すべての病原性リーシュ マニア原虫種に存在し、脊椎動物のホストのマクロファージ内で複製。ここでは、リーシュ マニア、続いて細胞増殖動態の正確な定量培養マウス骨髄由来マクロファージに感染するプロトコルを提案する.このメソッドは、リーシュ マニアの病原性と宿主-病原体相互作用に影響を与える個々 の要因を調べる場合に役立ちます。
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この記事について
サマリー
要約
リーシュ マニア、リーシュ マニア症の原因となるエージェントのライフ サイクルそれぞれ昆虫内の promastigote と amastigote の段階と脊椎動物のホスト間で交互に行います。脊椎動物の段階で感染種によって非常に致命的な内臓疾患形態に良性の皮膚病変から広く、リーシュ マニア症の病原性の症状があります、すべてのリーシュ マニア原虫種ホスト マクロファージの内部に存在します。そのライフ サイクル。リーシュ マニア感染が侵入し生き残るため、マクロファージ内 parasitophorous 液胞 (PVs) 内のレプリケート機能に直結したがってします。したがって、細胞内で複製する寄生虫の能力評価は、病原性を決定するための信頼性の高い方法として機能します。モデル動物を用いたリーシュ マニア症開発の勉強は時間がかかり、退屈で、多くの場合困難である特に pathogenically 重要な内臓フォームです。骨髄由来マクロファージ (BMMs)リーシュ マニア原虫の細胞内の発展を追跡する方法をご紹介します。細胞内の寄生虫数は 72 96 h の感染のための 24 時間間隔で決定されます。このメソッドは、リーシュ マニア病原性に及ぼすさまざまな遺伝的要因の信頼性の高い定量できます。リーシュ マニア原虫ミトコンドリア鉄トランスポーター遺伝子 (LMIT1) の単一の対立遺伝子の削除がリーシュ マニア amazonensis変異株LMIT1/ΔLmit1の BMMs、内部成長能力を損なう方法を示す例については、野生型と比較して毒性の大幅な削減を反映しています。この試金は、宿主-病原体相互作用に及ぼす諸要因(栄養素、活性酸素種など)の分析を個別に操作できる実験条件を正確に制御できます。したがって、適切な実行と BMM 感染症研究の定量化は、従来の動物モデル研究の非侵襲的、急速な経済的な安全で信頼性の高い代替を提供します。
概要
リーシュ マニア症は、原虫リーシュ マニア属の種によって引き起こされる人間の病気の広いスペクトルを指します。約 1200 万人現在リーシュ マニア、世界中に感染しているし、以上 3 億 5000 万が危険にさらされます。病の病理は、リーシュ マニア原虫種と宿主因子によって決まるし、症状が無害な自己治癒皮膚病変から致命的な visceralizing フォームに変わる。最悪の人間の病気としてマラリア後だけランキングが1原虫感染によって引き起こされる未処理、内臓リーシュ マニア症は致命的な場合。病の病理や症状に多岐にわたる違いがあるにもかかわらずすべてのリーシュ マニア原虫種昆虫内の promastigote と amastigote の段階と脊椎動物のホストをそれぞれ交互 digenic ライフ サイクルがあります。内部脊椎動物、リーシュ マニアホスト マクロファージ浸潤、parasitophorous 液胞 (Pv)、高度病原性 amastigote フォームが複製ファゴライソゾームの特性と酸性コンパートメントの形成を誘導します。Amastigotes 慢性感染の間に宿主組織の永続化および伝送サイクルを完了するに感染していないサシチョウバエを渡されることができます。したがって、人間の病気の開発の中で、amastigotes は、最も重要なリーシュ マニアライフ サイクル フォー....
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プロトコル
すべての実験手順はケアと実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に従って健康の国民の協会によって実施され、メリーランド大学 IACUC によって承認されました。1 4 からのセクションで説明するすべての手順は、生物層流キャビネット内無菌実施されなければなりません。個人用保護具を使用する必要がありますと実験のすべての段階を通してライブリーシュマニア原虫の処理中に注意が必要があります。
1. 分離と骨髄由来マクロファージ (BMMs)8,30,31の分化
- 0:4 - 6 週齢女性C57BL/6または CO2チャンバーのBALB/cマウスを犠牲にし、頚部転位による死を確認します。70% エタノールに浸して保存すると、ハサミ、鉗子の滅菌を確認します。滅菌骨髄細胞分離プロセス全体の処理を許可する 70% のエタノールと手袋をスプレーします。
- 解剖に犠牲にされたマウスのセキュリティで保護されたその前肢を固定することによってボードおびただしく 70% エタノールを噴霧して消毒してください。
- 股関節に近いハサミ小切開 (約 1 cm) を確....
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結果
リーシュ マニアは 2 つの感染形 - metacyclic promastigotes procyclic promastigotes から文化の固定相で区別する amastigotes、細胞内ステージ (図 1) であります。L. amazonensisなどのいくつかのリーシュ マニア原虫種の amastigotes 区別できます無菌培養で pH (4.5) および高温 (32 ° C)、BMM PVs の中見つけられるそれらに類似した条件を下げる promastigote セルをシフトすることによって8,34. だけでリーシュ マニア原虫の metacyclic promastigote または amastigote フォームが PVs の形成を誘導してホスト マクロファージ35
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ディスカッション
上記、BMM 感染試験によって生成された定量的データにより、感染率と比較的短い期間 (最長 2 週間、2 に比べて病原性の変化の信頼性の決定を取得します。ヶ月生体内で実験に必要な)。このメソッドは、DNA 特定色素 DAPI、特にマクロファージと寄生虫の核を汚れと感染細胞の迅速な同定及び定量化に依存します。比較では、ギムザなどの他の汚れは強さを変化させて、複雑な視覚分析37多数の異なる細胞コンポーネントにバインドします。DAPI を使用細胞内寄生虫・携帯から明確な区別の認識構造 (唯一の宿主細胞の核が染色もとのサイズが桁違い寄生虫核より大きい)、簡単かつ迅速にできるように感染症の定量化。
任意の実験プロシージャと同様、このメソッドはいくつかの制限といくつかの重要な手順を慎重に実行を必要とします。生体内でリーシュ マニア感染症には、貪食能、感染症38の究極のコースを決定する前に複雑な生得の免疫反応が含まれます。モデル マウス株の選択は、したがっての研究デ.......
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開示事項
著者は、彼らは競合の金銭的な利益がある宣言します。
謝辞
この作品は、国立衛生研究所健康付与 RO1 AI067979 NWA によって支えられました。
有限会社は、学部の交わりからハワード ヒューズ医学研究所/大学のメリーランド州カレッジパークの受信者です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 6ウェル細胞培養プレート | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| エアロゾルバリアピペットチップ (100-1000 μL) | フィッシャーブランド | 02-707-404 | |
| エアゾールバリアピペットチップ (20-200 μL) | フィッシャーブランド | 02-707-430 | |
| エアゾールバリアピペットチップ (2-20 μL) | フィッシャーブランド | 02-707-432 | |
| バードパーカー リブバック カーボンスチール サージカル ブレード #10 | アスペン サージカル | 371110 | |
| BD ルアーロック チップ 10 mL シリンジ | ベクトン ディキンソン (BD) | 309604 | |
| BD プレシジョングライド ニードル 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T.ベイカー | C272-00 | |
| EDTA | シグマ アルドリッチ | EDS | |
| エチルアルコール 200 プルーフ | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| ファルコン 100 mm x 15 mm 非 TC 処理ポリスチレン ペトリ皿 | コーニング | 351029 | |
| 胎児ウシ血清 | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | シグマ アルドリッチ | F8016 | |
| 蛍光顕微鏡 | ニコン | E200 | |
| ヤギ抗マウス IgG テキサスレッド | Invitrogen | T-862 | |
| ヤギ抗ウサギ IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| ヘミン | 東京化学工業株式会社 | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| アイソトンII 希釈剤 | ベックマンコールター | ||
| L-グルタミン | ジェミニ | 400-106 | |
| ミディアム 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na ピルビン酸 (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| パラホルムアルデヒド | アルファ エーザー | 43368 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | ジェミニ | 400-109 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (-/-) | サーモフィッシャー | 14200166 | |
| ポリプロピリン円錐形遠心分離チューブ 15 mL | セルスター | 188 271 | |
| ポリプロピリン円錐形遠心分離チューブ 50 mL | セルスター | 227 261 | |
| ProLong Gold 退色防止試薬 | サーモフィッシャー | P36930 | |
| ラット抗マウス Lamp-1 抗体 | Developmental Studies ハイブリドーマバンク | 1D4B | |
| 組換えヒト M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line 血球計算盤 | ハウサーサイエンティフィック | 1492 | |
| RPMI ミディアム 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 界面活性剤 | ミリポアシグマ | TX1568-1 | |
| トリパンブルー | シグマ Aldrich | T8154 | |
| 繊細なはさみ、4 1/2 インチ | VWR | 82027-582 | |
| 解剖鉗子、ファインチップ | VWR | 82027-386 | |
| 顕微鏡スライド | VWR | 16004-368 | |
| Z1 コールター パーティクル カウンター、デュアル スレッショルド | ベックマン コールター | 6605699 |
参考文献
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al.
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