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方法論記事

エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー

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DOI：

10.3791/57467

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2018年4月13日

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1Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 2Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame

この記事について

サマリー

ここでは、プラズマと非 exosomal 血蛋白質の減らされた共同浄化と血清の両方からエクソソームを浄化するためのプロトコルを提案する.最適化されたプロトコルには、限外ろ過には、プロテアーゼ処理, サイズ排除クロマトグラフィーが含まれます。小胞とプロテオーム解析のより正確な定量化を含むエクソソーム利点下流解析の強化された浄化。

要約

エクソソーム、nanovesicle すべての細胞型からリリースの種類は、任意の体液から分離できます。などのタンパク質と Rna、エクソソームの内容は、そこから派生し、病の指標として使用することができます細胞に固有です。遠心を含む、いくつかの一般的な濃縮プロトコルは、可溶性蛋白質の汚染物を積んだエクソソームを得られます。具体的には、我々 を発見した血液内の最も豊富な蛋白質はしばしば共同エクソソームの浄化し、下流プロテオーム研究を混同することができます低豊富なバイオ マーカー候補の同定を阻止します。更なる懸念エキソソーム タンパク質定量非 exosomal タンパク質レベルの矛盾した表現のための irreproducibility です。エキソソーム精製プロセスに厳しさを追加するエクソソームと共に共同浄化非 exosomal 蛋白質を削除するここで詳細なプロトコルが開発されました。5 つのメソッドは、ペアの血血しょうおよび 5 つのドナーからの血清を使用して比較しました。トラッキング解析とマイクロ ビシンコニン酸蛋白質の試金ナノ粒子を用いた解析では、限外ろ過とサイズ排除クロマトグラフィーを利用した複合的なプロトコルが最適な小胞の濃縮と可溶性タンパク質を除去をもたらしたことを明らかにしました。西部にしみが付くことは、予想される豊富な血蛋白質、アルブミンやアポ蛋白などが枯渇したことを確認する使用されました。

概要

エクソソームは nanovesicles (30 サイズに至るまで 150 nm nm) 細胞間コミュニケーションを促進する1,2を処理する人間の体のほぼすべてのセルが発表しました。興味深いことに、エクソソームの組成は、起源の細胞だけでなく、個々 の3,4、5の状態に応じて変更します。また、エクソソームから取得できるいくつかの生物学的流体など: 唾液、尿、血2。これらの機能によりエクソソームは病のバイオ マーカーの良い情報源と見なされます。残念ながら、エクソソームの隔離のための標準的な方法はありません。いくつかの研究所では、多段遠心、エキソソーム分離法のゴールド スタンダードとしての密度勾配を使用して 100,000 × g で最後の高速ステップを検討してください。しかし、最近の研究はその遠心水溶性タンパク質とエクソソームとエキソソーム整合性、どちらが下位アプリケーション6,7 を妨げる可能性がありますに影響を与えるだけでなく、他のエクソソームの凝集を誘導する示されています。.エキソソーム分離の他の一般的な方法に限定されない: 商業ポリエチレング リコール (PEG) 沈殿物ベースの試薬、遠心限外濾過法、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)。ポリエチレング リコール (PEG) 高分子を用いた市販の試薬に沈殿し、ペレットを形成させることによりエクソソームを豊か。このポリマーを使用して制限は、残留ペグ ポリマーと最終製品に可溶性の非 exosomal 蛋白質の豊富な汚染です。限外濾過を利用して浄化し、セルロース膜を使用して小胞を集中する遠心分離小さい不純物や他のタンパク質が膜7、8を通過中、エクソソームはフィルター上保持されます。他の方法と同様遠心限外濾過法非 exosomal 蛋白質、タンパク質凝集体などの高レベルの保持のためエクソソームを浄化するために限られた能力があります。最後に、SEC の浄化は、サイズによって分子を分離するのに多孔質樹脂を使用します。SEC は有望な結果を示している汚染タンパク質の大部分をキャプチャして以来、分離のに基づいて重力または低圧システム7、exosomal の整合性を維持する他の方法で直面している問題のほとんどを克服します。 9。ただし、秒の中に大きいタンパク質凝集体とリポタンパク質10の共同分離最終エキソソーム準備の純度に影響します。エキソソーム浄化のみプラズマ9,11やプラズマ7、細胞培養上清からのいくつかのメソッドがテストされている間血を直接比較するメソッドのパフォーマンスに関する情報がないです。プラズマと同じ個人からの血清。

ここでは、様々 な小胞濃縮技術はプラズマと血清の翻訳可能なかどうかを決定するためのワークフローを比較することによって血中エクソソームの浄化に着目します。ナノ粒子追跡分析および西部のしみは、最終製品におけるエキソソーム濃度、純度、およびタンパク質組成の違いを定量化する使用されました。最後のメソッドは、このプロトコルの詳細は小胞の数の増加し、非 exosomal 蛋白質のレベルを減らします。重要なは、一般的な共同沈降蛋白質アルブミンやアポ蛋白などの大幅な削減が示されています。血と、彼ら共同浄化エクソソームと原因矛盾下流解析の傾斜「浄化」のサンプル周波数でこれら 2 つのタンパク質の高い豊富。このプロトコルを含む市販秒樹脂;樹脂多孔質ビーズ 700 kDa より小さい蛋白質がビーズを入力することができますで構成されます。一度中、蛋白質は octylamine リガンドによって保持されます。溶出液はエクソソームと 700 kDa12よりも大きい分子から成る。また、タンパク質凝集体とビーズのトラップを回避するとアポリポタンパクを減らすために、我々 はワークフローのプロテアーゼ消化手順を含めます。現在がない単一の技術共同浄化非 exosomal 蛋白質を削減しながらエキソソーム収量を最大化することができます。本研究を示しますエキソソーム収量および血清および血漿から純度を高めるため複数の回復そして浄化の方法がプロテアーゼ消化前処理を組み合わせた浄化のプロトコルが使えます。

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プロトコル

この作品は、すべてひと試料 Bioreclamation IVT biorepository から逆特定したサンプルとして得られた、最初の検討からコロラド州立大学制度検討委員会 (IRB)、人体実験をするのには決定されました。IRB 承認プロトコルの下で収集されました。

1. 粗試料 (血漿または血清) をペレット化大きい小胞および細胞残骸の準備

注:安全性に関する考察: 血漿、血清、および他の体液汚染物質、基本的な個人用保護具、手袋、白衣などを着用しながら、特別な注意と扱われなければなりません。バイオ セーフティ キャビネット; における生体試料が処理されることを強くお勧めしますそうでない場合は、目の保護の使用を推奨します。

  1. 4 ° C の冷蔵庫で一晩非振動条件下でチューブを配置することによって、血清または血漿サンプルを平衡 (か-20 からまたは-80 ° C での保存)。
  2. 1,000 μ L ピペットを使用して微量遠心チューブにサンプルの分注 250 μ L。
  3. 4 ° C で 30 分間 18,000 × g のサンプルを遠心分離します。
  4. 200 μ L ピペットを使用して、消去した上清 200 μ L を取り外して新しい微量遠心チューブに追加。上清を転送中、ペレット材料を避けてください。ペレット材料を破棄します。
  5. ビシンコニン酸 (BCA) アッセイ、製造元のプロトコルを使用して、サンプルのタンパク質含有量を定量化します。アッセイを実行、サンプル 1:50 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x を希釈します。複製では、各サンプルをテストします。
    注:特に明記しない限りは、プロトコル全体 1x PBS を使用します。平均では、明らかに血清または血漿 (18,000 × g) 後の 200 μ L 総蛋白の 15 mg になります。低い、または高いたんぱく、サンプル以外は、追加の BCA 希釈を必要があります。
  6. 新しい微量遠心チューブにサンプルの分注 10 mg であります。手順 1.5 で得られた濃度を使用して、サンプルの対応するボリュームを計算します。200 μ L ピペットを使用してサンプルの約数。
    注:-80 ° C で残りのサンプルを格納するは、勧め割り切れるように複数凍結融解サイクルを将来的にチューブあたり 10 mg で異なるチューブのサンプルを使用します。

2. 非 exosomal 血液タンパク質の消化

注:消化手順は、共同のエクソソームの浄化ができる非 exosomal タンパク質を減らすために設計されています。エキソソーム表面蛋白質の保存は下流解析の必要がある場合は、この手順は、この分析を妨害する可能性考慮べき。Exosomal CD63、表面に露出した tetraspanin 蛋白質の検出はだったこのプロセスの大幅マイナスは影響されません。

  1. PBS で 500 μ G/ml の濃度でプロテイナーゼ K 溶液を準備します。円錐管にプロティナーゼ K の対応する量を追加します。バッファーと 30 の渦を追加 s、室温で 3 倍。
  2. プロテイナーゼ K 溶液 50 μ L を分注 10 mg サンプルに追加、軽く 200 μ L ピペットを使用して上下ピペッティングで混ぜます。
  3. フロート管ラック チューブ 37 ° c 30 分場所の水風呂でサンプルをインキュベートし、潜在的なリークを避けるために風呂の水で管の完全な液浸を避けてください。
  4. 10 分の 60 ° C の水浴に, プロテイナーゼ K を不活化するサンプルとフローティング チューブ ラックを転送します。

3. 小さい蛋白質およびペプチッド遠心限外濾過法による除去

  1. 使用する前に PBS で 100 kDa 分子量カットオフ (MWCO) フィルターを含む限外濾過装置をすすいでください。500 μ L の PBS を 1,000 μ L ピペットを使用して、フィルターに追加することによってこれを行います。溶出液と同様に、任意の残りの未透過 3,700 x g で 5 分破棄のためのデバイスをスピンします。
    注:限外ろ過装置のサンプル ボリュームの容量は、0.5 mL-4 mL 50 μ L の最終的な低下したサンプル量が達成可能なことを確認する必要があります。
  2. ステップ 2.4 からサンプルを取るし、PBS を追加して 500 μ L にボリュームを増やします。中古リンス限外濾過装置にサンプルをピペットします。
    注:平均では、2.4 の段階から検体量は 185 μ L (120 に 150 μ L のサンプルとプロテイナーゼ K 溶液 50 μ L) は。
  3. サンプルが 50 μ L のボリュームを減らすまで 4 ° C で 3,700 x g で固定角度ベンチトップ遠心に限外濾過装置を配置します。
    注意:デッド ストップで限外濾過装置を使用する場合ボリューム、ケア遠心分離の手順でフィルター膜の完全な乾燥を避けるために取られる必要があります。
  4. フィルター膜およびピペット 5 回上下に直接 500 μ L の PBS を追加します。ステップ 3.3 のように遠心分離機します。この洗浄ステップ合計 3 回を実行します。
  5. 新しい微量遠心チューブに最終的な 50 μ L 未透過を転送します。
  6. 200 μ L の PBS、上下に 10 回ピペッティング フィルター膜を洗浄し、ステップ 3.5 から洗浄をチューブに転送します。
  7. フィルター ホルダーを新しい管の逆の位置に配置します。膜から残りのサンプルを取得するために 2,000 x g で 5 分間逆スピン回復を実行します。プール ステップ 3.5 からサンプルとサンプル。

4. サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によるベシクルの浄化

  1. 700 kda、1,000 μ L ピペットを使用して空の場合、キャップの重力流列に MWCO を持つビーズ秒スラリーの 850 μ L を追加します。適切なラックが装備ドリップ トレイ サイズに列を配置します。
  2. 列の下部の上限を取り除くし、5 分の液体を流し。排水、一度樹脂を洗浄する PBS の 10 mL を追加します。列から排出する洗浄のための 20 分を許可します。
  3. 集中的に配置、プロテイナーゼ K 15 mL の円錐管にステップ 3.5 からサンプルを扱われ、5 mL の血清ピペットと PBS を追加するサンプル量を増加させます。ミックス チューブ 1 分のロッキングを優しくし、ゆっくりステップ 4.2 血清ピペットで準備の列にサンプルを適用します。
    注:列のキャップを取り外したら、サンプル樹脂を介して重力によって流れる、;5 mL のサンプルは、10 分の列を完全に流れます。
  4. 新しい 15 mL の円錐管に流れを収集します。
  5. 血清ピペットを使用して、700 kDa 以下の任意の残りの材料を削除するもう一度ガレージに収集資料を適用します。
  6. 新しい 15 mL の円錐管に流れを収集します。2 回追加 1 mL の PBS 樹脂を洗浄します。4.5; のステップからチューブ内を通しての流れを収集します。最終的な容量は 7 mL ではほぼなります。
    注:サンプル手順 4.6 の後元のサンプル ボリュームから約 35 倍を希釈、次の手順は、ボリュームを削減し、精製エキソソーム サンプルを集中します。

5. 精製エクソソームの総蛋白質定量濃度

  1. 3.1 の手順で説明するよう、使用する前に PBS で 3 kDa MWCO フィルターを用いた限外ろ過装置を洗い流してください。
  2. 限外ろ過装置と 4 ° C で 3,700 x g でスイング バケツの回転子の遠心載荷ステップ 4.6 からサンプルに追加しますバッファーは、フィルターを通過して、破棄することができます。集中エクソソームはフィルター上に保持されます。(非透過) フィルター上の体積が 200 μ L になるまでサンプルを遠心します。
  3. 新しい微量遠心チューブに、非透過を転送します。
  4. ピペッティング膜上 10 回で 200 μ L の PBS のフィルター膜を洗浄し、ステップ 5.3 から洗浄をチューブに転送します。これは残留エキソソーム サンプルのコレクションになります。
  5. PBS を追加することによって最大 500 μ L のサンプル量をもたらします。上下に 10 回ゆっくりとピペッティングで混ぜます。
    注:プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは、4 ° C 夜間、または長期保管のため-20/80 ° C で保存する必要があります。
  6. BCA アッセイ、製造元のプロトコルを使用して、サンプルのタンパク質含有量を定量化します。サンプル 1:10 と 1:50 PBS で希釈します。複製では、各サンプルを実行します。
    注:血清または血漿総蛋白の 10 mg から開始して、ステップ 5.6 から精製エクソソームの総蛋白質収量は、平均 150 μ g。 追加希釈血清または血漿以外のサンプルを使用する場合必要があります。収量は、サンプルの種類によって異なります。

6. 定量化とナノ粒子追跡 (国税庁) の分析によってエクソソームのサイズの変更

  1. 1 mL の PBS と 15 の渦に精製エクソソームの 5 μ g を追加 (5.6 で定量化) と低中速の s。
    1. 1 mL のシリンジにサンプルを配置します。利用可能な場合は、30 μ L/分の割合で希釈エキソソーム サンプルを注入する設定自動シリンジ ポンプで注射器を設定します。
    2. 国税庁測定がビデオ キャプチャ設定: 12-13 の 3-4 とカメラのレベルのゲインを画面します。
    3. 分析 3 技術的複製し 30 の最小値を実行するスクリプトを定義すべて複製の一定の流れを使って s。分析のためには、5 でキャプチャのしきい値を設定します。
      注:ビデオ キャプチャの設定、自動注射器の使用についての詳細は参照13あります。NTA のキャプチャと分析の設定は比較可能性を確保するための異なるサンプル間で一貫性のあるである必要があります。

7. 可溶性蛋白の定量

  1. SDS のサンプルバッファーに精製エクソソームの 1-10 μ g を追加し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) 4-12% ビス トリス ゲルを使用してを実行 1 x MES SDS 200 で 35 分のバッファーを実行する V. 転送解決電圧 o を適用することでニトロセルロース 0.2 μ m 膜タンパク質f 50 V 1 1.5 h. アルブミン, アポリポプロテイン A と B、および CD 63 エキソソーム マーカーの存在を評価する西部のしみの分析を実行する標準的な方法論に続きます。
    注:7.1 メソッドについてプロトコル参照14; で見つけることができます。具体的には、SP007: ポリアクリルアミドゲルの SP011 を実行している: 西部のしみのプロトコル。
  2. 手順 7.1 のようにページを使用して精製エクソソームの 10 μ g を分離し、蛋白質バンド coomassie 色素を用いたタンパク質変異とサンプル間の削減を視覚化するための次の標準的な推奨事項を染色します。
    注:CD63 に固有の西部のしみのプロトコルに関する詳細については、ディアスらによって記述されます。15

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結果

以下に示すデータは、5 つの健康な血液ドナーから対血しょう及び血清サンプルを使用して得られました。各処理ステップの効果を決定する提案するプロトコルの 5 つのバリエーションを行ったとエキソソームの回復と非エキソソーム タンパク質を除去.含まれているメソッドの試験的: 1) 秒 700 kDa + 限外ろ過 3 kDa;2) 限外ろ過 100 kDa;3) プロティナーゼ K + 限外ろ過 100 kDa;4) 秒 700 kDa + 限外ろ過 100 kDa と 5) 限外ろ過 3 kDa 秒 700 kDa + 限外ろ過 100 kDa プロティナーゼ K。

総称して、秒 700 kDa (1、4、および 5) を含むすべてのメソッドはサンプル, 血清と血漿 (図 1 a・B) の両方のタイプの蛋白質の 1 マイクログラムあたり小胞の有意に高い数を作り出した...

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ディスカッション

純度と血液からエクソソームの収量を高めるために最適化されたメソッドがいくつかの疾患のための biomarkers の源として細胞小胞を正確に私に能力を増加します。標準的な方法、エクソソームを具体的には、分離する現在使用されている遠心とエキソソーム集計の可溶性タンパク質7,17、ペレットなどいくつかの欠点を持っている沈殿物メソッド 18。秒の使用がエキソソーム分離、集約からエクソソームを保護し、一般的な汚染物質非 exosomal 蛋白質9,11,18の除去を改善で重要な改善を示しているも,19します。 しかし、アポリポタンパク10、大きい小胞、タンパク...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は、内部資金 (KMD) に CSU、ATCC 契約 #2016-0550-0002 (NIAID HHSN272201600013C の下請け)、ビルおよびメリンダ ・ ゲイツ財団 (OPP1039688) から (KMD/NKG) によって支えられました。追加のサポートのコロラド州立大学で大学生 (REU) 夏プログラムの NSF の研究経験に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
NanosightMalvernNS300
卓上型微量遠心分離機 ThermoLegend Mico21
卓上型遠心分離機 ベックマン・コールターアレグラ 6R
ウォーターバス ベンチマークB2000-4
マイクロプレートリーダーBIOTEKEpoch
Pierce BCA Protein Assay KitTHERMO23227
Micro BCA Protein Assay KitTHERMO23235
リン酸緩衝生理食塩水Corning21-040-CV
96 ウェルプレートCorning15705-066
アミコンウルトラ0.5遠心フィルターユニット、ウルトラセル-100メンブレンEMD-ミリポアUFC510096
アミコンウルトラ-4遠心フィルターユニットEMD-ミリポアUFC800324
Capto Core 700GE Healthcare17548103
ポリプレップ クロマトグラフィーカラムBIORAD7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsTHERMONP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µmバイオラッド1620112
プロテイナーゼK, Tritirachium albumEMD-Millipore539480
SimplyBlue SafeStainTHERMOLC6065
SIGMAFAST BCIP/NBTMillipore-SIGMAB5655
4-Chloro-1-naphtholMillipore-SIGMAC6788
Anti-CD63 抗体 (rabbit-anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibodySYSTEM BIOSCIENCESEXOAB-CD63A-1Primary and secondary antibodies
ALB 抗体 (F-10)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.sc-271605Primary antibody
apoB 抗体 (C1.4)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.sc-13538一次抗体
apoA-I 抗体 (B-10)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.sc-376818一次抗体
付き

参考文献

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