このプロトコルでは、生理学的およびその他の生物学的研究に役立つ濃縮細胞を準備する方法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
細胞の研究は、植物の全体的な機能にこのセルの型の特定の貢献の知識に不可欠です。多くの場合分離することは困難だし、挑戦を提供する従ってそれらをもっと勉強します。
本研究では、細胞濃縮法を確立します。プロトコルは、スコッチ ガードのセルを隔離し、セルからの蛋白質の抽出を採用しています。このメソッドは、分離中に整合性と細胞の収量を向上し、細胞シグナリング プロセスと気孔の表現型の関連性の研究に信頼性の高いサンプルを提供します。この方法では植物の葉はテープの 2 つの部分間で分割され背軸側を削除するには、離れて皮をむいた。このプロトコルは、シロイヌナズナ葉の組織細胞を分離するために適用されました。セルは、フルオレセイン ・ ジアセテートの生存率を決定する (FDA) とアブシジン酸 (ABA) ABA に気孔運動を評価するために扱われました。結論としては、このプロトコルは蛋白質の分離と濃縮細胞を準備するため有用証明します。有効にする生理学的およびその他の生物学的研究とタンパク質・細胞の品質はここで得られました。
概要
気孔は、全体の生理学と植物のフィットネスに重要な役割を果たします。これらの小さな植物の特定の構造、細胞として知られている 2 つの特殊な表皮細胞によって形成され、葉の切断面に最も豊富にあります。気孔は、蒸散による水損失の制御と同様、植物と大気間のガス交換の必要があります。細胞調節する異なる外部 (例えば光、湿度、病原体の接触、二酸化炭素のレベル) の統合により気孔開口部および内部 (e.g。、内因性ホルモン) 刺激1,2。過去 20 年間で、この型のセルを勉強セルシグナ リング プロセス植物のためのモデル システムとなりました。これらの細胞は葉; 総細胞のごく一部を構成します。したがって、彼らのユニークな携帯を調べるためには、生化学的および分子プロパティ単一セルにそれ、他の葉の細胞型からそれらを分離する必要。過去には、そのガード細胞研究はしばしば細胞プロトプ ラスト (GCP)3,4、5の準備を関与しています。これは通常大量のブレンドによる機械的破壊や、細胞壁分解酵素の使用を必要とし、少し収量を倍のコストと時間のかかる一般的に GCP サンプルを頻繁に準備に多くの時間がかかるように証明されていま....
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プロトコル
1. 成長する植物
- Potting の混合物の種を発芽させます。植物を育てる成長室 140 µmol 光子 m− 2の− 1の光強度と光速で 8 h 22 ° C で 16 時間日長で暗い、18 ° C で 2 週間。
- 4"直径の鍋土を含むに個別に類似サイズの苗を移植し、手順 1.1 で説明した追加同じ条件で 3 週間の成長します。
注: は、湿った土壌を維持する週 2 回水道水で植物を水します。
2. 豊かな気孔の準備
- 5 週間の古いシロイヌナズナ植物メスと個々 の葉を削除します。
- 裏面 (下側) に付着したワンピースと葉の向軸 (上) 側に付着した他の作品と明確スコッチ テープの 2 つの部分に各葉を取り付けます。5 葉のテープを残す s。
- 優しい皮をむく離れて舗装と細胞と葉肉細胞の向軸側背軸側を別々 にそれぞれの手の人差し指と親指を使用してテープの 2 つの部分。
- 気孔を開くの 60 mL に葉の背軸側から皮バッファー (50 mM KCl、10 mM MES 島、pH 6.2 1 M コに調整) 40 × 12 mm サイズ ペトリネットの場所は、収集された料理します。
- すべてのサンプルの皮が収集されるまでは、上記の手順を繰り返します。
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結果
シロイヌナズナの代表的なイメージは前に、と後、葉肉細胞や表皮細胞の消化は、図 1に示すセルをガードします。ガード セル実行可能性前に、と葉肉細胞と表皮細胞の除去後は、酵素活性と細胞膜の完全性 (図 1 bと1 D) を測定する FDA を使用して観察できます。図 2は、ABA の処置への応答でシロイヌナズナの気孔を示しています。気孔は、ABA 処理での 30 分後に 50% 以上が減少します。図 2 aは、気孔運動の時間のコースです。さまざまな時点での写真は光学顕微鏡で撮影されました。ImageJ で気孔を測定し、60 ~ 80 口径測定値 ± 標準誤差平均値が示されました。各時点で気孔開口部の代表的な画像を図 2 bに示します。蛋白質の検出、.......
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ディスカッション
ガード細胞は植物におけるシグナル伝達機構を研究するためのモデル システムを研究で使用される試料の調製が生物的質問に答えるに最も適切なことを確認することが重要です。植物研究コミュニティの中で細胞の増加の関心にもかかわらずは普遍的な方法が気孔運動と生理の両方できるようになる細胞を準備する方法の 1 つで検討する分子レベルの変化だけでなく、システム。それらを分離する挑戦は、その小型サイズ、低豊かさとそれをもっとまたはより少なく全体の葉からそれらを削除することは困難ことができるユニークな構造に大部分の帰することが。
このプロトコルでは、分離開発テープ皮メソッドを使用して、これらの障害を克服する方法のメソッドを提供します。このプロトコルでメソッドは、生理学的刺激に対する応答性を維持そのまま気孔ガード細胞を分離する方法を提供します。タンデム質量タグ (TMT) と定圧のまたはタグを利用した定量的プロテオミクス解析などの詳細なプロテオーム研究の出発材料として役立つことができる細胞蛋白質の抽出が可能なこれらのサンプルの準備相対パスと絶対定量 (iTRAQ)11<.......
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開示事項
利害の対立が宣言されていません。
謝辞
ダニエル陳からデジタル ビデオ生産チームのブッフホルツ高校編集ビデオで支援に感謝いたします。この気孔細胞・ プロテオミクス ・ メタボロミクス陳の実験室での研究は、米国国立科学財団 (0818051、1158000、1412547) からの補助金によってサポートされています。Wenwen 香港は中国公費によってサポートされます。博士 Qiuying パンをサポートするには、中国の奨学金委員会と国家自然科学基金、中国の (31570396)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ステンレス鋼外科用メス | の羽 | ||
| スコッチテープ (3M) | ULINE | S-9781 | |
| シャーレ | Σ-アルドリッチ | BR455701 | |
| セルラーゼ (小野塚R-10) | ヤクルト製薬工業(株) | 21560003-3 | |
| マセロザイム R-10 | ヤクルト製薬工業株式会社 | 21560003-4 | |
| DM6000B顕微鏡 | ライカマイクロシステムズ | ||
| プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| 微量遠心チューブ (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJソフトウェア | 国立衛生研究所 | ||
| ピンセット | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| 顕微鏡スライド | Fisherbrand | 12-550-A3 |
参考文献
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M.
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再版と許可
