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方法論記事

膠芽腫の異種移植片の生体内イメージング用蛍光分子トモグラフィー

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DOI:

10.3791/57448

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2018年4月26日

 ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, 2Moores Cancer Center, School of Medicine, University of California, San Diego, 3Department of Pathology, School of Medicine, University of California, San Diego, 4Department of Medicine, School of Medicine, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

腫瘍細胞の同所性頭蓋内注入は、脳腫瘍生物学、進行、進化、および治療反応を研究するがん研究に使用されています。リアルタイム生体イメージングと定量腫瘍の臨床神経膠芽腫モデルで質量を提供する蛍光分子腫瘍異種移植片のトモグラフィーをご紹介します。

要約

腫瘍はがん細胞の腫瘍を形成できる質量。細胞の発癌性の決定に広く使用されているアプローチは、がん細胞を免疫不全マウスに皮下注射して後表示されるなり、触知腫瘤の測定です。癌細胞の同所性同種注射は最もよく研究されている腫瘍の起源のティッシュのような微小環境に異種移植の導入を目指してください。脳癌研究では、脳のユニークな微小環境で腫瘍の形成および分析を許可する癌細胞の頭蓋内注入が必要です。頭蓋内の異種移植片の生体内イメージングはしみ込んでがんマウスの腫瘍を瞬時に監視します。ここで脳腫瘍異種移植片の蛍光分子トモグラフィー (FMT) の使用を報告します。がん細胞はまず赤外線蛍光タンパク質近く増殖型、免疫不全のマウスの脳に注入し。動物は時間の長時間にわたる腫瘤について定量的な情報を取得するスキャンします。費用対効果、再現性、および信頼性の高い各マウス内腫瘍負担定量化を可能セルがあらかじめラベルします。画像処理基板を注入する必要性を排除し、したがって、動物のストレスを軽減しました。このアプローチの限界は非常に小さい固まり; が検出できないことによって表されるただし、他の技術より大きい固まりのためのより良い解像度があります。薬物治療の有効性または神経膠腫細胞と患者由来サンプルの遺伝的変化の評価に適用できます。

概要

がんは、先進国の人間の病気関係した死の主要な原因のひとつです。新しい治療法は、非常に高い死者、早急に必要。膠 (GBM) は、脳腫瘍、脳腫瘍、間質、および免疫細胞の異種個体集団から成る非常に致死的なタイプです。米国の中央脳腫瘍レジストリによると悪性と非悪性脳腫瘍の発生率は 10万人あたり約 22 例です。約 11,000 の新しいケースは、2017年1米国で診断されると予想されます。

前臨床試験は、薬物、プロシージャ、または人間でテスト前に効果を発揮する治療法の可能性を調査します。前臨床試験において最も早い所ステップの 1 つはひと異種移植モデルとして定義されている、ホストの有機体の移植癌細胞を用いた薬物治療の分子標的を見つけることです。頭蓋内脳腫瘍 xenograft モデル患者由来の異種移植片 (PDXs) を使用して、このコンテキスト内で脳腫瘍生物学、進行、進化、および治療反応の研究し、バイオ マーカーの開発、最近では薬物に広く使用されています。スクリーニング、およびパーソナライズされた医学2,3,4。

最も手頃な価格で非侵襲的体内イメージング手法頭蓋内の異種移植片を監視するための 1 つは生物発光イメージング (結合)5,6,7,8です。ただし、いくつかのバリの制限、基板管理、可用性、酵素安定性と光焼入れおよび集録9イメージング中に散乱します。ここでは、イメージング法の臨床神経膠芽腫モデルを監視する別の方法として赤外線 FMT を報告します。(今後 FP720 と呼ぶ) 近赤外蛍光タンパク質 iRFP72010,11を表現するこの方法、信号集録と頭蓋内注入 PDXs の定量化、または turboFP635 (今後は FP635 と呼ぶ)FMT のイメージング システムで実行されます。FMT の技術を使用して、同所性同種腫瘍ができる生体内での前に、中に、または治療後で監視臨床観測のための非侵襲的、基板無料かつ定量的に。

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プロトコル

実験動物や感染性病原体、癌細胞のヘッジホッグ レンチなどの使用制度バイオ セーフティ委員会、制度上のアニマル ・ ケアのプログラムによって事前の承認が必要です。カリフォルニア大学サンディエゴ校 (UCSD) の動物のケアのガイドラインをこのプロトコルに従います。

1. FP635 や FP720 構築と神経膠芽腫細胞の分類

  1. 生産し、Tiscorniaらによって記述されたプロトコルに従ってレンチ ウイルスを浄化12
  2. DMEM プラス 10% 牛胎児血清 (FBS) 15 cm 皿; 悪性グリオーマ細胞株から文化約 2.0 × 106セルDMEM に文化 2.0 × 106ひと膠芽腫患者由来 (PDX GBM) 球または/B27 F12 1:1 媒体がひと遺伝子組換え上皮成長因子 (EGF; 20 ng/mL) と FGF のプラス補足 (10 ng/mL) T75 フラスコ。
  3. 37 ° C、5% CO2、および相対湿度 100% のすべてのセルを維持します。
  4. 細胞を分離します。
    1. 神経膠腫細胞のため: プレートから上澄みを除去し、神経膠腫細胞をトリプシン 1 X の 3-5 mL を追加します。
    2. GBM の球: 15 mL チューブに細胞をピペットで細胞を収集します。
      1. 5 分間室温で卓上遠心分離機を使用して 200 x g で糸球体基底膜球スピンダウンします。
      2. 上澄みを除去し、細胞剥離液の 3-5 mL を追加します。
    3. 10-15 分の 37 ° C ですべてのセルを孵化させなさい。
  5. 慎重を上下に数回ピペッティングにより細胞を分離 (球および神経膠腫細胞が完了していることを確認解離) とスピン ・ ダウン 5 分 200 x g で。
  6. 上澄みを除去し、上下に数回ピペッティングで 5 mL の培地で細胞を再懸濁します。、トリパン ブルー色素排除によって細胞の生存率を決定します。
  7. 板 1.0 x 106 10 cm 皿に標的細胞のピペッティングによる媒体の 5 ml。
  8. レンチ ウイルス感染 (MOI) 5 Tiscorniaらによって、前述の多様性で蛍光蛋白質を表現するとセルを変換します。12 37 ° c. で孵化させなさいと
  9. 24 h 後導入された細胞からメディアを取り出して、新鮮な培地 5 mL を追加し、37 ° C でさらに 48 時間インキュベート
  10. 1.4-1.6 の手順に記載されている培養細胞に感染細胞を切り離します。スピン ・ ダウン 5 分 200 x g でセルと並べ替えのソリューションの 500 μ L で再懸濁します (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1 %fbs)。
  11. FACS チューブに細胞懸濁液をピペットします。共同 1 μ L/ml の 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 塩酸死んだ細胞を除外する細胞を染色します。流れの cytometer ゲートを設定するために必要なネガティブ コントロール (非導入細胞と非導入細胞 DAPI 染色/)。
  12. Basu et al.による記述で並べ替えのソリューション、蛍光/正負 DAPI セルに並べ替える13、15 mL の円錐管に並べ替えられた細胞を収集。
  13. 5 分間 200 x g で並べ替えられた細胞をスピン、上澄みを除去し、培養液 5 mL で再懸濁します。ピペッティングで 10 cm 皿に並べ替えられた細胞を播きます。37 ° C 少なくとも 48-72 時間インキュベートします。
  14. セルを解離によって並べ替えセルを展開手順 1.4-1.6 と生体内で実験のため複数の料理にメッキします。
    注: 細胞選別調製および精製の詳細についてを参照してください Basu et al.13

2. 頭蓋内注入 iRFP タグ膠芽腫細胞免疫不全マウス

メモ: 手術を開始する前に、手術室とツールがプロシージャのためにきれいであることを確認してください。4-5 週齢と頭蓋内注射用 17-19 g の間免疫不全無胸腺裸 (Foxn1nu) ・ オスかメスのマウスを使用します。到着後、手術前に、少なくとも 3 日間動物を収納する必要があります。

  1. セル準備
    1. 収穫し単一細胞懸濁液 (手順 1.4 1.6) に蛍光陽性神経膠腫細胞を分離し、2-5 μ L の PBS 動物ごとの注入量で 0.5 または 1.0 x 10 の6細胞を再懸濁します。氷の上を 1.5 mL 遠心チューブに細胞懸濁液をピペットします。
  2. 麻酔の準備と管理
    1. ケタミン (100 mg/kg) とマウスの体重の 20 グラムあたりキシラジン (10 mg/kg) を含む食塩液 200 μ L を準備します。動物の重量を量るし、麻酔の適切な投与量を計算します。
    2. 麻酔の腹腔内注射を提供し、脱水症状を防ぐために目に眼軟膏を適用します。この手順の詳細については、キャスリーンのらを参照してください。14位 37 ° C で予め温めておいた水熱パッドの動物
    3. 動物が 5-10 分以内に通常麻酔下つま先ピンチ応答 (ペダル反射) を監視することによってことを確認します。
  3. 頭蓋内注入
    1. 5 μ L をロード ハミルトン注射器 (針鈍チップ) 細胞懸濁液とプローブ ホルダーにマウント。
    2. 小さな動物の定位脳手術フレーム内にマウスを置くし、耳バーとパルミチン酸セチルらによって記述されている詳細を以下切歯アダプターを使用して頭を修正15
    3. 70% エタノール、betadine ソリューションで頭を駆除します。完了を確認、手術部位は滅菌します。小さなメスを用いて中央切開を行い、皮膚や結合組織を分離します。
    4. ハミルトン シリンジをマニピュレーターを使用して前のポイントに配置します。
    5. 前の点からプローブ ホルダー 1.0 mm 前後と 2.0 mm 外側を移動します。この位置を鉛筆でマークします。
    6. この場所で慎重に穴を作る頭蓋骨のマイクロモータの手持ち型のドリルで血管が見えるようになるまで、下方のわずかな圧力を適用することによって。くも膜膜と脳実質を中断しません。
    7. バリの穴に針を導入し、3.0 mm 軟膜の表面下を進めます。
    8. (2-5 μ l) と電動固定装置用インジェクターを使用してインジェクションの流量 (1 μ L/分) を設定または手動で注入を行います。
    9. 注入後に、1.0 mm 1 分毎に昇順で徐々 に針を除去し、70% エタノールを注射部位をきれい。
    10. すぐ皮膚創傷外科ステープルまたは縫合 (ステッチとも呼ばれます) することによって、キャスリーンのらを参照してください。詳細については、 14 。
  4. 動物の回復
    1. 動物を水熱パッド (37 ° C) に転送し、完全復旧まで体温、呼吸数、心拍数を監視します。標準プロトコルごとの鎮痛を管理します。
      注: 定位の手順の詳細については、外科および座標を参照してくださいその他レポート5,14,15。

3. FMT イメージング

注: 実験の目的によると、iRFP タグ膠芽腫細胞がすることができます監視体内の前に、中、または治療後。目的をイメージング、イソフルラン誘導室を用いた動物の麻酔、スキャンと FMT イメージャのドッキング ステーションのイメージの中にイメージングのカセットで維持します。

  1. ケージとイソフルラン誘導室の場所から動物を削除します。商工会議所を閉じ、酸素の流れと 3-5% に気化器をオンにします。
  2. 動物の監視完全に麻酔がかかるまで通常 1-2 分無意識内で動物がない外部刺激に応答します。
  3. 商工会議所から麻酔下の動物を取り出し、下向き動物を配置することによって続いてヘッド アダプターを最初に配置することによって画像のカセットに動物を入れてください。頭がカセットの中心にあることを確認します。
  4. カセットのトップ プレート上に配置、17 mm までの調整ノブを締めます。
  5. 一度はセキュリティで保護された動物は、イメージングのカセット、カセットをイソフルラン麻酔動物を保つためにポンプでくまれるところ FMT イメージャの内部のドッキング ステーションに挿入すると、画像に進みます。
  6. イメージャーとアナライザーのソフトウェアを実行するには、ソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。
  7. 「実験タブ」ウィンドウで「データベース」、「研究グループ」を選択します。
  8. 「スキャン」タブ「ウィンドウに移動し、「テーマの選択」をクリックして、イメージ選択します。また、「レーザー チャンネル」パネルでレーザー チャネルをを選択します。FP635 ラベル セルの"レーザー チャネル 635 nm"を選択し、FP720 ラベル セル「チャネルは 680 nm レーザー」を選択します。
  9. 「スキャン タブ」ウィンドウの「キャプチャ」オプションをクリックして、イメージを取得します。次に、クリックして通常 20-25 同側のソース内のソース場所の決定数をキャプチャしたイメージのスキャン フィールドをドラッグ スキャン フィールドを調整します。
  10. 「復興キューに追加」オプション オンに、「スキャン タブ」ウィンドウで"スキャン"をヒット。
  11. スキャンが完了するまで待ってから、ドッキング ステーションからイメージングのカセットを取り外します。
  12. カセットの上部プレートを取り外し、ケージに動物の背中を置きます。
  13. 動物の残りの部分について、手順 3.1 3.12。

4. 画像解析

  1. 撮像素子とアナライザーのソフトウェアから「解析タブ」ウィンドウを選択します。
  2. データセットと「分析タブ」ウィンドウの「データセットの選択」パネルに「+」ボタンをクリックすると、分析する対象を読み込みます。
  3. 「解析タブ」ウィンドウでイメージがロードされると、"分析タブ"ウィンドウの左上隅にある楕円形アイコンを選択して利益 (率 ROI) 分析の領域を実行します。
  4. 「統計データ」パネルで"分析タブ"ウィンドウの「しきい値」列を右クリックしてゼロしきい値を調整。
  5. 「統計データ」パネルの合計値は、マウス脳に注入蛍光タグ膠芽腫細胞から信号を表します。
  6. 動物の残りの部分について 4.2 4.4 の手順を繰り返します。ロードまたはクリックして新しい件名を削除する、「+」または「−」ボタン、「分析タブ」ウィンドウの「データセットの選択」パネルで、それぞれ。
    メモ: FMT イメージングとソフトウェアの操作の詳細については、参照してください20 。

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結果

神経膠芽腫細胞の U87EGFRvIII (U87 細胞発現 EGF 受容体変形 III) ステップ 1.2 によると培養しました。レンチ ウイルスは制作され、1.1 のステップによると精製します。ウイルス濃度は p24 によって決定された elisa 法。セルが 1.8 のステップに従って赤外線蛍光タンパク質を運ぶレンチ ウイルスで導入しました。FP72010,11をエンコーディング プラスミドが博士 v.v. Verkhusha によって提供された親切と FP635 ベクトルは商業ベンダーから購入。標的細胞は、FACS のトップの 10% 最も蛍光細胞集団 (図 1 a) を豊かにするソートを考えられました。蛍光信号を増やしている蛍光断層撮影システムの感度を向上させます。同所性同種移植前に細胞を蛍光標識の信号の強度を検証するため、FMT イメージャの幻のカセットを使用しました。具体的には、U8...

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ディスカッション

癌は癌研究で広く使用されているし、定評のイメージング技術の数が開発されている: バリ;磁気共鳴画像 (MRI);陽電子放射断層撮影 (PET) 計算された断層撮影 (CT);FMT。これらのアプローチの各客室には長所と短所が最終的に提供される情報の種類とお互いを補完します。最も一般的に使用される、生体内イメージング技術の 1 つはバリ5,6,7,8です。バリと FMT 両方細胞工学 (ルシフェラーゼ酵素または赤外線蛍光タンパク質) の遺伝子発現に影響を与えることができますが必要です。バリは小さな腫瘤のより敏感な体内では 10-12 分; ディストリビューションの最大に達する基板 (ルシフェリン) の腹腔内投与を必要があります。しかし、焼入れと買収、イメージング中に散乱光し、基板のクリアランスが頻繁に発生する9。FMT ...

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開示事項

著者は利益相反行為を宣言しません。

謝辞

GBM PDX 神経幹細胞の博士フレデリック ・ ラング、MD アンダーソンがんセンターに感謝いたします。この作品は、敗戦 GBM 研究共同、腫瘍社会脳国家 (フランク フルナリ) R01 NS080939 (フランク フルナリ)、ジェームス s. マクドネル財団 (フランク フルナリ); の子会社によって支えられました。ホルヘ ・ ベニテスに支えられ賞アメリカの脳腫瘍連合 (ABTA) からは。シロ Zanca はアメリカ イタリア語がん財団特別研究員奨学金によって部分的に支えられました。フランク フルナリ癌研究所から給与とその他のサポートを受け取ります。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEM/高血糖 HyClone/GESH30022.1
DMEM/F12 1:1 Gibco11320-082
FBSHyClone/GESH30071.03
Accutase革新的な細胞技術AT-104
トリプシンHyClone/GESH30236.01
B27 supplementGibco17504044
human recombinant EGF Stemcell Technologies2633
ヒト組換えFGFStemcell Technologies2634
DPBSCorning21-031-00
FACS チューブFalcon352235
DAPIThermoFisher Scientific62248
BlasticidinThermoFisher ScientificA1113903
p24エリサ Clontech632200
XylazineAkornNDC 59399-110-20
KetamineZoetisNADA 043-403規制物質
軟膏DechronNDC 17033-211-38
吸収性縫合糸CpMedicalVQ392
5 ul シリンジ ハミルトン26200-Uカタログ番号Sigma-Aldrich
Cell SorterSonySH8007
マウス定位固定装置フレーム Stoelting51730
電動定位固定装置インジェクターStoelting53311
マイクロモーターハンドヘルドドリルForedomK1070
マウスウォーミングパッド ケン・サイエンティフィング(株TP-22G
蛍光断層撮影装置 PerkinElmerFMT 2500 XL
TrueQuant イメージングソフトウェア パーキン・エルマー 
超遠心分離機 オプティマ L-80 XPベックマン・コールター392049
組織培養 100mm ディッシュオリンパス プラスチック25-202
組織培養 150mm ディッシュオリンパス プラスチック25-203
組織培養フラスコ T75コーニング430720U
50 mL 円錐管コーニング430290
15 mL コニカルチューブOlympus Plastics28-101
Centrifuge Avanti J-20Beckman CoulterJ320XP-IM-5
Tube, ポリプロピレン, 薄壁, 5.0 mLBeckman Coulter326819
チューブ, 薄壁, ポリプロピレン, 38.5 mL, 25 x 89 mmBeckman Coulter326823
Athymic Nude miceCharles River Laboratoriesひずみコード 490 (ホモ接合体)施設動物管理プログラムおよび施設バイオセーフティ委員会による事前承認が必要。   
) 7005319

参考文献

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