ照射前にせず中で 2 回すすいでください。

2. 細胞マイクロ照射

  1. 適切なレーザー スキャンの顕微鏡を選択します。
    注: ここに示した実験は 50 mW 405 nm レーザー線、63 X 1.4 開口石油目的を備えた顕微鏡システムで行った。Dsb を生成する細胞がマイクロ照射 1 × 1,024 x 1,024 ピクセル/フィールド (63 倍の倍率で 0.21 μ m/ピクセル) でスキャン ズームと単方向モードでは 8 μ s/ピクセルで。使用されるレーザーの電力は 25%、BBET と BrdU-前-増感細胞の 80% であった。ユーザーが彼らのシステムを構成するには、提案システムのレーザー パワー後目的は、製造元の指示に従って電源メーターを用いて測定しました。測定値が 2.6 に対応して mW と 7.0 mW の BBET と BrdU-前-増感細胞、それぞれ。
  2. 顕微鏡と環境制御チャンバーを入れます。
    1. サンプルはステージ上での定温器細胞に不必要なストレスを避けるために、実験全体で均質な DDR の速度を確保するために置かれる前に、商工会議所を 5% CO2と 37 ° C に設定します。
  3. よく分散セルとフィールドを選択、フォーカスを調整し、場合プロトコル後イメージの獲得を促進する彼らの位置を登録します。タンパク質募集マイクロ照射後の反応を監視するため前損傷参照ポイントとして機能する少なくとも 1 つのイメージを取得します。
    注: グリッド培養容器は、後続の手順でマイクロ照射細胞のローカリゼーションを促進するまた使用可能性があります。
    1. BBET 標識細胞を用いた場合の実験、不当な DNA 損傷を避けるため、細胞を可視化するための十分な最低レーザーの消費電力 405 nm レーザーを用いた細胞焦点を調整します。
      1. ランプから放射される紫外線は照らされたサイトで DNA 損傷を誘発する、BBET 染色性細胞にフォーカスを調整する広視野蛍光を使用しないでください。
    2. BrdU 標識細胞を使用している場合は、サブ核小体などを見ることによって差動干渉の対照 (DIC) または位相コントラスト イメージングを使用してフォーカスを調整します。
    3. 蛍光標識したランドマークを発現する細胞を使用している場合は、代表的な蛍光強度とフォーカル プレーンを選択します。
      注: は、人工ローカライズ可能性があります強力な過剰発現、POI の非常に高いレベルを発現する細胞を避けてください。さらに、匹敵するレベル (安定したクローンの選択ポイ式および採用レベルの変動を最小限に抑える推奨) でポイを表現するセルを選択します。
  4. システムの退色 (FRAP) _module 後蛍光回復を使用してマイクロ照射ステップの顕微鏡を構成します。
    注: セットアップ顕微鏡システムのマイクロ照射実験を検討する最も重要なパラメーター: 405 nm のレーザーは、回数 (すなわちレーザーは同じ座標に行く回の数) の出力電力ピクセル/フィールドの数 (倍率と 1 ピクセル解像度 1,024 × 1,024 X 63 = 0.21 μ m)、およびピクセルあたりの滞在時間。これらすべての要因は細胞が発生するエネルギーの量に影響を与える、従って量と DNA の種類損傷生成された (見なさい議論線量最適化の詳細)。
  5. 細胞をマイクロ-照射顕微鏡システムの FRAP モジュールを使用する。
    注: ほとんどのシステムで複数のセルのマイクロ照射実行できます単一のフィールドに斑点や線/長方形 (通常 1-2 μ m 幅) として。蛍光標識したタンパク質のライブ イメージングを実行するときは、すぐに損傷後、各セルのマイクロ照射にかかる時間を DDR の遅延誘導になりますのでマイクロ照射フィールドごとにセルの数が少ないを制限します。これは、DNA 損傷に非常に急速に補充される蛋白質を監視するときに特に重要です。
  6. マイクロ照射、ウェル スライドやプレートに戻す 5% CO2と 37 ° c の定温器の場合のサンプルを処理する前に必要な期間 (セクション 5) 後すぐにライブ イメージングを続行または (セクション 3)。
    1. 最初のステップとして、数分以内、場合プロトコルのいくつかの時間後照射までセルを修正します。ポイは、に応じて募集速度が異なる場合があります。通常、Dsb と SSBs でクロマチン関連蛋白質は病変に非常に急速にローカライズされます、5 分以内は時々 削除します。SsDNA で組み立てるものなどいくつかの要因は切除機械エンゲージに後時点で募集して時間 (参照してください図 1および参照4) そこに残る。

3. ライブ イメージング蛍光標識したタンパク質

  1. マイクロ照射細胞タイムラプス イメージングを実行します。病変に非常に急速に補充される、フレームあたり数秒が理想的ですが、獲得後 (例えば、切除要因)、破損している領域にローカライズする蛋白質のため可能性があります蛋白質は、高原が達成されるまで 1-2 分ごとを実行。
    注: 漂白可能な限り避けるために、タンパク質損傷のサイトで募集が信号の定量化を妨げることは彩度を到達しないようにイメージ獲得のためのレーザー出力を最小化し、その後分析 (データの分析を参照してください。セクション 4)。63 X 提示システムで行われていたイメージング/1.4 油客観的 8 μ s/ピクセル滞留時間、解像度 1,024 × 1,024、1 X ズームを使用して、2 の平均します。これらのパラメーターが他のシステムや異なる実験用に最適化する必要があることに注意してください。
  2. マイクロ照射 15 30 セルのカイネティクス測定まで追加のフィールド内のセルを取得します。精度と募集動態の再現性を確保するため生物的複製の少なくとも 3 回実験を繰り返します。
    注: 特定の共焦点システムにこのプロトコルを適用するときことができます知られている蛍光標識したゲノム維持因子の募集速度を監視することによって開始する (例えば、53BP1 GFP RPA32 GFP 等)。マイクロ照射条件を最適化するライブ イメージングを使用すると、急速に複数のパラメーターをテストするユーザーができます。

4. 募集動態解析

  1. フィジー画像解析ソフトウェア11Microirradiation 解析プラグイン10をインストールします。
  2. フィジーで取得した画像を開きます。Microirradiation 解析スイートのプルダウンのプラグイン メニューから「損傷アナライザー」を選択します。各マイクロ照射セルの利子 (ROI) (通常 3 x 3 μ m)、および非照射と照射・ ロワの背景領域を定義する画面の指示に従ってください。
    1. 潜在的なバイアスを最小限に抑えるために同じサイズの使用・ ロワは、信号強度を意味します。取得した画像は、ベースラインとしてマイクロ照射のサイトで募集を監視するために使用が、少なくとも 1 つの予備照射フレームを含めるも。
    2. 投資収益率のすべてのデータが完全にコマ撮りシリーズ以上収集されると、csv (コンマ区切りファイル) または txt (タブ区切りファイル) として結果を含むプラグインによって作成されるファイルを保存します。このファイルには、各時点の各 ROI (意味強度の背景、意味強度非照射および強度の照射の意味) 平均強度の測定が含まれています。
      注: プラグインは自動的にバック グラウンド強度を減算 (私b) 照射された陰影の強度から (私s) と非照射・ ロワ (私n)。また、退色 (照射/非照射) を補正するため両方の値 (下記参照) の比率を計算します。
      figure-protocol-1
      プラグインはまた最初の時点 (値 1 に設定) とすべての正規化を計算各核 (最初の時点を基準にして比) 他の時間ポイント。プラグインのウェブサイト10で追加情報を見つけることができます。
  3. すべてマイクロ照射細胞 (少なくとも 15-30 セル) のプラグインを使用して分析を実行し、時間をかけてマイクロ照射領域の相対的な強化の平均をグラフ化します。各データの平均値の標準誤差をポイントし、プロットを計算します。
    1. 学生のtを実行することによって 2 つの実験条件の募集動態の違いを確認-各データ ポイントのテスト。

5. 場合プロトコル

  1. 場合ソリューションを準備します。ソリューション extraction 事前準備 (0.25% を含む冷たい 1 × PBS トリトン X-100)、ソリューションの洗浄 (0.05% を含む 1x PBS トゥイーン 20)、ソリューションをブロック (3 %bsa および 0.05% を含む 1x PBS トゥイーン 20) と (3% + ショ糖 2% パラホルムアルデヒドの固定の解決PBS 1 で x) ポリプロピレンの円錐管に。
    メモ: 単一 8 ウェル microslide 前/後 extraction 溶液 50 mL 洗濯ソリューション、ブロッキング溶液 10 mL、5 mL の固定の解決の 10 mL が必要です。
    1. 固定の解決を準備します。
      1. 化学のフードの下でパラホルムアルデヒドの 15 g と 30 μ L を 1 L の三角フラスコに 10 N NaOH の二重蒸留水 (ddH2O) の 400 mL を混ぜます。
      2. 完全に、パラホルムアルデヒドの可溶化攪拌しながらコンテナーと磁性攪拌器ホット プレート上 65 ° C で熱を閉じます。
      3. 25 mL のピペットを使用して、PBS、攪拌、および 0.45 μ m のフィルターを使用してフィルター X 10 の 50 mL を追加します。
      4. ショ糖の 10 g を追加し、ddH2o. と 500 mL に完了
      5. 15 mL コニカル管; のソリューションの約数使用するまで-20 ° C で保存します。
    2. 染色液 1 mg/mL の 1x PBS で 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 縮尺の原液を希釈して核を準備します。
  2. マイクロ ピペットを使用して、マルチも顕微鏡のスライドやプレートの井戸からメディアを慎重に取り外し、すぐに 2 回待つことがなくソリューションを変更する場合は洗浄液の 500 μ L で洗ってください。
    注: ここで示した場合データは洗浄され、すべてのソリューションを 500 μ l 添加培養 8 ウェルの顕微鏡スライドで育った細胞を使用して得られました。ボリュームは、実験者によって使用される細胞培養容器によって調整する必要があります。さらに、細胞がガラス/樹脂底からデタッチできます簡単に、細心の注意でもしプロトコルを実行します。セル損失を最小限に抑えるためにすべてのソリューションの変更のピペットを使用します。
  3. 氷上インキュベート ソリューション extraction 前と 15-30 s 前の抽出を実行するための手によって優しく旋回ステップする場合冷たい 500 μ L で 5 分最も細胞質および核質の蛋白質を削除し、クロマチンから信号を最大化/DNA 関連の要因。
  4. 500 μ L の場合は洗浄液で 2 回洗浄します。
  5. 場合の固定の解決の 500 μ L に室温で 15 分間インキュベートします。また、固定ステップの既製パラホルムアルデヒド溶液 (3-4%) を使用します。
  6. 500 μ L の場合は洗浄液で 2 回洗浄します。
  7. 冷たい場合はプリ/ポスト extraction ソリューションの 500 μ L で 5 分間氷の上を孵化し、透過ステップを実行する手で優しくスライドを渦します。
  8. 500 μ L の場合は洗浄液で 2 回洗浄します。
  9. ブロッキング液の場合の少なくとも 30 分間 500 μ L で室温で孵化させなさい。
  10. マイクロ ピペットを使用してブロッキング液を削除し、ソリューションをブロックで希釈した 250 μ L 一次抗体と 4 ° C で加湿チャンバーで一晩インキュベートします。
    注: の共局在の潜在的な人工物を避けるために順番に一次抗体の孵化を実行ことをお勧めです。適切なコントロールを実行すると、同時に、プロセスをスピードアップする一次抗体をインキュベートします。
  11. 4 回穏やかな攪拌 (上 60 rpm) の場合は洗浄液の 500 μ L で 5 分間洗ってください。
  12. 加湿チャンバーでブロッキング液で希釈した二次抗体の 250 μ L で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
    注: は、蛍光標識した二次抗体の添加によって光からサンプルを保護します。
  13. 穏やかな攪拌の場合洗浄液 500 μ L にそれぞれ 5 分間で 4 回を洗浄します。
  14. 1x PBS 1 μ G/ml の核を染色 DAPI を含む 500 μ L で 5 分間室温でインキュベートします。
  15. 500 μ L の 1x PBS で 2 回洗浄し、細胞イメージングのための PBS ソリューション x 1 の 500 μ L のまま。
  16. グリッドのスライドまたは登録ステージ位置を使用して、検索よ特徴付けられた DNA 損傷マーカーを用いたマイクロ照射細胞 (例えばγ-H2A.X、RPA32、等)。
  17. ウェル文化スライドまたはレーザー走査型共焦点顕微鏡の適切な設定を使用してすべての関連するチャンネルのプレートをイメージします。
    注: 示されたシステムのイメージングは 63 X で行われました/1.4 油客観的 8 μ s/ピクセル滞留時間、解像度 1,024 × 1,024、1 X ズームを使用して、2 の平均します。これらのパラメーターが他のシステムや異なる実験用に最適化する必要があることに注意してください。

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結果

次のマイクロ照射細胞はゲノム維持蛋白質1,12の性質によっては時間の特定の期間の回復が許可されます。Dsb は RPA と他のゲノム維持要因9によってコーティングされて急速に ssDNA の限られた領域を作成する、細胞周期の S および G2 段階の最も広く、核酸分解酵素によって処理されます。この ssDNA 領域は募集と他の DDR 要因13の交換を規制する DDR の中に広く変更されるクロマチンに囲まれています。場合によってマイクロ照射領域にタンパク質募集を監視できます (図 1 a)。通常、クロマチン関連要因 (例えばγ-H2A.X、53BP1など) は以前 (1-5 分) で検出時間 ssDNA 結合蛋白質よりポイント DSB 端のヌクレアーゼを介した切除 R...

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ディスカッション

上記の方法を使用すると、照射済み BBET または BrdU で感作細胞 - 405 nm レーザー マイクロは付着性細胞の核内で DNA 性病 Dsb のローカライズされた世代をことができます。これらの Dsb で DDR の速度は、真核細胞9,18,19の他のメソッドで生成されたものに似ています。マイクロ照射サイトで DSB 切除は ssDNA 世代 RPA32 を対象とした抗体または RPA32 GFP 融合を使用して続くことができるに します。その一方で、クロマチン関連要因は、参照として γ H2A.X を使用に配置できます。クロマチン関連要因は γ H2A.X と同じくらい初期の DSB から広がる可能性がありますいない、一本鎖 Dna 結合蛋白質の巣とは異なることができる点状の巣として表示されます。

Dsb が生成され、タンパク質募集と被害サイトからのクリアランスは、固定セルに IF ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、自然科学および工学研究審議会のカナダ [朝発見グラント 5026]、次世代がん研究会 [朝 21531] から科学者奨学金のサポートされていました。ジャン ・ フランソワ ・ Lucier にありがとう統計分析にフィジー Python スクリプトやアドバイスの優秀な品質管理を提供します。もし固定ソリューション レシピありがとう博士ステファニー A. Yazinski。レーザー パワー測定のヘルプありがとうポール リュドヴィク化のパターン。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オリンパスFLUOVIEW FV3000共鳴レーザー走査型共焦点顕微鏡オリンパス
FluoView FV3000ソフトウェア(バージョン2.1)オリンパス
405 nmレーザーコヒーレント放射線源
顕微鏡インキュベーターAIO-UNO-OLYUS-1OkolabOKO-UNO-1
60X /1.4対物レンズオリンパスオイルカバーガラス上の液浸対物レンズ
8ウェル培養スライド(X-well)Sarstedt94.6190.802
U2OS osteosarcoma human cell lineATCCHTB-96Stable cell lines 
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)サーモフィッシャーD1306注意 有毒
5-ブロモ-2′-デオキシウリジン (BrdU) Sigma-Aldrich59-14-3
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich30525-89-4注意 有毒
なビスベンズイミド H 33342 (Hoechst 33342)ThermoFisher62249
ウシ血清アルブミン (BSA)ThermoFisherBP1600-100
トリプシン EDTA 0.1% サーモフィッシャー15400-054
トリトン X-100 バイオショップTRX777.100
トゥイーン-20 サーモフィッシャーBP337-500
ショ糖 BioShopSUC507
JetPRIMEトランスフェクション試薬 Polyplus114-07
ProLong Diamond 色あせ防止剤 (DAPI 付き)  サーモフィッシャーP36962
DMEM 1X、+フェノールレッドWisent 319-005-CL
DMEM 1X、 - フェノールレッドWisent319-051-CL
ウシ胎児血清 (FBS)Wisent 080-150
マウス抗RPA32抗体Abcamab21751:500 IF
ウサギ抗ガンマ-H2A.X抗体細胞シグナル伝達 9718S1:500 IF
Rabbit Anti-53BP1 antibodyCell Signaling 4937S1:500 IF
ウサギ抗 PRP19 抗体Abcamab276921:500 IF
ヤギ 抗ウサギ IgG Alexa Fluor 647細胞シグナル伝達 4414S1:250 IF
ヤギ アンチマウス IgG アレクサフルオア 488 細胞シグナル伝達 4408S1:250 IF
フィジー画像解析オープンソースソフトウェア 
https://fiji.sc 1918-K パワーメーター  918D-SL-0D3センサー付きニューポート
な

参考文献

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