アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3 脳剤について述べる。それぞれの準備を独自の特定の利点は、神経回路機能を研究するモデルとしてアフリカツメガエルのオタマジャクシの実験的少ないに貢献します。
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この記事について
サマリー
要約
アフリカツメガエル幼生発達回路、形成するシナプスの視蓋ニューロンに直接眼での網膜神経節細胞 (Rgc) の構成がどのように神経回路を研究する人気モデル自己組み立てます。全体を遂行する能力パッチ クランプ録音どちらか体内の RGC 誘発の応答を記録しての視蓋ニューロンからの細胞または通常の基になるメカニズムについて高解像度データの大きいボディを生成している全脳製剤を用いた、・異常、回路形成、機能。ここで体内の準備、元全脳の準備を実行する方法について説明より最近の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を求める水平脳スライス標本を開発しました。それぞれの準備には、ユニークな実験的利点があります。生体内で準備できますの視蓋ニューロンの目に投影される視覚刺激への直接反応の記録です。脳全体の準備は、高度に制御された方法でアクティブにする RGC 軸索と水平脳スライス標本蓋のすべてのレイヤーにわたってからの録音が可能します。
概要
発達回路は、両生類の視覚系の主要なコンポーネントです。それは、どのプロジェクトの視蓋ニューロンにシナプスとシナプス結合を形成するための軸索の目、Rgc ので構成されます。アフリカツメガエル幼生発達回路は、神経回路形成と機能を研究する人気発達モデルです。強力な実験的モデル1,2,3レンダリングこの幼生の発達回路の多くの属性があります。1 つの主要な属性と、この資料の焦点はからの視蓋ニューロンの生体内や脳全体準備を使用してセル全体パッチ クランプ録音を遂行する能力。電圧と電流クランプの記録モードをサポートしているアンプが備わっています電気生理学リグ、セル全体パッチ クランプ録音が高解像度で特徴付けられるニューロンの電気生理学できます。その結果、発達回路形成の主要な段階間の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音が開発の詳細かつ包括的理解と本質的な4、5の可塑性を提供しています。,6,7とシナプス8,....
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プロトコル
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ワイオミング大学のによって承認されています。電気生理学的記録を含めたすべての処理は、部屋の温度、およそ 23 ° c. で実施されてここで説明したすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンを記録するために最適化されています。
1体内の準備。
- タドポールを麻酔します。
- 0.01% スタインバーグのソリューションを含む小さなシャーレにタドポール MS-222 約 5 分。
注: MS-222 別名"Tricaine"は一般的な魚と両生類の麻酔です。オタマジャクシは mM でスタインバーグのソリューションで発生します: 0.067 倍 4.9 HEPES 5.8 NaCl、KCl、0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O。 - タドポールは手順 2 に進む前に、深くハイパーカプニア (応答がない、もはや水泳) を確認します。
- 0.01% スタインバーグのソリューションを含む小さなシャーレにタドポール MS-222 約 5 分。
- 解剖記録/料理の床に冠水したシリコーン ブロック麻酔下のオタマジャクシを保護しま....
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結果
光誘発電位を記録するには、光のフィールド全体のフラッシュは、個々 の視蓋ニューロン (図 4A) から結果の応答を記録しながら網膜上に投影されます。この特定のプロトコルは両方 (「オン」の応答) をオン、オフに 15 光にニューロンの応答を測定するように設計「オフ応答」を測定するために後で s視蓋ニューロンは通常応答の内外で堅牢な展示 (示されているここに記録された電圧クランプ モード、ニューロンはシナプス電流 (図 4B) を測定するために - 60mV クランプ)。自発的なシナプス イベント (図 4C) を記録することによって任意の一つのニューロンによって受信されたシナプスのドライブ量を定量化することができます。電流-電圧特性 (I-v カーブ) を同じニューロンからニューロンをますます脱.......
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ディスカッション
この作品に記載されているすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンの記録に最適です。ステージ 42、オタマジャクシが十分に大きく、十分に発達した昆虫ピンは生体内での録音のため、全脳解剖を遂行するための脳の両側に置くことができるようにします。以前の段階、オタマジャクシが本質的に二次元で (すなわち、フラット)、ここで説明したアプローチが最適ではないです。
視蓋ニューロンをアクセスしてセル全体構成に記録できる、使いやすさのため19を形成しながら、このモデルの回路が機能している - と機能中どのように神経回路形態について基本的な発見の温床しました。ここで、生体内でおたまじゃくし全脳の準備、別の記録の構成とデータの種類の例を実行する方法などの視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を取得する方法を説明しました。さて、強みのディスカッション ・高.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
NIH グラント SBC COBRE 1P20GM121310-01 によってサポートされています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ステミステレオ508 | ツァイス | 495009-0006-000 | 解剖顕微鏡 |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | 両生類全身麻酔薬 |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | フィッシャーサイエンティフィ | S271-3 | スティエンバーグ液と外液の調製に使用 |
| 塩化カリウム(KCl) | フィッシャーサイエンティフィ | P217-500 | シュティンバーグ液と外液の調製に使用 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | シュティンベルク溶液と外部溶液の調製に使用されます |
| 硝酸カルシウム四ヒレート(Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Stienbergの溶液を調製するために使用されます |
| 硫酸マグネシウム(MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | スタインバーグ溶液の調製に使用 |
| 塩化カルシウム(CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | 外部記録溶液の調製に使用 |
| 塩化マグネシウム(MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | 外部記録溶液の調製に使用 |
| D-グルコース無水 | Mallinckrodtの化学薬品 | 6066-04 | 外部記録の解決 |
| Tubocurarine塩酸塩pentahydrate | ΣT2379 | ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬 | |
| の昆虫ピン | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mmの直径のステンレス鋼ピン |
| Sylgard 184シリコーンエラストマーキット | ダウのコーニング | 761028 | 予め秤量されたモノマーおよび硬化剤のキット |
| 滅菌ポリスチレンのペトリ皿 - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | 小さいペトリ皿 |
| PrecisionGlideの針 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | シリンジの針 |
| 1mL スリップ チップ ツベルクリンのシリンジ | BD | 309659 | 使い捨て、滅菌シリンジ |
| ホウケイ酸ピペットガラス | サッター機器 | BF150-86-10HP | ピペット引き機を使用して希望の仕様に引っ張る |
| フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー | サッター機器 | P-97 | 電気生理学記録用のマイクロピペットを製造 |
| キムワイプ キムテックワイプ | キンバリークラーク | 34120 | デリケートタスクリントフリーワイパー |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | 電流クランプと電圧クランプ ヘッドステージ |
| MP-285 卓上コントローラ付き電動マニピュレータ | Sutter Instrument | MP-285/T | 電気生理学リグのヘッドステージの制御 |
| ファイバー結合LED (緑) | Thorlabs | M530F2 | 緑色LEDとペアになった光ファイバーケーブル |
| クラスターバイポーラ電極(25µm直径) | FHC | 30207 | バイポーラ刺激電極 |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (イスラエル) | メーカーにお問い合わせください | フレキシブルスティミュラスアイソレーター |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | 電圧および電流クランプ記録用アンプ |
| Digidata 1322A デジタイザ | Molecular Devices | 2500-135 | 電気生理学記録用データ収集システム |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | 電気生理学用顕微鏡 |
| Micro-g ラボテーブル | TMC | 63-533 | 電気生理顕微鏡用エアテーブル |
| Inspiron 620 Windows 7 64ビット | Dell | D06D001 | 電気生理学ソフトウェアを実行しているコンピュータ |
| c2400 CCDカメラ | 浜松 | 70826-5 | 電気生理学イメージング用電荷結合デバイスカメラ |
| 7時 スーパープラチナ ステンレスカミソリ刃 | ジレット | CMM01049 | プラチナコーティングされたステンレス製カミソリの刃トランスファー |
| ピペットフィ | ッシャーサイエンティフィ | 13-711-7M | 使い捨てポリエチレントランスファーピペット |
参考文献
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu....
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