膠芽腫の治療の幹細胞シード足場の頭蓋内注入画像誘導切除

サマリー

腫瘍を求めて治療間葉系幹細胞 (MSCs) 侵襲神経膠芽腫のための処置として約束を示します。最適な移植には、足場に腫瘍切除キャビティへの MSCs の配信が含まれます。ここでは、神経膠芽腫の MSC 治療を研究する臨床技術を含んで提供される: 画像ガイド下腫瘍切除;MSC シード足場; の注入術後療法を追跡します。

要約

膠芽腫 (GBM)、最も一般的で積極的な脳腫瘍の症例は 12-15 ヶ月の余命を運ぶ。余命の短いは、侵襲性の腫瘍巣を除去するために続いて放射線と化学療法、外科的切除から成る現在の治療のできない一部予定です。これらの病巣の治療は、抗腫瘍ヒト間葉系幹細胞 (MSCs) によって改善されること。MSCs では、強力な腫瘍親和性を展示し、腫瘍細胞を殺す表現治療タンパク質を設計することができます。前臨床モデルの進歩を示すその切除早期 MSC 喪失を誘導し、治療効果を低減します。MSC 治療の有効性は、生分解性 poly(lactic acid)) 足場に播種 MSCs によって改善できます。PLA 足場に外科的切除空洞に MSC 配信は、セルの保持、保存、および腫瘍の殺害を復元します。糸球体基底膜の PLA の MSC シード注入の効果を研究、正確な前臨床モデルが必要です。ここで注入後 MSC シード足場免疫欠損マウスにおける糸球体基底膜の画像ガイド下腫瘍切除のため前臨床外科プロトコルを提供します。MSCs は、構成を表現し、蛍光の追跡を許可する緑色蛍光タンパク質 (GFP) と同様、治療 tnf α 関連アポトーシス誘導リガンド (TRAIL) を分泌するレンチ ウイルスの構造に設計されています。同様に、U87 腫瘍細胞は、エクスプレス mCherry とホタルのルシフェラーゼ、デュアル蛍光/発光の追跡を提供する設計されています。現在、治療の幹細胞を介した配信を調査に使用、このプロトコルは糸球体基底膜の他の介入に外科的切除の影響を調査する変更でした。

概要

膠芽腫 (GBM) は、成人、陰気な生存期間中央値は 12-15 ヶ月^1,2,3,4、5の最も一般的な脳腫瘍の症例です。2005 現在の放射線と併用し、補助のテモゾロマイド化学療法に続いて最大の外科的切除の臨床標準の頃^6,7を採用したので生存率は、大幅に改善しません。この治療法は、患者の症状の一時的な救済を提供しながら治療の標準に必ず結果再発浸潤癌病巣切除を回避するし、血液脳関門 (BBB) によって全身療法から保護されます。この積極的な衰弱させる病気に対するトラクションを得るためには、BBB を回避しながら腫瘍浸潤巣を対象とする戦略が急務します。

ヒト間葉系幹細胞 (MSCs) は、そのネイティブの腫瘍親和性^8,9による糸球体基底膜の配送車薬として約束を示します。MSCs の受容体を持っているし、間質細胞由来因子 1 α など、腫瘍が分泌する可溶性因子への移行 (自衛隊 1 α)、マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ 1 (MMP 1)、および単球走化性因子タンパク質-1 (MCP-1) 他の人の間で^10,11,12,13。 工学 MSCs 表現および細胞毒性薬を分泌する腫瘍ホーミング薬物送達車として活かされることができます。設計された MSCs は、腫瘍浸潤巣に向かって移動、治療用タンパク質を提供します。このアプローチは、さまざまな臨床糸球体基底膜モデル^9,14の可能性を実証しています。しかし、これらのモデルの大半はこのコンポーネントの臨床関連性にもかかわらず外科的切除を含めないでください。切除の新しいモデルを用いた研究を新たな外科的摘出が摘出腔¹⁵に直接注入される幹細胞の永続性を減少させることを明らかにしました。実行可能性の損失結果減少効果、腫瘍浸潤病巣に線量そして薬剤の持続期間の減少により可能性が配信されました。

幹細胞と薬剤投与を増やす、注入前に足場に MSCs をシードできます。このプロトコルでは生体親和性と吸収性のエレクトロスピニング ナノ poly(lactic acid))、MSCs PLA 折り曲げとインプラント治療のカバレッジを最大化、最小化時に切除キャビティの形状に適合のための足場として使用されます、。MSCs の距離は、腫瘍細胞に到達する旅行する必要があります。MSCs は、注入中に足場上に残ります、注入^16,17後腫瘍細胞へ足場を移行します。MSCs と彼らを運ぶ、細胞傷害性薬剤は腫瘍巣に蓄積されます。腫瘍への薬剤の配達には、MSC 生存率および足場の注入による支援の永続化が必要です。

この手順でレンチウイルスベクターを使用 (体外追跡) 蛍光と発光 (生体内での追跡) を安定に発現を誘導するがんと幹細胞ラインのマーカー。ヒト糸球体基底膜ライン U87 は mCherry とホタルのルシフェラーゼ (U87 母子-フロリダ州) と GFP および renilla ルシフェラーゼ (MSC GFP Rluc) と非治療の MSCs に感染しています。MSCs の治療のバリエーションは、tnf α 関連アポトーシス誘導リガンド (TRAIL-MSC) を表現します。近くの癌の死の受容体にバインド トレイル、構成的分泌蛋白質、細胞およびカスパーゼ - アポトーシス¹⁸を開始。

ここでは、前臨床画像誘導 GBM の外科的切除と MSC シード足場の注入のためのプロトコルを提供します。簡単に言えば、ヌードマウスに開頭手術 3 日後に原発腫瘍を確立する U87 mCh フロリダの定位の同所性注入が続きますが与えられています。明らかな移植腫瘍は、約 1 週間の期間が増加します。PLA の足場は、切除手術する前に MSCs 48 h にシードされます。蛍光の指導の下で腫瘍は切除し、MSC ロード足場が切除キャビティ内に注入されます。腫瘍の負担とマウスの生存率は、生物発光イメージング (結合) の手術後、追跡されます。これらのプロシージャのタイムラインを (図 1) を以下に示します。

図 1: プロシージャのタイムライン。マウスは、当初頭蓋ウィンドウ (0 日) を受け取る。腫瘍は、3 日間の回復期間後 (日 3) を注入し、約 1 週間の成長します。足場は、腫瘍の切除と移植の手順 (10 日) の前に 2 日間 MSCs (8 日) にシードされます。腫瘍の進行と治療効果は、術後その後イメージング (日 10 +) を介して評価されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) のノースカロライナ大学チャペルヒル校によって承認されています。

注: 開く開頭術、マウスにこの手順を実行 Mostany と・ ポルテラ Cailliau¹⁹の摘出は骨組織を破棄する前記によるプロトコルの修正されたバージョンとして設立バリアフリー脳を残して、最終的な糸球体基底膜腫瘍切除術。小沢氏とジェームズの²⁰記載, 開頭手術後腫瘍は定位注入を介して確立されます。我々 インプラント (前から mm) で次の定位座標で 1 × 10⁵ U87 mCh Fl 細胞: (2.5, 0,-0.5)。

1. 細胞培養足場の準備

注: 足場は、マウスに注入する前に 48 h が準備されるべき。以下のボリュームは、足場ごとに基づいて提供しています。追加足場の必要に応じて数量を乗算します。

1. 切除キャビティ サイズ (約 2 mm × 2 mm) に PLA の足場を切る。足場は、はさみを使用してまたは再現性の穴パンチを使用して手でカットできます。
2. 滅菌 PBS 中に浸漬後 15 分間 70% エタノールに浸漬します。播種用細胞を準備している間 10% 牛胎児血清 (FBS) 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) に足場を配置します。
3. 0.05% トリプシン (T75 フラスコの 3-5 mL) を用いた培養 MSCs を持ち上げます。37 ° C、5 分セルが持ち上げたことを確認で孵化させなさい、トリプシンを不活化するフラスコに 7-10 mL DMEM を追加します。
4. 15 mL 遠心管にフラスコの内容を転送します。診断を使用してセルをカウントします。5 x 10⁵ 5 分 100 × g で遠心分離を介して各足場 MSCs をペレットします。
5. 上清を吸引し、5 x 10 の⁵セルあたり 5 μ l 添加 DMEM で MSCs を再懸濁します。
6. それらの乾燥を叩き、シードの足場を準備します。
   1. DMEM 浸漬から鉗子で足場を削除し、一時的に 6 ウェル プレートの蓋の上に置きます。過剰な DMEM の液滴を残して、ふたを足場を持ち上げます。
   2. 新しい、乾燥場所で、再び蓋に戻って足場を配置します。3-5 回、繰り返す播種 6 ウェル プレートで部分的に乾燥した足場を配置します。各足場に対して繰り返します。
      注: 部分的乾燥足場は、最適な細胞播種結果を提供します。足場が余りにぬれている場合、細胞は足場をオフにスライドし、ウェル プレートの下に従います。足場があまりにも乾燥している場合、液滴が全体の足場は、貧しい人々 の初期細胞配分に終って上普及していません。
7. ピペットを使用して、優しく、底に解決するかもしれないいくつかの細胞懸濁液を均質化する幹細胞のバイアルをミックスします。
8. ゆっくりと新鮮な足場では、足場の上に小さな液滴を作成する上で直接 MSC を懸濁液を混合 2.5 μ L をピペットします。
9. 各井戸の端に 300 μ L DMEM を追加します。これはセル液滴の急速な蒸発を防ぐ。足場に付けるセルを許可する 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。
10. 鉗子、優しくウェル プレートで足場を反転します。シード 2.5 μ L 混合新鮮な MSC に懸濁液 (この結果、足場ごとシード 5 x 10 の⁵セルの合計)。足場に付けるセルを許可する 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。
11. 6 ウェル プレートの各ウェルに 2 mL を追加して DMEM で足場をカバーしてください。メディアがそれらの下に流れるように足場をそっと持ち上げます。移植手術前に 48 h にこの状態で 37 ° C で孵化させなさい。
12. 24 h と追加/変更メディア後足場を確認する余分な蒸発または pH の不均衡のため変色したメディアが観察される場合。

2. 蛍光ガイド下切除と足場注入

注: 手術の初期化前にすべてのツールを滅菌します。機関 IACUC プロトコルに従って、予防的鎮痛を管理します。

1. 解剖顕微鏡蛍光の段階の脳定位固定装置のフレームを配置します。
2. 誘導室における吸入イソフルランの下にマウスを麻酔します。一度麻酔、イソフルラン ノーズコーン アダプターを介して連続的な吸入麻酔供給脳定位固定装置のフレームでマウスを固定します。加熱パッドやプローブの体温を維持します。
   注: 4-5% イソフルランは誘導に適した 2-3% 維持のために適して、この適応および各マウスの監視が必要であります。
3. 角膜の乾燥を防ぐために目に眼軟膏を適用します。3 つのアルコールや betadine ワイプの 3 つのシリーズで頭皮の切開部位を消毒します。
4. 各肢のつま先ピンチ反射テストを実行し、適切な anesthetization を確保するための否定応答を確認します。約 55 65 呼吸/分で安定した呼吸率を確保します。
5. 鉗子を使用して、ピンチ、優しく頭皮を持ち上げます。外科はさみで正中線の線形の吻側尾側切開を作る。PBS の切開部位に水を引くし、ブラッシングの円運動で綿の先端アプリケータと皮下脂肪を除去します。以前に確立した頭蓋ウィンドウが完全に表示されるよう、皮膚を配置します。
6. 優しくだけ 18 G 針を用いて頭蓋のウィンドウの境界線の内側の硬膜を穿刺します。切開完全トレース ウィンドウの内部までを繰り返します。
7. 硬膜を削除するには、離れて明らかに基になる柔組織と腫瘍の微細鉗子を使用してそれを剥離します。
8. 部屋のライトをオフにして、実体顕微鏡蛍光モードをオンにして U87 mCh フロリダ腫瘍を見つけます。真空ポンプのチューブの端に 1-200 μ L ピペット チップを読み込むことによって切除の準備します。
9. 真空ポンプをオンにします。信号がなくなるまで優しく蛍光組織を吸引によって腫瘍を切除します。真空ポンプの電源を切り、ピペット チップを破棄します。オン オフ蛍光と部屋のライトを入れます。
   注: 出血を制御するため冷 PBS で灌漑し、綿の先端アプリケータと着実に圧力を適用します。深刻なケースで切除空洞も一時的にパックできます止血剤で出血が別の PBS の灌漑に続いて停止した後削除されます限り。
10. 注入直前にゆっくりと不要なメディアおよび関連コンポーネントを削除する PBS の PLA の MSC シード足場を浸しなさい。切除空洞に足場を注入します。必要な場合は、場所に 1 μ L フィブリノゲン (67 106 mg/mL) 1 μ L トロンビン、足場を確保する (400 625 な U/mL) に続いてを追加します。
11. 削除硬膜と骨フラップ既に破棄頭蓋の] ウィンドウから、皮膚を閉じるし、手術用の接着剤を適用するだけで傷をシールします。吸入麻酔薬から動物を外し、加熱面に回復することができます。
12. ケージに戻り、一度歩行マウス。IACUC 承認スケジュールで鎮痛剤を管理します。各マウスの手順を繰り返します。

3. 術後画像

1. 28 G インスリン注射用の針を使用して、D-ルシフェリン (150 mg/kg 腹腔内投与) でマウスを注入します。
2. 10 分を待ちます。これは体全体を循環し、ピークの式を取得する脳内ルシフェラーゼ発現がん細胞と反応するルシフェリンをできるようになります。
3. (前述のように) として、イソフルラン麻酔下で生物発光イメージング腫瘍を可視化する (結合) システムでマウスをイメージします。必要な (数秒から数分) 腫瘍の大きさに応じて、露出時間は異なります。
4. 腫瘍の成長速度を決定するため必要に応じて画像検査手順を繰り返します。動物の健康を監視し続けます。
   注: 治療上の MSCs 恒常トレイル、がん細胞を殺すと全体的な腫瘍の成長を抑制することを表明します。2-5 日ごとのイメージングは、この目的のため十分な頻度を提供します。
5. IACUC プロトコルで説明されている定義済みのエンドポイントが満たされているとき、transcardial 潅流によってマウスを犠牲にし解析のためのティッシュを収集します。

結果

U87 腫瘍細胞は、高速 mCherry しホタルのルシフェラーゼ (U87 母子-フロリダ州)、注入前と画像誘導切除および発光 (図 2 a・ C) を追跡できるように設計されました。幹細胞同様に診断 GFP-Rluc (MSC GFP) または治療の GFP 試み (MSC 歩道) で設計されて, 添付ファイル (図 2 Dの-F) の増殖を確認する PLA 足場上.

図 2: 蛍光がん細胞と MSCs の代表的なイメージは、PLA でシードします。...

ディスカッション

次の点を考慮に入れて精度を最大化し、時間のかかる落とし穴を避けることを考えれば通常マウスあたり 30 分以内で手術を完了できます。まず、正しく手順を開始する前に脳定位固定装置でマウスを確認します。不要な頭の動きは、開頭手術の手術の精度、腫瘍移植と腫瘍切除の程度の位置に制限されます。切除前、硬膜腫瘍の部分を完全に削除します。それを吸引中にステータス退避とタフな線維性の硬膜が堅くなります。完全に削除されなかった場合焼入れ硬膜が吸引先端モビリティに制限し、完全な切除を防ぐ。切除、時に血管がしばしば誤って重要な出血を引き起こす腫瘍と一緒に切除しました。過剰な血蛍光信号の強度が減少して、腫瘍が不明瞭します。切除時に腫瘍の可視性を維持する切除、適切な範囲を確保し、健康な組織や余分な出血の除去を制限します。小さい出血は、冷たい生理食塩水で破損した容器に水を引くし、綿の先端アプリケータと穏やかな圧力を適用します。出血が続く場合は、2 〜 3 分の空洞に止血剤をパック、鉗子で取り外します。PBS セル シード足場を注入する前に生理学的 pH を復元するのにはその後で水を引きます。切除を完了し、出血が止まり、最終的な落とし穴は不十分な皮膚創傷閉鎖です。これ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス用脳定位固定装置のためだけ	に Stoelting	51730	手術中に頭部の位置を安定させる
蛍光解剖実体顕微鏡	ライカ	M165 FC	切除中の腫瘍のリアルタイムイメージングが可能
電動統合型脳定位固定装置(ISI)システム	Stoelting	53315	正確な腫瘍細胞注入量と注入速度が可能
Vetbond組織接着剤	3M	1469	皮膚の傷を閉じるためのSugical接着剤
人工涙液	Akorn	664268	手術中の目の乾燥を防ぐ
Webcol アルコール製剤	Covidien	6818	切開部位の滅菌
ベタジン手術用スクラブ	Purdue Fredick Company	6761815117	切開部位の滅菌
コットンチップアプリケーター	フィッシャーブランド	23-400-115	手術ツール
E-vac吸引システム	Argos	EV310	腫瘍の切除に使用される真空ポンプ
フィブリノーゲンとトロンビンをそのまま受け取ったものから抽出 TISSEEL	Baxter		を一時的に固定するため切除腔内
IVIS Kinetic in vivo光学イメージングシステム	キャリパーライフサイエンス		生物発光イメージャー
D-ルシフェリンカリウム塩	PerkinElmer	122799	In vivoイメージング剤

足場