方法論記事

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

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DOI：

10.3791/57476

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2018年9月5日

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1Oncology Drug Discovery: Molecular Pharmacology, Novartis Institutes for Biomedical Research, 2Chemical Biology and Therapeutics, Novartis Institutes for Biomedical Research

この記事について

サマリー

さまざまな病気の徴候でもっと生理学的に関連するモデル開発およびに実装した創薬プログラムであります。ここで説明した新しいモデルのシステムは、回転楕円体を培養し、新しい抗がん剤を検索する高スループット 1536 ウェル プレート ベース システムで上映することができますどのように立体化腫瘍を示しています。

要約

プラスチックの表面を 2 次元 (2 D) 中がん細胞で培養されたが日常的に。この手法は、しかし、欠けている腫瘍の真の環境質量は、 in vivoにさらされています。固形腫瘍はプラスチック、関連付けられているシートではなく育つが、三次元 (3 D) のクローン細胞のコレクションとして代わりにスペースの彼らの隣人と正常細胞の極性の中断などの空間特性の相互作用します。これらの相互作用を引き起こす 3 D 培養細胞の生体内で腫瘍により関連している形態学的および細胞の特性を獲得します。さらに、腫瘍間質と免疫細胞だけでなく、他のすべてのセル型から細胞外マトリックスなど他の細胞型との直接接触、質量。堆積したマトリックスは、コラーゲンとフィブロネクチンなどの高分子で構成されます。

ベンチから枕元に腫瘍学の研究成果の翻訳を向上しようとして、多くのグループは、医薬品開発戦略における 3 D モデル システムの使用を調査し始めています。これらのシステムは、彼らは腫瘍の複雑な異機種混在環境を再現しようと思うのでもっと生理学的に関連すると考えられます。これらのシステムはしかし、非常に複雑にすることができますが 96-ウェル フォーマットおよび 384 でも今いくつかの成長に従う、彼らは大規模な成長とスクリーニングのためのいくつかの選択肢を提供します。これは、観察のギャップは、1536 ウェル プレートの高スループット能力における文化腫瘍スフェロイドを詳しくここで説明する方法の開発につながっています。これらのメソッドは、画面、および従来の 2 D の試金することは困難である非常に複雑な行列ベース システムに妥協を表します。さまざまな遺伝的変異を異なるがん細胞は Mitogen-Activated 蛋白質キナーゼや MAPK 経路をターゲット化合物の精選されたライブラリを使用して化合物の有効性を調べること、正常に上映されます。スフェロイド培養反応を比較する、2次元の成長細胞の応答と差分の活動が報告されます。これらのメソッドは、高スループットの 3 D 設定の複合アクティビティをテストするための独自のプロトコルを提供します。

概要

過去 10 年間より多くの研究は、プラスチックで 2 D のセルの成長によって完全に締めくくっているない概念を理解する 3 D 細胞培養モデルの使用を実装しています。これらの概念の例としては、生存率と細胞の運命を制御する細胞外のマトリックスの役割と同様、細胞の樹状突起と基底層の空間的なオリエンテーションが失われ、正常な上皮細胞極性1交替。特に、腫瘍学研究は、がん細胞と 2 D と 3 D 細胞培養システム3,4の違いの基本的な生物学を理解するのに 3 D モデルを使用います。高度な細胞培養の技術とウェル フォーマットへ彼らのさらに適応の開発は、3 D 設定で新しい薬剤のための検索を可能にしました。階層型セルラー システム5から異なるサイズの単一細胞型球を複雑腫瘍範囲の 3 D モデル、2 D 条件の下で複雑なマルチ マルチセル型球6,7,細胞とは対照的8します。 新規化合物または強力これら 3 d モデル システムの細胞死を誘発する生物学的製剤の発見は、したがって、薬物開発キャンペーンで高金利。これらのアッセイのエンドポイントは通常は細胞増殖の変化を評価するために 2D 文化で実行されるものと同じ、彼らはターゲット遺伝子や経路中の依存性の本当のレベルを明らかにするかもしれないときにもっと生理学的に関連する設定で実施し、尋問。

3次元培養系における薬物応答を検討するさまざまなモデル システムを開発されていると上記で紹介したが、大半どちらか 96 または 384 ウェルのマイクロ プレートを使用でよく使われる高スループットス クリーニング (HTS) 形式に容易に適応しません。薬物探索スクリーニング キャンペーン。このようなシステムは、液滴技術、回転楕円体の文化、天然または合成ゲル コラーゲン、マトリゲル、ポリエチレング リコール (PEG)2 などを組み込んだ浮上、文化を誘発する磁性粒子と細胞を脈動をぶら下げの使用を含む.1536 ウェル プレート形式で確立された細胞株から 3 D 回転楕円体文化を生成する手法の開発済みの詳細な方法を紹介します。このプロトコルでは、通常付着性のセル行9の添付ファイルを防止する非常に定義された媒体が使用されます。このシステムの制限があります (すなわちがんの複雑なモデル システムに完全に要約するだろうことはできません)、それにもかかわらず、これらの試金は低分子化合物の大規模なコレクションおよび薬剤応答の横比較のハイスループットス クリーニングを有効にします。間細胞および化合物のさまざまな 2D および 3D の文化。

細胞株は MAPK シグナル伝達経路は非常に癌の調節不全を経路に関係する遺伝子の突然変異港すべてこの資料の方法を示すが選択し、多くの治療法があります。路線の多くがあるもと呼ばれ、KRA、神経芽細胞腫 RAS または nras 登録で、ハーヴェイ ラット肉腫ウイルスの癌遺伝子または HRA、関連するキナーゼ、急速に加速する Fibrosarcomas として知られているキルステン ラット肉腫ウイルス発癌性突然変異をアクティブにします。Raf。最近の文献では、この経路の異なるノードの阻害剤は、3 D の条件9,10の下で育てられたときの細胞のサブセットの一意により効果があることを示唆しています。1 つの研究が見つかりました 3 D でアクティブな RAS 癌細胞培養、それら MAPK の阻害剤への感受性の増加を示したし、さらに、このアプローチは経路を識別することができるし、伝統的な 2 D で逃したかもしれない阻害剤を対象と設定します。本研究の目的はこれらの細胞株を培養するために使用方法を提示する、さらに、差分を示す 3 D を使用して場合にのみに観察することができますこれらの阻害剤への応答細胞培養システム。

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プロトコル

1. 腫瘍 1536 ウェル 3 D 回転楕円体の培養

  1. ダルベッコ変更イーグルス媒体 (DMEM/f12 キー) の 500 mL に次の試薬を追加して新鮮な 3 D 腫瘍回転楕円体中幹 (細胞培地 + ノックアウト血清交換 + インシュリン ・ トランスフェリン ・ セレニウム) を準備: 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン、人間の 10 ng/mL塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF)、ひと上皮成長因子 (EGF)、0.4% ウシ血清アルブミン (BSA) (一部分 V)、インシュリン ・ トランスフェリン-セレンと 1% のノックアウト (KO) 血清交換 (はない凍結融解) x 1 の 20 ng/mL。
  2. フィルター - 0.4 μ m ボトル上部フィルター システムを通じてサプリメントで培地全体を滅菌します。
  3. それらを洗浄することにより伝統的な細胞培養フラスコからの推奨されるルーチン培養条件に従って成長している癌セルラインをデタッチ 3 x 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 0.25% トリプシン (1 mL の適切な量を追加します。5 cm2) あたり細胞の薄層を作成する 5 分間。血清を含む培地の量 × 5 とトリプシンを中和し、セルをカウントに進みます。たとえば、5 ml のトリプシン 25 mL の培地を使用します。
  4. 1536 ウェル組織文化処理板に回転楕円体中の 8 μ L の井戸あたり 500 セルの合計をシードするために4セル/mL の 10 x 62.5 に細胞液の濃度を調整します。
  5. 生物学的安全キャビネット、蠕動ポンプがベース システムと滅菌、小さなステンレス鋼先端のカセットを使用してセルをシードします。別のセル行の間フラッシュ 1 × PBS と 70% とカセットのチューブ 10 用エタノール s。
  6. また、滅菌、小さなステンレス鋼先端カセットと蠕動性ポンプまたは枚必要なセルの行の数によっての接続されたシリンジ ポンプ使用 HEPA フィルターの部屋内にある液体ハンドラーを使用してセルをシードします。
  7. どちらか通気性粘着プレート シールを使用して手動でまたはプレート シーラーを使用してプレートをシールします。
  8. 10 rpm と 5% の二酸化炭素 (CO2) と相対湿度 95% の 37 ° C に設定回転インキュベーターにプレートを配置します。3 d のフォームに回転楕円体を許可します。

2. 1536 ウェル 2D 癌細胞株の培養

注: 1536 ウェル 2 D がん線を 3 D プレートに化合物の付加の前に 24 時間培養する必要があります。

  1. 選択した行の適切な成長培地 500 mL に次の試薬を追加して 2 D がん細胞の培地を準備: ペニシリン/ストレプトマイシンと 10% ウシ胎児血清 (FBS) × 1。
  2. フィルター - 0.4 μ m ボトル上部フィルター システムを通じてサプリメントで培地全体を滅菌します。
  3. それらを洗浄することにより伝統的な細胞培養フラスコからの推奨されるルーチン培養条件に従って成長している癌セルラインをデタッチ x PBS と 0.25% トリプシン (5 cm2あたり 1 mL) の適切な量を追加する 5 分の 1 と 3 倍セル上の薄層を作成します。血清を含む培地の量 × 5 とトリプシンを中和し、セルをカウントに進みます。たとえば、5 ml のトリプシン 25 mL の培地を使用します。
  4. 1536 ウェル組織文化処理板に完全培地の 8 μ L の井戸あたり 500 セルの合計をシードするために4セル/mL の 10 x 62.5 に細胞液の濃度を調整します。
  5. 生物学的安全キャビネット、蠕動ポンプがベース システムと滅菌、小さなステンレス鋼先端のカセットを使用してセルをシードします。異なる細胞間フラッシュ滅菌 PBS と 70% × 1 カセットのチューブ 10 用エタノール s。
  6. また、滅菌、小さなステンレス鋼先端カセットと蠕動性ポンプまたはセルごとプレートの量に応じて、添付のシリンジ ポンプを使用してロボットの HEPA フィルター部屋内にある液体ハンドラーを使用してセルをシードします。必要な行。
  7. どちらか通気性粘着プレート シールを使用して手動でまたはプレート シーラーを使用してプレートをシールします。
  8. 10 rpm と 5% CO2と 95% 相対湿度と、化合物の添加前に 24 h の 37 ° C に設定回転インキュベーターにプレートを配置します。

3. 化合物添加

  1. 10 mM トップ濃度液体ハンドリング ロボットの 100% ジメチルスルホキシド (DMSO) における MAPK の阻害剤の 8 ポイント、3 倍連続希釈液を準備します。プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブは、完全な細胞アッセイのダイナミック レンジを決定する殺害のポジティブ コントロールとして使用されます。
  2. クイック スピンすべてアッセイ プレートおよび結露を収集する 100 x g で複合板。各板から粘着のシールを外して、8 の合計を追加する音響ディスペンサー セットアップ上プレート ウェルあたり 0.1 %dmso の最終濃度と 10 μ M の最上化合物線量を表す各化合物/希釈の nL。
  3. 化合物の添加が完了した後は、プレート上の蒸発を防ぎ、5 d、5% CO2と 95% 相対湿度の 37 ° C で回転の定温器にプレートを置きオーダーメイドのステンレス製細胞文化ふたを配置します。

4. 検出試薬の追加と生データの獲得

  1. あらかじめ暖かい室温で増殖、37 ° C の水浴アデニン三リン酸 (ATP) の変更と、つまり、変更を検出するためルシフェリンを含むセル換散試薬の適切なボリューム。蠕動ポンプを使用しても検出試薬の 3 μ L の合計を追加し、少なくとも 15 分間室温でプレートを孵化させなさい。
  2. プレート ルミノの発光をキャプチャします。

5 データ処理

  1. 計測器から生データを抽出し、ニュートラル制御として単独で DMSO を含むすべての井戸のなかにテスト化合物を含むすべてのフィールドを正規化します。この値は、各化合物のパーセントの成長阻害を算出します。Microsoft Excel で数式関数を使用が完了すると、 f (x) = {(サンプルの値の相対的な光の単位 (RLUs)/(平均 DMSO 値 RLUs) * 100)}。
  2. グラフのプログラムを使用して化合物の濃度に対して手順 5.1 から正規化されたデータの値をグラフ化して用量-反応曲線と抑制 IC50s を生成します。
    注: ヘリオス、内部の NIBR ソフトウェア ツールを使用してデータ分析を行った。この関数を完了するには、ノンパラ メトリック曲線分析ツールを選択しました。

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結果

2次元培養条件下でよく成長する知られている行は、ここで説明した方法を使用してテストされた確立されたがん細胞の様々 な。細胞株における MAPK 変異癌のさまざまなから代表的なイメージ (Calu-6:KRAS、NCI-H1299:NRAS、SK-メル-30:NRAS と教訓集-62:HRAS)図 1に示します。これらの画像は、その細胞株には、様々 な形態があるが、それぞれに形成された 3 D 構造 1536 ウェル アッセイ プレートを示しています。図 2は、ことを示します、大規模スクリーニングを行う際文化 3 D、2 D対で栽培間差分化合物の感度を観察できます。グラフの各ドットを表す 1 つの化合物の阻害濃度 50% セル殺害または両方の設定で化合物の IC50 応答があります。効果はさまざまなメディアによってもっぱらプロテストを示すため、Calu 6 セルは、2 D の組織培養プレートまたは添付ファイルを防ぐため 3 D Sciva...

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ディスカッション

紹介した方法は、大規模化合物スクリーニングのための 1536 ウェル プレートで腫瘍を回転楕円体を生成する方法の詳細なプロトコルを示します。これらのメソッドは当初腫瘍回転楕円体が遺伝的依存関係および化合物の感度13,について質問をする 6 ウェルや 96 ウェルのプレートの低スループット試金で育った国立がん研究所での仕事から合わせられました。14,15します。 このプロトコルの重要な機能は、回転楕円体は、1536 プレートを使用して定義されている伝統的な 2 d の組織培養細胞から形成されている SCM + KO + ITS と呼ばれるメディアです。セルのシードは、一度 3 d 回転楕円体形成の期間にわたって任意の蒸発を防ぐために通気性のある接着プレート シールでシールされます。回転楕円体は、このアプローチの16を使用して時間の長い期間も培養することができます。球形成の 3 d は、化合物が 5 d の試...

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開示事項

著者は、ノバルティス社の社員、何人かの従業員も株主です。

謝辞

著者は、彼のサポートとこれらのアッセイの初期の開発に関するガイダンスを進めるトランスレーショナル科学、健康の国民の協会の国立センターでマルク ・ フェレールを認めると思います。さらに、彼らの科学知識とプロジェクト チームのメンバーとの議論のためアリソン ・ フリーマン、マリエラ Jaskelioff、マイケル ・ アッカー、ヤコブ Haling、Vesselina ・ クックに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagents
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12ATCC30-2006調製済み溶液として購入しました。このレシーペは、他のベンダーと比較して好ましいことがわかりました。
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12Lonza12-604F調製済み溶液として購入しました。
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)ロンザ12-115Q調製溶液として購入。
ウシ胎児血清(FBS)Seradigm1500-500調製溶液として購入しました。
1x 0.25% トリプシンとエチレンジアミン四酢酸 (EDTA)HycloneSH30042.01調製済み溶液として購入しました。
1x ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140調製溶液として購入しました。
10 ng/mL ヒト塩基性線維靭性成長因子(bFGF)SigmaF0291滅菌水に再懸濁します。
20 ng/mL ヒト上皮成長因子(EGF)SigmaE9644滅菌水に再懸濁します。
0.4% ウシ血清アルブミン (BSA)SigmaA9418滅菌PBSに再懸濁し、ろ過します。
1x インスリントランスフェリンセレン (ITS)Gibco51500056
1% ノックアウト (KO) 血清交換Gibco10828-028使用直前に新鮮なものを追加してください。
100%ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma276855-100ML
CellTiter-GloPromegaG7573調製済み溶液として購入しました。
<強力>消耗品
小型コンビカセットThermoFisher24073295
小型マルチフローカセットBioTek294085
1536ウェル滅菌TCプレート(白)Corning3727
1536ウェル滅菌TCプレート(黒)Corning3893
ScivaxプレートMBLインターナショナルNCP-LH384-10
Equipment
接着剤シールサーモフィッシャーAB0718
スピニングインキュベーターLiCONiC
ステンレス鋼蓋ノバルティス研究財団のゲノミクス研究所(GNF)
ATSアコースティックディスペンサーEDSBiosystems
Echo Acoustic DispensorLabcyte
LuminometerEnvision-Perkin Elmer
蠕動ポンプ-Multidrop CombiThermoFisher
リキッドハンドラー-Multiflow FXBioTek

参考文献

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1536 3D MAPK ATP

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