方法論記事

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

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DOI：

10.3791/57463

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2018年5月21日

 , 
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

この記事について

サマリー

蛍光顕微鏡を使用し、アクティブなカスパーゼ 1 のアダプター、ASC 染色細胞単位で炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化の検出について述べる。乳酸脱水素酵素のリリースの試金である人口に基づいて pyroptotic 換散を検出する. します。これらのテクニックは、インフラマソーム生物学の多くの面を調査する合わせることができます。

要約

Inflammasomes は、多くの病原体の制御に成功したために必要ですがまた炎症性推進生得の免疫シグナル伝達プラットフォームと, 炎症性疾患です。Inflammasomes は細胞質パターン認識受容体、NOD のような受容体 (NLR) 家族のメンバーを含むによってアクティブ化されます。これらの受容体は、微生物または損傷関連刺激の検出時に oligomerize します。アダプター蛋白質 ASC の後の採用は、近接による自動-活性化を介してカスパーゼ 1 をアクティブにする顕微鏡可視インフラマソーム複雑なを形成します。次の活性化は、カスパーゼ 1 裂く pro il-1 β および pro-イル-18、活性化とこれらの炎症性サイトカインの分泌に 。カスパーゼ 1 は、pyroptosis は、膜の完全性および細胞の換散の損失を特徴と呼ばれる細胞死の炎症性フォームを仲介します。カスパーゼ 1 は、gasdermin D、膜の細孔を形成する N 末端フラグメントを解放浸透圧溶解につながるを裂きます。

In vitroカスパーゼ 1 の活性化は、カスパーゼ 1 の活性プローブ FAM YVAD FMK 骨髄由来マクロファージをラベリングと ASC アダプター蛋白質に対する抗体を用いた細胞の分類によって決定できます。この技法は、インフラマソーム形成および蛍光顕微鏡を用いた細胞のカスパーゼ 1 の活性化を識別できます。Pyroptotic 細胞死は、培地に細胞の乳酸脱水素酵素の放出を測定することによって検出できます。この手順では、単純なコスト効果の高い、スクリーニングのための適応をできるように、96 ウェル プレート形式で行われます。本稿で示すアダプター蛋白質 ASC とカスパーゼ-1 アクティブの共局在のため、nigericin による炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化 pyroptosis につながる.

概要

インフラマソームを介した炎症病原体1防御の重要なコンポーネントですが、また多くの病気2の病因の基となります。病原体関連分子パターン (PAMPs) ゾル性細胞質の検出による感染症の広い範囲に炎症反応が発生または損傷関連分子パターン (DAMPs)。パターン認識受容体 (PRR)、うなずくような受容体 (NLR) 家族のメンバーを含むは、PAMPs と DAMPs これらの検出時に oligomerize します。これは PRR、アダプター蛋白質 C ターミナル カスパーゼ募集ドメイン (カード) (ASC) とのプロのフォームを含むアポトーシス関連の斑点のようなタンパク質を含んだインフラマソームと呼ばれる複数の蛋白質の複合体の形成をトリガーします。カスパーゼ 13,4。この複合体では、近接による自動-カスパーゼ 1 の活性化ことができます。アクティブなカスパーゼ 1 は、一連の炎症性細胞死経路 pyroptosis の特徴であるイベントにつながります。これらのイベントが含まれます: 胸の谷間と炎症性サイトカイン il-1 と IL-18、細胞外領域、核の凝縮、gasdermin D 胸の谷間にリソソーム内容のリリースでリソソーム エキソサイトーシスのリリース。Gasdermin D のリリースされた N 末端ドメインは、細胞膜、細胞膜の破断と病原体複製5,のための保護ニッチを奪うだけでなく、炎症性の内容のリリースを引き起こす毛穴に挿入します6,7。

ここでは、我々 はよく研究炎症: NLRP3 インフラマソームに焦点を当てます。炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化は、8段階のプロセスを介して行われます。「プライミング」最初ステップは、微生物製品の Toll 様受容体 (TLR) によって認識を介して行われます。これは実験室の設定で TLR4 を刺激する LP を使用してレプリケートされます。この刺激 upregulates 炎症: NLRP3 と pro il-1 Nf-kb がシグナル伝達を介した。またプライミング脱9,10とリン酸化または特定の残基11,12の脱燐酸化を誘導することによって非転写メカニズムを通じて炎症: NLRP3 をライセンスします。

炎症: NLRP3 活性化のため 2 つ目の信号は、とらえどころのない8のまま炎症: NLRP3 活性化のための統一機構がカルシウム、カリウム排出、活性酸素種ミトコンドリア因子を含むと考えられます。活性化された炎症: NLRP3 そのナハト ドメイン間の相互作用を介して oligomerizes、pyrin (PYD) ドメイン13のバインディングによって ASC を募集します。各セルにこれらの高分子複合体は単一の顕微鏡的表示フォーカスを形成します。ASC はもともとひと白血病細胞のアポトーシスの間に「染み」を形作る 22 KDa タンパク質とカード14を含む名前付きのアポトーシス関連斑点のようなタンパク質として同定されました。ASC は、pro-カスパーゼ-1 インフラマソーム15を形成プロ-カスパーゼ-1 のカードと ASC のカードとの相互作用を通じて募集がわかった。

すべての NLRs は、カスパーゼ 1 の活性化を誘導するために ASC の存在を必要とします。炎症: NLRP3 とは異なり NLRC4 と NLRP1b カード ドメインがあり、直接プロ-カスパーゼ-1 カスパーゼ 1 の活性化を誘導するために - カード相互作用を採用できます。ASC がない場合は、アクティブなカスパーゼ 1 細胞質を通じて拡散ままで、単焦点を形成していません。このびまん性のアクティブなカスパーゼ 1 が pyroptotic 細胞死を誘導するのに十分なプロ il-113,16を処理することはありません。

本稿では、インフラマソーム活性化を評価するために 2 つの方法を説明します。最初は、蛍光のアクティビティを使用してプローブ、FAM-YVAD-FMK、プロテアーゼのカスパーゼ 1 家族を結合します。この家族には、カスパーゼ 1、またマウス カスパーゼ-11 と人間カスパーゼ-4 とカスパーゼ 5 が含まれています。カスパーゼ-1/11 欠損マウスのマクロファージを使用して、すべての実験で、このプローブの特異性に対処されます。このメソッドは、抗体のも説明インフラマソームのコンポーネントの分類と組み合わせることができます。可視化は、アクティブなカスパーゼ 1 と低分子化 ASC を含む個々 のセルの識別のためことができます。このメソッドを使用して、研究者は、インフラマソーム形成カスケード効果がある宿主細胞や病原体研究の下の彼らの操作を決定することができます。たとえば、1 つは特定の介入が複雑な炎症: NLRP3 に ASC の採用を防ぐことができますまたは17カスパーゼ 1 の活性化とその後の採用ターゲットかどうかを区別できます。Il-1 β の分泌などカスパーゼ 1 の活性化の結果を調べることがこれらの 2 つの状況を区別することができません。また、il-1 β の分泌は、カスパーゼ 1 をアクティブにし、pyroptotic 細胞死16を受ける細胞の機能を変えることがなく変更できます。

2 番目のメソッドは、前述のように、カスパーゼ 1 の活性化を次 pyroptotic 大食細胞換散の中に発生する細胞培養上清への乳酸脱水素酵素 (LDH) の放出を測定します。この 2 番目の方法は、全体で LDH のリリースも測定は人口ベースのアプローチです。この単純なアプローチは試料の迅速分析 (インキュベーション時間の 30 分) カスパーゼ 1 を介した細胞死があるかを判断することができ、96 ウェル プレート形式で実行することができます。

これらのメソッドは、補完的なそれぞれ異なる利点との両方が簡単に変更の影響を受けやすい。たとえば、インフラマソーム刺激前にターゲットを絞った小さな分子量化合物によるマクロファージ治療は炎症反応を制御するタンパク質が特定の役割を調査するため使用できます。

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プロトコル

動物のすべてのプロシージャは、承認され、ワシントン機関動物ケアおよび使用委員会ガイドラインの大学の下で実施します。

1. 骨髄の収穫

  1. 無菌マウスの大腿骨と脛骨を削除し、きれいに滅菌器具を使用して骨。ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L グルタミン + 0.05 mM 2-メルカプトエタノール + 50 mg/mL ゲンタマイシン硫酸塩 + 10,000 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン 10% ウシ胎児血清 (FBS、DMEM 10 完全な) 内洗浄の骨を置き、孵化させなさい、15 分間氷の上管です。
  2. はさみを使用して近位および遠位部のボール ジョイントを外します。満ちている中骨の中空に 10 mL の注射器に付いている 25 G 針を挿入します。DMEM 10 完全なを使用して骨髄をフラッシュします。優しく上下に培地を分注していずれかの塊を再懸濁します。
  3. 300 × g で 10 分間の細胞を遠心し、診断を使用してセルの数をカウントします。この時点で、90 %fbs + 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を使用してセルをフリーズまたは 15 cm エアコン L929 媒体 (ステップ 2.1) を用いたマクロファージを区別するためにシャーレで細胞をプレートします。

2. 骨髄由来マクロファージの分化

  1. 予め温めておいた分化培地 (DMEM 10 完全な 21 mL とスワンソンet al.による記述で L929 細胞エアコン用培地の 9 mL を使用してください。18) 組織培養骨髄細胞を入れて 15 cm シャーレ (1.2-1.5 倍の 10 の7セル) を扱われます。7 日間の 37 ° C および 5% の CO2でプレートを孵化させなさい。プレートに 3 または 4 日に分化培地の追加 30 mL を追加します。
    マクロファージは収穫をデタッチして困難になります、メモ: 処理組織培養プレートを使用しないように重要です。
  2. マクロファージを収集、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でプレートを洗浄し、冷 PBS + 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 20 mL を追加します。セルを介して PBS + EDTA をピペッティングにより細胞 10 分収穫のための 4 ° C でプレートをインキュベートし、10 mL の PBS を洗浄します。2 つの 15 mL の円錐管に両方の洗浄を組み合わせます。
  3. 10 分の 300 x g で細胞を遠心し、フェノールレッド無料 DMEM 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L グルタミン + 0.05 mM 2-メルカプトエタノール + 5 %10 mL の細胞を再懸濁します FBS (DMEM-5) 診断またはコールター カウンターを使用してセルをカウントします。カウントの間に氷の上細胞を保ちます。
  4. 2 x 10 の5セル/mL でコーティングされた組織培養プレートにマクロファージをシードします。顕微鏡実験 coverslips 24 ウェル プレートでのセルの 1 つの mL の種子します。LDH リリース試金の 96 ウェル プレートで細胞の 100 μ L をシードします。LDH 試金のため (3 井戸未処理、100% 溶解コントロールと 3 井戸・ 3 の井戸の実験的刺激) 9 井戸をシードします。
  5. セルを特定する 300 × g で 5 分間遠心分離機、96 well プレートは井戸に均等に分散されます。
  6. プライマー処理を開始する前に、37 ° C + 5% CO2で一晩プレートを孵化させなさい。

3. プライミング

  1. 100 ng/mL の LPS (ウェル プレート 24 500 μ L または 50 μ L、96 ウェル プレート) を含む新鮮な培地 (DMEM-5) でメディアを交換してください。
    注: さまざまな LP は、TLR4 を介したプライミング19を刺激する能力に影響を与える構造変化があります。サルモネラ ミネソタR595 から LPS (Re) 複数のベンダーから入手可能ですし、お勧めします。
  2. 37 ° C、5% CO2で 3 時間プレートを孵化させなさい。

4. 活性化 Nigericin と炎症: NLRP3 インフラマソームと FAM YVAD FMK とラベリング

  1. メディアを取り外してを 5 μ M の nigericin と 5 mM グリシンを含む DMEM 5 290 μ l。グリシンは、カスパーゼ 1 の活性化5中に発生したセル換散の量を減らすに追加されます。37 ° C と 5% CO2で 60 分間インキュベートします。野生型およびカスパーゼ 1 欠損マクロファージを使用して、観測のラベリングがカスパーゼ 1 のために特定であることを確認します。
  2. 最後の 45 分の間に 30 の 10 μ L を追加 x FAM-YVAD-FMK、製造元の指示に従って準備します。
  3. 60 分後にメディアを取り外して洗浄 3 回 5 分間各 1 ml 冷 PBS のセル。
  4. 各ウェルに 2% パラホルムアルデヒドの 250 μ L を追加し、30 分用アルミ箔で覆われた氷の上を孵化させなさい。
  5. 最後の 5 分間核のラベルに 0.2 mM 遠赤色蛍光核酸染色の 4 μ L を追加します。4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) または他の染料は、DNA のラベルにも使用できます。
  6. 3 回で 1 mL の冷 PBS セルを洗浄し、7 μ L 耐フェード マウント媒体を用いた顕微鏡スライド上に coverslips をマウントします。マニキュアを使用して顕微鏡のスライドに coverslip を密閉する前に一晩を強化するメディアをマウントをしましょう。
  7. 共焦点顕微鏡によるマクロファージをイメージします。Ex/ファム YVAD FMK の Em は 492/520 nm と 642/661 遠赤色蛍光核酸染色のため。未処理細胞は 488 チャネルで染色、色の背景を表示しないように顕微鏡を設定することを確認します。それ以外の場合、背景 FAM YVAD FMK の汚損は検出された、実際にはアクティブなカスパーゼ-1 になります。
    注: 顕微鏡のセットアップは、セクション 6 で説明します。

5. 抗体の汚損

注: ASC を検出する抗体と細胞をラベル付け、種子、プライム、nigericin 前のセクションと同じセルを公開します。処理後のとおりです。

  1. 3 回 5 分間各 1 ml 冷 PBS のセルを洗浄します。固定・透過ソリューションの 250 μ L を追加します。氷の上細胞をインキュベートし、30 分間覆われて。
  2. 3 回 5 分間各 1 ml 洗浄バッファーのマクロファージを洗います。
  3. 250 μ L ASC に対して一次抗体の希釈洗浄バッファーの 1: 500 を追加し、氷の上で 1 時間インキュベートします。任意の一次抗体を受け取りませんが、セカンダリは、のみを 1 つの coverslip が含まれます。この coverslip の正しいオフセットを設定するのには顕微鏡のセットアップ中に使用されます。
  4. 3 回 1 mL 洗浄バッファーで各 5 分のセルを洗浄します。
  5. 二次抗体 (蛍光色素共役ヤギ-反-マウス) の 250 μ L 洗浄バッファーのレバレッジを希釈し、氷の上で 1 時間インキュベートを追加します。ラベル核にこの培養の最後の 5 分に 0.2 mM 遠赤色蛍光核酸染色の 4 μ L を追加します。
  6. 3 セルを洗浄して 1 ml の冷たい洗浄バッファーとマウントの顕微鏡に coverslips スライド 7 μ L 耐フェード マウント媒体を使用して x。クリアのマニキュアを使用して顕微鏡のスライドに coverslip を密閉する前に一晩を強化するメディアをマウントをしましょう。
  7. 共焦点顕微鏡による画像のマクロファージ。Ex/二次抗体の Em は 555/580 nm と 642/661 遠赤色蛍光核酸染色 (とおり)。
    注: FAM YVAD FMK 抗体の分類とラベリングは、アクティブなカスパーゼ 1 と ASC の共同のローカリゼーションを表示する結合できます。このため、FAM YVAD FMK のラベリングのための条件に従う、抗体の分類のプロトコル、さらに処理を切り替えます。

6. 共焦点顕微鏡によるラベルの大食細胞のイメージング

注: coverslips が一晩硬化しマニキュアと顕微鏡のスライドに封印されている許可されている後は、ステンド グラスのセルを表示できます。ここでは、共焦点顕微鏡を用いたイメージングを説明します。標準的な蛍光顕微鏡による細胞を表示もできます。

  1. 顕微鏡ステージ上対照細胞とスライドを置き、細胞の顕微鏡の焦点します。
  2. 未処理の細胞染色陽性 FAM YVAD FMK がない設定、顕微鏡見てをテーブル (LUT) を使用してオフセットを調整します。このプロセスは、カスパーゼ 1 欠損マクロファージを使用しても実行できます。
    注: オフセットが実験では、使用するチャネルごとに調整することが、正しいオフセットを設定は FAM YVAD FMK チャネルと蛍光抗体チャネルの最も重要です。DNA チャネルのオフセットは重要度が低いです。オフセットを設定すると、実験の残りの部分でこの設定を調整しません。
  3. 扱われる nigericin サンプルにスライドを切り替えます。FAM YVAD FMK の汚損のため正負両方のセルが含まれているフィールドを探します。染色陽性の最高の強度のある面に FAM YVAD FMK チャネルの画像面を調整します。これは通常インフラマソーム フォーカスの中心が撮像面になります。
  4. ゲインを調整して、巣、凝縮核を持つセルに表示されます。利得とオフセットの両方を設定した後撮像セッションの残りの部分はこれらの設定をまま。
    注: セルが pyroptotic を判断する簡単な方法の 1 つは、核形態を見てです。アクティブなカスパーゼ 1 の細胞が丸く、凝縮核、核小体、細胞核の形態とカスパーゼ 1 の活性化なしに表示されます、未処理の細胞のそれらに類似。
  5. 総合倍率 X 100 で 5 のランダムに選択されたフィールドの画像を収集します。これは通常イメージごとの約 40 のセルになります。サンプルごとにこのプロセスを繰り返します。
  6. 画像解析ソフトウェアを使用して各画像のセルの数をカウントします。FAM YVAD FMK 染色陽性をいるセルの数をカウントします。FAM YVAD FMK 陽性細胞の割合とカスパーゼ 1 の活性化のレベルを表します。

7. LDH リリース試金

注: LDH リリース試金のため種子とセル前のセクションで説明した以外の素数を使用して 96 well プレート。プライミング後メディアを取り外さないでください。

  1. 実験の井戸に 10 μ M nigericin と 50 μ L を含む DMEM 5 の 50 μ L を追加自然と 100% 溶解制御井戸に DMEM 5。目標セル換散を測定することですので、この実験ではグリシンを追加しないでください。37 ° C と 5% CO2で 60 分間インキュベートします。
  2. 30 分後に 100% 溶解制御井戸に 10 x 換散バッファーの 10 μ L を追加し、他の井戸に DMEM 5 の 10 μ L を追加します。この潜伏中に冷凍庫から基板ミックス (凍結乾燥した基板の 1.5 mL) の 1 バイアル、アッセイバッファー (〜 12 mL) の 1 の約数を削除し、聞かせ融解は部屋の温度を光から保護されました。
    注: 基板のミックスには、赤い塩製品に変換されるテトラゾリウム塩 (iodonitro-テトラゾリウム バイオレット) が含まれています。
  3. 60 分合計孵化後 10 ° C で 500 × g で 5 分間プレートを遠心分離します。上澄みの 50 μ L をクリア フラット底板に転送します。この時間の間に基板ミックスのバイアルにアッセイバッファーの 12 の mL を追加し、使用する前に 5 分間室温でインキュベートします。
  4. 各ウェルに基板の 50 μ L を追加し、暗闇の中で 30 分間インキュベートします。空白値の中の唯一井戸があります。信号はプレート リーダーの検出限界を超えないことを確認する 15 分後プレートを確認してください。
  5. 30 分後停止液 (1 M 酢酸) を 50 μ L を追加し、OD490プレート リーダーを使用して測定します。
  6. 次の数式を使用してセル換散の割合を計算します。
    細胞毒性評価 % = ((Experimental-Spontaneous)/(最大-自発的な)) × 100
    実験: nigericin 扱われる細胞;自然: 未処理の細胞;最大: 細胞の換散バッファー

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結果

Nigericin への露出に続くカスパーゼ 1 の活性化を検出するには、セルはプロトコル」に記載されて処理されました。我々 は、FAM YVAD FMK と ASC 抗体の分類、ASC とアクティブなカスパーゼ-1 共同ローカライズを介した炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化、次を表示するために組み合わせます。図 1 aは 5 μ M nigericin 野生型マクロファージによる核地域の ASC フォーカス形成を示しています。FAM YVAD FMK で ASC の共局在で見られるように、これらの巣はアクティブなカスパーゼ 1 も含まれています。アクティブなカスパーゼ 1 の肯定的な細胞があるこれらの細胞は、pyroptosis を受けていることを示す核凝縮。図 1 bは、カスパーゼ-1/11 欠損マウスのマクロファージは、ASC フォーカス形成を必要は、FAM YVAD FMK 染色の有無によって示すように、このフォーカスに関連付けられている...

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ディスカッション

本稿では、我々 はインフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージの炎症: NLRP3 刺激カスパーゼ 1 の活性化の結果を確認する 2 つの手法を提案しました。最初のテクニックでは、蛍光レポーター FAM YVAD FMK を使用して携帯電話にカスパーゼ 1 の活性化のレベルを決定する研究者をことができます。この記者は、カスパーゼ-1/11 欠損マクロファージの染色の有無によって見られる酵素、カスパーゼ 1 家族をバインディングに非常に特有です。特異性は、ラロックらによって示されました。原稿のカスパーゼ 1 の活性化でエルシニア蛋白質 YopM の役割を記述します。自分の原稿で FAM YVAD FMK 巣がカスパーゼ 117に対して指示される抗体で標識した巣と重なることが表示されます。

すべての実験と同様に、偽陽性の結果を排除するために従う必要があるいくつかの重要なステップがあります。まず、野生型およびカスパーゼ-1/11 欠損マクロファージを使用することが不可欠です。これらの 2 つの細胞...

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開示事項

著者がある利益相反を開示するには

謝辞

すべての顕微鏡は、w. m. ケック顕微鏡センター ナサニエル ・ ピーターズのサポートと NIH 賞 S10OD016240 のサポートで行われました。S.L.F. をサポートするには、NIH の K08AI119142 と R21AI130281。博士リチャード Flavell とカスパーゼ-1/11 欠損マウスの博士ブラッド Cookson と博士ブラッド Cookson 研究室設備・機器を共有するために感謝します

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
E-MEMATCC30-2003L929細胞の増殖用
NCRC clone 929 (L929)ATCCCCL-1
固定/透過化キットBD Biosciences554714固定液と透過化溶液、洗浄バッファーが含まれています。独自の処方。4.2% ホルムアルデヒド
GlycineBiorad161-0718
Cytotox96 非放射性細胞毒性アッセイFisher ScientificPR-G1780Substrate Mix and Assay Buffer;独自の処方。停止溶液は、1 M 酢酸
FAM-YVAD-FMKImmunocytochemistry Technologies98
DMEM、高グルコース、グルタミン不使用Invitrogen11960044
DMEM、高グルコース、グルタミン不使用、フェノールレッドInvitrogen31053028
ダルベッコ PBS、カルシウム不使用、マグネシウムInvitrogen14190144
Fetal Bovine Serum、認定済み、米国原産Invitrogen26140079Heat は 55°C で不活性化。C 50分間
GentamicinInvitrogen15750060
ProLong Gold Mounting MediumInvitrogenp36934独自の製剤。硬化用封入剤。1.46
ヤギ抗マウス ALEXA555InvitrogenA-21422
HEPES (Ultra Pure)Invitrogen11344041
L-GlutamineInvitrogen21051024
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
TO-PRO-3 IodideInvitrogenT3605近赤紫外蛍光核酸のstain
C57BL/6JのマウスのジャクソンのLaboratoy000664
のカスパーゼ-1/11-/-マウスのジャクソンの実験室016621
Leica SP8Xの共焦点の顕微鏡Salmonella
Ultrapure LPS (再)リストBiologicals434
anti-ASCのクローン2EI-7Millipore-Sigma04-417
β-メルカプト-エタノールミリポア-シグマM6250-10ML
DMSOミリポア-シグマD2650-5X10ML
EDTAミリポア-シグマE5391
Spectramax M3 プレートリーダー分子デバイス5000414
を含む 不使用 のミネソタR595からのライカの

参考文献

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