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方法論記事

再生の研究のための主な胃上皮単層培養のマウスおよびひと由来

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DOI:

10.3791/57435

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2018年5月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati, 2Department of Cell & Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Molecular Genetics, Biochemistry & Microbiology, University of Cincinnati

この記事について

サマリー

ここを確立する、2 次元の単分子膜に 3 D オルガノイドを転送する人間およびマウス由来 3 次元 (3 D) 胃 organoids、およびメソッドを培養するためのプロトコルについて述べる。再生研究の新規スクラッチ傷アッセイとして胃上皮単層の使用を述べる。

要約

胃の傷の修復のin vitro研究は通常細胞拡散および移行のスクラッチ傷アッセイの胃癌細胞株の使用を含みます。このような試金の 1 つの重要な制限は、携帯電話型の同種の品揃えです。修復は、いくつかの細胞のタイプの相互作用を要求する複雑なプロセスです。したがって、細胞のサブタイプに欠けている文化を研究する場合は修復プロセスを理解し、克服する必要があります懸念です。胃におけるモデルという携帯型の異種のコレクションは密接に胃の上皮やその他のネイティブの組織の生体を反映この問題を軽減するかもしれない。ここでは、小説で人間から派生したスクラッチ傷生体外の試金を示したマウスの 3 次元 organoids どちらかそのまま organoids やの単一細胞懸濁液として、胃上皮単層に移すことが分離したかorganoids。プロトコルの目的は、胃の再生を研究する新しいスクラッチ傷アッセイ システムで使える organoid 派生胃上皮膜を確立することです。

概要

スクラッチ傷の試金の使用は、修復と再生1,2,3,4,5,6を研究するための一般的な方法です。提案された方法論は、特に胃の再生とピロリ菌の植民地化を研究するために使えます。過去には、胃癌細胞株は、ヘリコバクター ・ ピロリ(ピロリ菌) 感染症1,2を研究する手段として使用されている、最近胃癌まで AGS 細胞などの細胞が支持された1 ,2,3,4。胃癌細胞培養の制限の 1 つは胃上皮細胞の多様性を要約する彼らの失敗です。この制限に対処しようとするには、ここでは確立とひと-マウス由来の主な 3 次元腺胃 organoids (FGOs) の転送に実証最初修正法に基づく創傷治癒の試金のための胃上皮単層Schlaermannらによって記述されました。7を示すことから派生した胃の上皮膜せん断 3 D 胃 FGOs または FGO 単一細胞胃上皮密接に表す偏極細胞構成を保持体内。胃癌細胞株は、このテクニックが表示されますセル構成を示すか、ことを考える現在のプロトコルは代替のスクラッチ傷の測定法にはない利点です。この方法論は、単分子膜はできる全体 organoids や解離 organoids から単一細胞懸濁液から確立されたと基底膜マトリックスを使用してメッキまたはコラーゲン ・ コーティングという最適化されています。このプロトコルの全体的な目標は、organoid 派生小説創傷治癒の試金のための胃上皮単層培養を確立することです。

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プロトコル

汚染を避けるためには、滅菌のティッシュ文化フードの内で完全にプロトコルを実行します。承認されたシンシナティ大学 IRB プロトコルに従ってスリーブ胃切除術を受けている患者から収集されたヒトの腺組織 (IRB プロトコル番号: 2015-4869)。
すべてのマウスの研究は、シンシナティ大学の制度的動物のケアおよび使用委員会 (IACUC) アメリカ協会の評価・認定の研究所動物ケア (AAALAC) 施設を維持するによって承認されました。

1. ひと由来 3 D 胃噴門オルガノイドの確立

注: このプロトコルは、以前このラボ8に発表された研究に基づいています。

  1. 50 %wnt エアコン、20% R spondin エアコン メディアから成っている 3 D におけるメディアを準備します。
    1. エアコン Wnt メディアの準備、Wnt 培地に L 細胞の培養 (ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM), 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン) 7 日、中を収穫し、0.22 μ m フィルターを使用してフィルター処理します。
    2. R spondin 付きメディアを準備します。R spondin 培地に変更された HEK 293 t R spondin 分泌細胞ラインを育てる (ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM), 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン)。2 時間後の添付ファイルに媒体を変更これらの細胞から OPTIMEM 成長中、1% ペニシリン/ストレプトマイシン。7 日間培養します。R spondin 付きメディアを収穫、0.22 μ m フィルターを使用してフィルター処理します。
      注: このプロトコルは以前公開されておりより詳細なプロトコル6,7、8を参照してください。
  2. 4 ° C で氷の上の 16 h の成長因子減少、フェノールレッド フリーの基底膜マトリックスを解凍します。氷冷 Ca2 +/Mg2 +組織を収集-大規模なプラスチック容器に DBP を無料します。開始ステップ 1.4 まで氷の上保存します。
    注: 組織は、スリーブ胃切除術を受けている患者から収集されます。
  3. 100 mL は Ca2 +/Mg2 +を含む滅菌ビーカーに積極的に組織を洗う鉗子を使用すると、-無料ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)。洗って約 30 s の破片と血が削除されるまで、または。次に、この滅菌ガーゼを使用することは、上皮から粘膜層ぬぐいます。
  4. 大きな鉗子を使用して、しっかりと筋層組織と力を把握、大きく湾曲した止血鉗子を使用して上皮を削り。滅菌、ポリスチレン シャーレにスクレイプの上皮の断片を収集します。
  5. カミソリを使用して組織の消化を最適化する約 2.0 × 2.0 mm サイズ2フラグメントに上皮性のティッシュをミンチします。Ca2 +/Mg2 +組織片を洗う-抗生物質を添加した DBP を無料 (Ca2 +/Mg2 + -無料の DPBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、0.25 mg/mL アムホテリシン B 10 mg/mL ゲンタマイシン、カナマイシンの 50 mg/mL)、まで洗浄は血の無料です。必要な場合は、複数の洗浄を実行します。慎重に廃棄物ビーカーに滅菌ガーゼを洗浄をフィルタ リングによって洗浄を破棄します。
  6. 丸底フラスコ 25 mm 攪拌棒と予め温めておいたインキュベーション メディア 125 mL グラスに断片を収集洗浄 (2 mM 1 %l-グルタミンを添加した基底メディア ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM HEPES 緩衝液、1 mg/mL コラゲナーゼ タイプ 1、2 mg/mL の細胞培養ウシ血清アルブミンの等級)。ゴム隔壁を有する丸底フラスコを密封してください。
  7. セプテムに 20 G 脊髄針を挿入し、ゴムをつけ込まれることで酸素タンクに接続します。を任意の汚染物質をフィルターするには、フィルターを作成するチューブにティッシュ ペーパーを挿入します。低酸素の流出を入れます。隔壁の破裂を避けるために隔壁に 10-15 流出針を挿入します。
  8. クランプを使用してリング スタンドにセットをセキュリティで保護し、37 ° c 30-45 分間撹拌プレート校正水浴。組織は、15 分間培養されている後、は、50 μ L の培養メディアと解離腺を視覚的に確認するを削除します。腺は密ではないまたは組織から分離されていませんが、さらに 5-10 分のままにします。
  9. 50 mL を追加し、孵化の直後無菌血清ピペットを使用して培養メディア、または培養混合物に直接注ぐことによって DMEM/f12 キーを予熱します。
  10. 4 つの 50 mL の円錐管に滅菌ガーゼで腺の混合物をフィルターします。円錐形の管の底に沈殿するために抽出された腺を許可するように 15 分間氷の上濾液を保ちます。定住の腺を乱す取り外して上 40 mL の血清ピペットを使用して上清を廃棄しないように注意します。残り 10 mL を 10 mL の DPBS 抗生物質を添加したに再懸濁します。
  11. 5 mL の細胞培養試験管に均等に混合物を配布します。4 ° c の 65 の x g で 5 分間遠心し、慎重にピペットを使用して上清を除去します。ピペットまたは 200 μ L ワイドのピペット チップを使用して解凍の基底膜マトリックスで腺ペレットを再懸濁します。まで均一に混ぜます。
    注: それは氷の上でこの手順を実行して混合しながら基底膜マトリックスの重合を避けるために重要です。また、50 μ L のサンプリングによる腺の密度を目視で確認することが重要です。最適な密度である ~ 70% の confluency。
  12. 次に、プレート全体の先端のピペットを使用して基底膜マトリックスの 50 μ L の腺。めっき中任意の気泡を生み出すを避けます。
  13. 重合、37 ° C で 10-15 分間インキュベートする基底膜マトリックスを許可するには12 ウェル培養プレートのメッキ、hFGO メディアの 1 つの mL を追加 (高度なダルベッコ改変イーグル培地/F12 培地を添加した 2 mM L-グルタミン, 1% ペニシリン/ストレプトマイシン, 0.25 mg/mL アムホテリシン B 10 mg/mL 10 mM HEPES 50 ミリグラム/ml カナマイシン、ゲンタマイシンバッファー、1 mM n-Acteylcystine、1 x N2、B27、wnt シグナル調節された媒体の 50%、20% R spondin エアコン ミディアム 100 ng/mL を添加した × 1 骨形成タンパク質阻害剤、1 nM ガストリン、50 ng/mL 上皮成長因子、200 ng/mL の線維芽細胞成長因子 10、10ニコチン酸アミド、mM と 10 μ M Y-27632 ROCK 阻害剤) ウェルあたり。ない場合は基底膜マトリックス バブルが水没するのに十分なメディアを追加 12 ウェル培養プレートを使用します。
  14. 5% CO2加湿細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で培養します。メディアのすべての 4-5 日を変更します。

2. マウス由来 3 D 胃噴門オルガノイドの確立

注: このプロトコルは、以前に発行された6をされています。氷の上の基底膜マトリックスを解凍し、開始する前にすべての試薬を準備します。

  1. 研究が実行されている研究機関によって承認されたメソッドを使用してマウスを犠牲に。マウスから胃を削除し、以前に公開されたプロトコル6によると分析します。20 mL の氷冷 Ca2 +/Mg で2 +洗浄-無料の DBP。
    注: 8-10 週齢の c57bl/6 マウスは、腺胃における文化に使用されます。マウスは、胃の除去前に手動の頚部転位続いて二酸化炭素の吸入による安楽死されました。
  2. 胃から筋層を除去し、目に見える血管は前述6を公開しました。
  3. 前庭部から胃滅菌かみそりの刃を使用して眼底を区切ります。断片約 2.0 × 2.0 mm. 使用鉗子に手術用のハサミを使用してカットの眼底は、EDTA インキュベーション バッファーを含む 15 mL の円錐管にかけらを集める (Ca2 +/Mg2 +-無料の DPBS、5 ミリメートルの EDTA)、4 ° C で 2 時間インキュベート穏やかな攪拌。
  4. 無菌フードでは、円錐管のまま、約 5 分間氷の上の断片が断片はそのまま可能な限り潜伏バッファーを削除するピペットを使用します。5 mL のバッファーを揺れを追加 (1 g 1.47 g ショ糖 100 mL の Ca2 +/Mg2 +に D-ソルビトール-無料の DPBS) 2 分の解決し、1000 p のピペットを使用して、急いで削除まだ解決しなければならない小さな断片に大きなフラグメントを許可の力で手を振るとトップ層。
  5. 65 x g で 4 ° C で 5 分間削除されたフラグメントをスピンします。
  6. 空気の泡を回避しながら上澄みを除去し、基底膜マトリックスで再懸濁しますが均質になるまで混ぜます。
  7. 広いチップ ピペットを使用して、プレートのウェルあたり 50 μ L で基底膜マトリックスとし、37 ° C、20 分インキュベートします。
  8. 十分な mFGO 成長媒体を追加 (高度なダルベッコ修飾イーグル媒体/F12 培 2 mM L グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM HEPES 緩衝液、1 mM n-Acteylcystine、1 x N2、1 x B27、50 %wnt エアコン中 20% R spondin 完備100 ng/mL 骨形成タンパク質阻害剤、10 nM ガストリン、表皮の成長因子の 50ng/mL、10 ng/mL の線維芽細胞成長因子 10、10 μ M Y-27632 ROCK 阻害剤と培) バブルが水没します。
  9. 37 ° C、5% CO2加湿細胞文化のインキュベーターで培養します。メディアのすべての 4-5 日を変更します。

3. コラーゲン コーティング 2 D 転送用

注: は、特に指定しない限り、滅菌のティッシュ文化フードのすべての手順を実行します。コラーゲン 3 D オルガノイドを単層に転送する前に 24 時間をコーティングを開始します。氷上ラット尾コラーゲンを維持し、光から保護されています。コラーゲンをコーティングしたプレートは、2 週間までに適しています。コーティング プレートをすぐに使用していない場合、は、板パラフィルムで 4 ° c まで必要なストアをラップします。

  1. 50 μ g/mL の 20 mM 酢酸を使用してラット尾コラーゲンを希釈します。
  2. 希釈したコラーゲンと井戸の表面が十分にカバーします。標準 12 ウェル プレートの 1 つにも、コラーゲンの約 1 mL でコートします。無菌フードに室温で一晩おきます。
  3. Ca2 +/Mg2 +1 mL で 2 回洗浄-ウェルあたり DPBS を無料、常温無菌フードで 2 h の覆いを取られたまま。

4. 基底膜マトリックス コーティング 2 D 転送用

注: は、特に指定しない限り、滅菌のティッシュ文化フードのすべての手順を実行します。基底膜マトリックス 3 D オルガノイドを単層に転送する前に 2 h をコーティングを開始します。氷の上の基底膜マトリックスを維持します。コーティング プレートがすぐに使用、長期間の保存ことはできません。

  1. 1:10 で細胞培養グレードの水を 15 mL の円錐管の基底膜マトリックスを希釈比。氷の上を希釈します。
  2. 標準的な 12 ウェル プレートの各ウェルに 100 μ L の希釈の基底膜マトリックスを追加ピペットを使用しています。コート用の井戸の中で希薄化後の基底膜マトリックス細胞スクレーパーを使用して、均等に。
  3. 37 ° C 1 時間インキュベートします。
  4. ピペットを使用して残留水を削除し、3 D オルガノイドを転送する前に 1 時間室温で乾燥します。

5. 3D m/hFGOs の 2D 胃上皮細胞単分子膜への転送

  1. 後 3 D マウス- またはひと由来 FGOs 6-7 日間培養した、3 D オルガノイドの 2D 単分子膜への転送を開始します。
    メモ: 必要な単分子膜の各ウェルの勧め 300 そのまま organoids または 300 organoids から派生した単一のセルを使用します。堅牢な文化でそれはおよそ 150 organoid/井戸 12 よく培養プレート内を取得する予定です。
  2. プレートは、転送する前にコーティングされていることを必ず。
    注意: 基底膜マトリックス コーティング プレートは半透明のジェル層を持っている、しかし、コラーゲンをコーティングしたプレートはコーティングの明らかな兆候がないです。
  3. 直接ピペット 1 mL 滅菌 Ca2 +/Mg2 +によってプレートから 3 D の基底膜マトリックス気泡を取り除く-バブルの中心に DBP を無料します。
  4. ピペットを使用して、細胞培養試験管に基底膜マトリックスと organoid 混合物を収集します。チューブあたり 2 つの基底膜マトリックス バブルの比で収集します。40 x g と 4 ° C で 5 分間遠心
  5. 上澄みを除去真空システムを使用して、可能な限り多くの基底膜マトリックス。Ca2 +/Mg2 +4 mL で再懸濁します-無料の DBP、上清を除去、2-3 回繰り返します。全体における転送プロトコル、5.10 のステップに進みます。手順 5.7 単一細胞懸濁液のプロトコルのために進みます。
  6. 37 ° c 細胞剥離液をあらかじめ暖かいし、各試験管に 1 mL を追加します。軽くチューブを反転または上下にピペットでピペッティングで混ぜます。37 ° C で 10 分間インキュベートします。
  7. Ca2 +/Mg2 +2 mL を追加-各試験管に直接 DBP を無料します。
  8. 26 G 針を使用し、混合物を 2-3 回注射器します。単一のセルを視覚的に確認します。Organoids またはセルのクラスターがある場合、1-2 回以上を注射器します。
  9. 40 x g で 4 ° C で 5 分間遠心2 D の FGO メディアでペレットを再懸濁します (2D マウス FGO 成長培地:胎児の子牛の血清は、10 mM 2 mM L-グルタミン 10 mM ペニシリン/ストレプトマイシン、10% を添加した高度なダルベッコ改変イーグル培地/F12 培地 HEPES 緩衝液、1 x N2、1 x B27、10 nM ガストリン、50 ng/mL 上皮成長因子、1 μ M TGF-β 阻害剤、および 10 μ M Y-27632 ROCK 阻害剤を添加しました。人間 FGO 成長媒体の 2 D:高度なダルベッコ改変イーグル培地/F12 培地添加 2 mM L グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM HEPES 緩衝液、10% 胎児の子牛の血清は、10 mM ニコチンアミド、1 x N2、1 x B27、50 mg/mL 50 ng/mL 上皮成長カナマイシンを添加しました。要因と 10 μ M Y-27632 ROCK 阻害剤、1 μ M TGF-β 阻害剤)。
  10. プレート コーティング プレートに再懸濁。37 ° C でプレートを孵化させなさいメディアを交換毎 4 日またはそれ以前場合はメディアが黄色に変わります。単層は、フォームに約 4 日が必要です。

6. スクラッチ傷アッセイ 2D 胃上皮細胞膜を使用して

  1. 文化が 100% の confluency に達したら、単層をスクラッチかみそりの刃を使用します。
  2. 室温で 15 分間 3.7% のホルムアルデヒドを使用して単分子膜を修正します。室温で 20 分間 0.5% 非イオン性洗剤/PBS を permeabilize します。
  3. 次に室温で 1 時間 2% ロバ血清単分子膜をブロックし、H+K+の 1: 1000 希釈と孵化-4 ° c、一次抗体を一晩で atp アーゼを 0.1% 非イオン性洗剤/PBS で洗浄し、ロバの 1: 100 希釈でインキュベート抗マウス 488 二次抗体とヘキスト細胞核の 10μg/mL 1 時間室温で染色します。
  4. 2D 胃ひと由来の単層培養で粘膜表面のピット細胞を識別し、ハリエニシダ(UEAI) FITC 共役の 20 μ g/mL で細胞を染色します。共焦点顕微鏡の単分子膜をイメージ。
  5. すべてのいくつかの h. ゼロ、患者間の変動と、単分子膜の品質に応じて 24-48 h の上皮再傷の画像を取る。

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結果

Organoids はコーパス/人間の体またはマウス胃組織 (図 1 a) の眼底のいずれかから派生しました。それぞれ、コラゲナーゼや胃組織の人間またはマウス由来の EDTA 消化後腺が基底膜マトリックスに埋め込まれ、6-7 日間 (図 1 a) 培養します。図 1 bは、ひと由来胃 organoids (huFGOs) 基底膜マトリックス コーティング室スライド胃上皮単層 (huGEM) に転送されているの形成を示しています。4 日間培養後合流 huGEMs はスクラッチ傷の試金 (図 1 b) に使用されました。画像は、(図 2) 24 時間の期間にわたって文化の中で傷の閉鎖を示した huGEM の時間経過の分析から収集されます。

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ディスカッション

現在のプロトコルは、スクラッチ傷のアッセイに使用することができます人間とマウス由来胃上皮膜の確立を詳しく述べる。プロトコルは居住者の幹細胞主の人間 (またはマウス) から分離組織の概念に依存、修正されたプロトコルが Schlaermannら7で初めて公開されます。特に、合流を確立するここのプロトコルを最適化して胃の上皮単層的に表現する主要な細胞体内の胃上皮内で見つけることができる系統を偏光します。胃潰瘍の修復は、組織再上皮化、再生・増殖9,10,11を含む複雑なプロセスです。特に、私たちの研究室は、胃上皮の再生が再生胃腺内潰瘍縁に鎮痙ポリペプチド/トレフォイル因子 (TFF) 2 表現する化生 (SPEM) の出現と一致することを報告しています。12,13

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、NIH (NIDDK) 5 を支えられた R01 DK083402-07 (YZ) を付与します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media)Life Technologies12634-010
GlutaMAX (L-glutamine)Life Technologies25030-081
ペニシリン/ストレプトマイシンThermo ScientificSV30010
Amhotericin B/GentamicinThermo ScientificR01510
KanamycinThermoフィッシャーRO1510
HEPES バッファーΣ AldrichH0887
n-アセチルシスチンΣ AldrichA9165
N2Life Technologies17502-048
B27Life Technologies12587-010
BMP Inhibitor (Noggin)Pepro Tech250-38
GastrinTocris3006
EGFPepro Tech315-09
FGF10Pepro Tech100-26
ニコチンアミドΣ AldrichN0636
Y-27632 ROCK InhibitorΣ AldrichY0503
TGF-β阻害剤Tocris2939
Ca2+/Mg2+ -free DPBSFisher21-031CV
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies12634-010
Fetal Bovine SerumFBS
OPTIMEMInvitrogen
0.22µMフィルターフィッシャー099-720-004
37 °C ウォーターバス
コラゲナーゼ タイプ 1ワージントン 
ウシ血清アルブミンSigma AldrichA9418
Kimwipes (ティッシュペーパー)Fischer Scientific06-666C
125 mL 丸底フラスコ
1 in (25 mm) 攪拌棒
ラバーセプタム
滅菌ガーゼ
攪拌機
リングスタンド
リングスタンドクランプ
滅菌ペトリ皿
長さ1.5Gの18G針サーモフィッシャー305196
3.5の20Gの脊髄針サーモフィッシャー405182
12ウェル細胞培養処理プレートMidwest Scientific92012
因子の減少、フェノールレッドフリーのマトリゲルTM （基底膜マトリックス)フィッシャーCB-40230C
滅菌カミソリブレードワイド
チップピンセット
湾曲止血鉗子
200µL ワイドピペットチップサーモフィッシャー02-707-134
5 mL 細胞培養試験管フィッシャー14-956-3C
ゴムホース
1 g D-ソルビトール
ショ糖フィッシャーSS-500
解剖顕微鏡
解剖トレイ
ロッキングテーブル
ラットテール コラーゲン 1型ライフテクノロジーA10483-01
細胞培養グレード 氷酢酸フィッシャーA38-212
細胞培養グレード水コーニング25-055-CV
2ウェルチャンバースライドサーモフィッシャー155380
12ウェルトランズウェル(ポリエステルメンブレンインサート)Corning3460
セルスクレーパーCorning353086
Accutase(細胞剥離液)Stemcell Technologies7920
263/8 Gシリンジサーモフィッシャー309625
カミソリ刃
LセルWnt3a産生細胞株であるL細胞は、Hans Clevers博士(Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research、オランダ)から贈り物として贈られました。 N/A
HEK-293T Rspondin分泌細胞改変されたHEK-293T R-スポンディン分泌細胞株は、Jeff Whitsett博士(シンシナティ小児病院医療センターおよびシンシナティ大学医学部、シンシナティ、米国 )から入手しました。  N/A
HK-ATPase Primary AntibodyInvitrogenSC-374094
E-CadherinnSantaCruzsc-59778
UEA1Sigma AldrichL9006
Hoechst 33342Thermo FisherH3570
Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody)ThermoFisher ScientificR37114
LS004214長さ成長付き酸素タンク

参考文献

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