方法論記事

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

DOI：

10.3791/57465

⸱

2018年3月15日

 ,  , 
1Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

この記事について

サマリー

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アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3 脳剤について述べる。それぞれの準備を独自の特定の利点は、神経回路機能を研究するモデルとしてアフリカツメガエルのオタマジャクシの実験的少ないに貢献します。

要約

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アフリカツメガエル幼生発達回路、形成するシナプスの視蓋ニューロンに直接眼での網膜神経節細胞 (Rgc) の構成がどのように神経回路を研究する人気モデル自己組み立てます。全体を遂行する能力パッチ クランプ録音どちらか体内の RGC 誘発の応答を記録しての視蓋ニューロンからの細胞または通常の基になるメカニズムについて高解像度データの大きいボディを生成している全脳製剤を用いた、・異常、回路形成、機能。ここで体内の準備、元全脳の準備を実行する方法について説明より最近の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を求める水平脳スライス標本を開発しました。それぞれの準備には、ユニークな実験的利点があります。生体内で準備できますの視蓋ニューロンの目に投影される視覚刺激への直接反応の記録です。脳全体の準備は、高度に制御された方法でアクティブにする RGC 軸索と水平脳スライス標本蓋のすべてのレイヤーにわたってからの録音が可能します。

概要

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発達回路は、両生類の視覚系の主要なコンポーネントです。それは、どのプロジェクトの視蓋ニューロンにシナプスとシナプス結合を形成するための軸索の目、Rgc ので構成されます。アフリカツメガエル幼生発達回路は、神経回路形成と機能を研究する人気発達モデルです。強力な実験的モデル1,2,3レンダリングこの幼生の発達回路の多くの属性があります。1 つの主要な属性と、この資料の焦点はからの視蓋ニューロンの生体内や脳全体準備を使用してセル全体パッチ クランプ録音を遂行する能力。電圧と電流クランプの記録モードをサポートしているアンプが備わっています電気生理学リグ、セル全体パッチ クランプ録音が高解像度で特徴付けられるニューロンの電気生理学できます。その結果、発達回路形成の主要な段階間の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音が開発の詳細かつ包括的理解と本質的な4、5の可塑性を提供しています。,6,7とシナプス8,9,10,11プロパティ。セル全体パッチ クランプ蓋ニューロン録音を組み合わせ、遺伝子またはこれらのニューロンの12、および確立された視覚的回避テスト13を介して視覚的なガイド付き動作を評価する方法への関心の morpholinos を表現する能力を促進する、分子、回路機能と行動間のリンクの id。

セル全体パッチ クランプ録音から得られるデータは不可能遺伝的カルシウム インジケーター、GCaMP6 など新しいイメージング手法を用いた高解像度型カルシウム指示薬を使用することが許可されていますイメージングが重要です。カルシウムのニューロンの大規模な集団全体のダイナミクス、同時には直接またはある明白な方法は、いつつ、デルタの蛍光を測定することにより特定の電気パラメーターを取得でき、電圧に逃げ道はないクランプ測定するニューロン電流-電圧特性。明らかにこれらの 2 つの異なるアプローチ、電気生理学的記録、カルシウム イメージング、非重複の強みを持っている、異なる種類のデータを生成します。したがって、最善の方法は、対処されて特定の実験の質問に依存します。

ここでは、脳全体準備、生体内で製剤を用いたオタマジャクシの視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を獲得する手法について述べるし、新しい変更14 研究室で開発された脳全体準備.代表結果] セクションで、各準備と得ることができるデータの種類の実験の利点を示します。制限と異なる準備として、トラブルシューティングのためのヒントの強みは、ディスカッション セクションに含まれます。

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プロトコル

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ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ワイオミング大学のによって承認されています。電気生理学的記録を含めたすべての処理は、部屋の温度、およそ 23 ° c. で実施されてここで説明したすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンを記録するために最適化されています。

1体内の準備。

  1. タドポールを麻酔します。
    1. 0.01% スタインバーグのソリューションを含む小さなシャーレにタドポール MS-222 約 5 分。
      注: MS-222 別名"Tricaine"は一般的な魚と両生類の麻酔です。オタマジャクシは mM でスタインバーグのソリューションで発生します: 0.067 倍 4.9 HEPES 5.8 NaCl、KCl、0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O。
    2. タドポールは手順 2 に進む前に、深くハイパーカプニア (応答がない、もはや水泳) を確認します。
  2. 解剖記録/料理の床に冠水したシリコーン ブロック麻酔下のオタマジャクシを保護します。
    1. 使い捨て可能な移動のピペットを使用して外部録音ソリューションを含んでいる解剖/記録皿にハイパーカプニアのオタマジャクシを移動 (115 mM nacl、KCl の 2 mM CaCl2の 3 mM、MgCl2の 3 mM、5 mM HEPES、ブドウ糖; の 1 mM の pH 調整 7.25 を使用するには10 N naoh、浸透圧 255 mOsm)。
      1. 自発的な筋肉を最小限に抑えるためのけいれん、アセチルコリン受容体拮抗薬、ツボクラリン (100 μ M) 外部のソリューションに追加します。(通常、これは、外部溶液 10 mL に 10 mM ツボクラリン株式の 100 μ L を追加する 200 μ L ピペットを使用して)。
    2. おたまじゃくし、背側、シリコーン ・ エラストマーの湛水ブロックに固定昆虫ピンを使用する (Sylgard 184 など詳細については表を参照してください、) を解剖皿床に接着されています。
      注意: ピンの配置は重要です: 目からそのプロジェクト脳、RGC の求心性軸索を刺しを避けるために十分に尾の両側にそれらを配置し、ちょうど前方視蓋 (図 1A) 脳を入力してください。
  3. 牛フィレ肉の正中線に沿って脳。
    1. 脳のクリアな視界、滅菌 25 G 針を使用して正中線に沿って表面的な切開することによって脳を覆う皮膚を削除します。
    2. 神経管に針を挿入して (背側) チューブの背の部分 (切断) の床の板がそのまま (図 1B) を残しながらカットがきれいにそのような物を引いてそっと上向きに同じ正中線軸に沿って脳を切り身。
      注: 求心性感覚フロア プレートを介して蓋を入力するので、神経管の底板がそのまま残ってことが重要です。
  4. 蓋ニューロンを覆う透明な心室膜を削除します。
    1. 電気生理学のリグに記録皿を移動し、壊れたガラスのピペット チップを使用して蓋ニューロンの細胞体を覆う心室膜を削除します。軽く繊細なタスク ワイパーの間でドラッグすることで先端を破る。
    2. ピペット ホルダーにピペットをネジし、マニピュレーターを介して視蓋にそれを下げます。
    3. 壊れたピペットを使用して、蓋から心室膜を剥離します。
      注: 全体の蓋; から膜を削除する必要はありません。小さなウィンドウは十分で、ニューロンの多くへのアクセスを提供します。
  5. パッチ ・ クランプ記録セル全体を取得します。
    注意: このポイント前方からのアプローチ Segevらに従ってマウス脳切片からセル全体パッチ クランプ録音実施と同様です。16(図 1C)。
  6. 蓋ニューロン全体フィールド フラッシュ光を網膜上に投影のレスポンスを記録します。
    1. 網膜上に光のフィールド全体のフラッシュに、幼生の目に隣接する光ファイバーを配置します。光ファイバーのもう一方の端を制御できる光の輝度は、可変抵抗器に沿った LED です。アンプのデジタル出力で LED をトリガーします。この方法では、光の強度変化の点滅がすることができます全体のフィールドは、(図 4A) を記録しました。

2. 全脳の準備

  1. 1.1 から 1.3 の手順に従います。
    注: この準備のための外部のソリューションでツボクラリンの必要はありません。
  2. 脳を分離します。
    1. 後脳 (図 2A) を断つに 25 G 針を使用します。
    2. タドポールから全脳を分離、そっと尾側吻側方向すべての側面と腹側の結合組織と神経線維を断つことで、脳の下に針を実行します。
  3. シリコーン ・ エラストマーのブロックには、脳を保護します。
    1. 一度完全に解放された, 嗅球のいずれかを 1 つピンと後脳 (図 2B) を別のピンを配置することによってシリコーン ・ エラストマーのブロックには、脳を保護します。これの視蓋ニューロンから記録に最適な構成です。
  4. 電気生理学のリグに切り裂くスコープから固定された全脳の準備を含んでいる皿を移動します。1.4 の手順で説明するように壊れたガラス ピペットを使用して心室膜を削除します。
  5. 双極刺激電極に配置視交叉 (中脳でそれぞれの眼から軸索路断面どこ) RGC 軸索を直接アクティブにします。
    1. 吻側、および大きい中間心室にほぼ隣接する双極刺激電極を配置します。視交叉は大きい中間室 (図 2B) にすぐに吻側に位置しています。
      1. 優しく下の刺激電極視交叉の上に小さなへこみが組織で形成されるように。バイポーラの電極は、正確に制御するために刺激の強度を可能にするパルス刺激によって駆動されます。
  6. Segev et al.による記述で全細胞パッチク ランプ記録 (図 2C) を実行します。16

3. 水平脳スライス標本

  1. 2.1 から 2.3 の手順に従います。
  2. 消費税 1 つこまの 1 つの側面の最も外側 4 番目 (どの生体内で最も背側の 4 番目に対応) にかみそりの刃を使用します。図 3Aに示すように吻側尾側平面に平行に作られるこのカット。
  3. 再、スライスとシリコーン ・ エラストマーの側に脳をピン側 (つまり、突起や神経は、記録のため直接アクセスできます) 上向きとシリコーンのエラストマー ブロック (図 3 から離れて直面して脳の心室の表面B) (つまり、バイポーラ電極は、視交叉に配置できます)。
  4. Segev et al.による記述で全細胞パッチク ランプまたはローカルの下に潜在的な記録 (図 3C) を実行します。16

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結果

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光誘発電位を記録するには、光のフィールド全体のフラッシュは、個々 の視蓋ニューロン (図 4A) から結果の応答を記録しながら網膜上に投影されます。この特定のプロトコルは両方 (「オン」の応答) をオン、オフに 15 光にニューロンの応答を測定するように設計「オフ応答」を測定するために後で s視蓋ニューロンは通常応答の内外で堅牢な展示 (示されているここに記録された電圧クランプ モード、ニューロンはシナプス電流 (図 4B) を測定するために - 60mV クランプ)。自発的なシナプス イベント (図 4C) を記録することによって任意の一つのニューロンによって受信されたシナプスのドライブ量を定量化することができます。電流-電圧特性 (I-v カーブ) を同じニューロンからニューロンをますます脱...

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ディスカッション

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この作品に記載されているすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンの記録に最適です。ステージ 42、オタマジャクシが十分に大きく、十分に発達した昆虫ピンは生体内での録音のため、全脳解剖を遂行するための脳の両側に置くことができるようにします。以前の段階、オタマジャクシが本質的に二次元で (すなわち、フラット)、ここで説明したアプローチが最適ではないです。

視蓋ニューロンをアクセスしてセル全体構成に記録できる、使いやすさのため19を形成しながら、このモデルの回路が機能している - と機能中どのように神経回路形態について基本的な発見の温床しました。ここで、生体内でおたまじゃくし全脳の準備、別の記録の構成とデータの種類の例を実行する方法などの視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を取得する方法を説明しました。さて、強みのディスカッション ・高...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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NIH グラント SBC COBRE 1P20GM121310-01 によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ステミステレオ508ツァイス495009-0006-000 解剖顕微鏡
MS-222 "Tricane"FinquelARF5G両生類全身麻酔薬
塩化ナトリウム(NaCl)フィッシャーサイエンティフィS271-3スティエンバーグ液と外液の調製に使用
塩化カリウム(KCl)フィッシャーサイエンティフィP217-500シュティンバーグ液と外液の調製に使用
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGシュティンベルク溶液と外部溶液の調製に使用されます
硝酸カルシウム四ヒレート(Ca(NO3)•4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GStienbergの溶液を調製するために使用されます  
硫酸マグネシウム(MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04スタインバーグ溶液の調製に使用
塩化カルシウム(CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500G外部記録溶液の調製に使用
塩化マグネシウム(MgCl2)J.T. Baker2444-01外部記録溶液の調製に使用
D-グルコース無水Mallinckrodtの化学薬品6066-04外部記録の解決
Tubocurarine塩酸塩pentahydrateΣT2379ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬
の昆虫ピンFine Science Tools26002-100.1mmの直径のステンレス鋼ピン
Sylgard 184シリコーンエラストマーキットダウのコーニング761028予め秤量されたモノマーおよび硬化剤のキット
滅菌ポリスチレンのペトリ皿 - 60x15mmFisher ScientificAS4052小さいペトリ皿
PrecisionGlideの針 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)BD305122シリンジの針
1mL スリップ チップ ツベルクリンのシリンジ BD309659使い捨て、滅菌シリンジ
ホウケイ酸ピペットガラスサッター機器BF150-86-10HPピペット引き機を使用して希望の仕様に引っ張る
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラーサッター機器P-97電気生理学記録用のマイクロピペットを製造
キムワイプ キムテックワイプキンバリークラーク34120デリケートタスクリントフリーワイパー
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7B電流クランプと電圧クランプ ヘッドステージ
MP-285 卓上コントローラ付き電動マニピュレータSutter InstrumentMP-285/T電気生理学リグのヘッドステージの制御
ファイバー結合LED (緑)ThorlabsM530F2緑色LEDとペアになった光ファイバーケーブル
クラスターバイポーラ電極(25µm直径)FHC30207バイポーラ刺激電極
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Axon Instruments 700B Multipatch AmplifierMolecular Devices2500-0157電圧および電流クランプ記録用アンプ 
Digidata 1322A デジタイザMolecular Devices2500-135電気生理学記録用データ収集システム
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 電気生理学用顕微鏡
Micro-g ラボテーブルTMC63-533電気生理顕微鏡用エアテーブル
Inspiron 620 Windows 7 64ビットDellD06D001電気生理学ソフトウェアを実行しているコンピュータ
c2400 CCDカメラ浜松70826-5電気生理学イメージング用電荷結合デバイスカメラ
7時 スーパープラチナ ステンレスカミソリ刃ジレットCMM01049プラチナコーティングされたステンレス製カミソリの刃トランスファー
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ック ック ック

参考文献

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