個別の嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ研究のひと鼻腔上皮細胞スフェロイドの生成

サマリー

ここで人間の鼻粘膜上皮細胞の三次元回転楕円体文化を生成する手法について述べる。回転楕円体は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) ドライブに刺激される-依存イオンと液分泌、「CFTR 機能のプロキシとして回転楕円体内腔サイズ変化を定量化します。

要約

一方、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) 変調器薬の導入ケア嚢胞性線維症 (CF) に革命をもたらしました、現在使用している遺伝子型指向療法モデルはいくつかの制限を持っています。最初、稀なまたは流変異グループは、決定的な臨床試験から除外されます。また、追加の変調器薬市場に参入、個々 の主題の変調器の選択を最適化することは困難になります。両方のこれらの問題は「CFTR 機能変調の患者由来、個別の前臨床モデル システムを使って解決されます。ひと鼻粘膜上皮細胞 (HNEs) は、このようなモデルのための呼吸器組織の簡単にアクセス可能なソースです。ここで、「CFTR 機能と主な HNEs を用いた変調方式の三次元回転楕円体モデルの生成について述べる.HNEs は、低侵襲のファッション、条件付きのリプログラミング条件に拡大し、回転楕円体の文化にシードの被験者から分離されています。種まきの 2 週間以内に回転楕円体の文化生成 3', 5'-環状アデノシン一リン酸 (cAMP) を刺激することができます HNE スフェロイド-アゴニスト「CFTR 機能アクティブするを生成します。回転楕円体の腫れは CFTR の活性のプロキシとして、定量化されます。HNE 回転楕円体は、低侵襲、まだ呼吸疾患の罹患率と死亡率を反映した上皮に関連するアクセス可能なパーソナライズされたモデルを生成する鼻の細胞の起源を活用します。気液界面 HNE 文化に比べると、回転楕円体は、成熟する比較的簡単な汚染率を減らします。現在の形態でモデルは組織の買収の相対的な容易さは相殺されて、低スループットによって制限されます。確実に定量化し、個々 のレベルで「CFTR 活動を特徴付ける HNE 回転楕円体を使用できます。CFTR 変調に対する患者の反応の真の臨床予測かどうか HNE 回転楕円体は、生体内で薬剤応答にこの数量を結ぶ継続的な研究を決定します。

概要

嚢胞性線維症 (CF) は、約 7万人の世界¹に影響を与える致命的な常染色体性劣性遺伝性疾患です。この人生短縮遺伝病は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ蛋白質 (CFTR)²で突然変異によって引き起こされます。CFTR 胃腸、汗腺を含む複数の偏光上皮細胞の頂端膜を渡る塩化物、重炭酸塩の動きを許容するイオン チャネルとして機能や、アデノシン三リン酸結合カセット家族のメンバーであります。・呼吸器病^3,4の木の他の中で。など、「CFTR 機能不全は呼吸器疾患¹から生じるほとんどの死亡率と多臓器の上皮障害につながります。CFTR 駆動気道表面液体 (ASL) 規制と粘液のリリースにつながる厚く粘液、気道閉塞、慢性感染症、進行性気道リモデリングと肺機能^1、5の損失は、CF の肺。

病気の原因として「CFTR 機能障害の識別、にもかかわらず CF 療法は、伝統的症状 (例えば、膵酵素補充療法、気道クリアランス療法)¹軽減焦点を当てた。このアプローチは、最近「CFTR 変調」「CFTR 機能不全を直接対象すると呼ばれる新規の治療法の出現によって革命化されました。このアプローチは、疾患修飾に症状マネジメントから臨床の風景をシフトしている気が、いくつかの制限^6,7,8,9,10を運ぶ。変調器の活動は各 CFTR の突然変異に伴うタンパク質の欠陥に特定、限られた遺伝的個体群¹¹を選択します。この制限は、まれな突然変異グループでの臨床試験の実行によっても異種タンパク質の欠陥、性質によって駆動されます。さらに、よく研究遺伝子多型 (例えばF508del/F508del CFTR CFTR の最も一般的な突然変異)、被験者の間ではばらつきが大きく、疾病負担と変調器応答^{6,7,8 ,9,11}。

両方のこれらの問題を克服するため、捜査官は前臨床試験¹²のパーソナライズされたモデルの使用を提案している.この概念は、パーソナライズされた方法で治療する生体内で件名応答予測複合テスト、個別前のヴィヴォモデル システムを生成する患者特有の組織を利用しています。されましたら、臨床医が患者の基になる CFTR 遺伝子型に関係なくドライブ精度療法はこのようなモデルを使用可能性があります。

人間の肺移植の時に植組織から得られた気管支の上皮 (HBE) 細胞は、CF^13,14のためのようなモデルの可能性を設立しました。HBEs 気液界面 (アリ) で成長して電気生理学的検査から直接または間接的 ASL 恒常性^13,15の措置を通じて機能の CFTR の定量化を可能にします。このモデルは CFTR の生物学を理解するための重要なている、CFTR 変調器¹⁶の開発の重要なドライバーだった。残念ながら、HBE モデルはこれらのまれな変異や軽度の病気 (肺移植または気管支擦過) 買収の侵襲的な性質とサンプルの不足のためのパーソナライズされたモデルとして理不尽ではありません。個別「CFTR 機能^17,18,を勉強する腸内電流測定 (ICM) または腫れベースにおけるアッセイの腸組織、直腸または十二指腸生検標本から得られたを使用ことができます逆に、¹⁹. Organoid 試金、特に、CFTR 活動^20,21,22の非常に機密性の高いモデルであります。両方のモデルは、組織ソース (腸組織、ほとんどの病は呼吸器) と半侵襲的買収法によって制限されます。また、いくつか調査官はモデル CFTR 復元^23,24,25に人間の鼻粘膜上皮 (HNE) の細胞を研究しています。HNEs はブラシまたはあらゆる年齢層の被験者で掻爬によって安全に収穫できるし、アリで培養した場合 HBEs^25,26,27,28の多くの特徴を要約するでしょう。HNE 単層培養は扁平上皮の変換と成熟度²⁹に長い時間によって伝統的に制限されています。また、報告されて短絡 HNEs で電流の測定が治療効果の²⁵を検出する小さいウィンドウを示唆している HBEs のそれらより小さい。

「CFTR 機能のパーソナライズされた、非侵襲的呼吸器の組織培養モデルの必要性を考える我々 は HNEs の非侵襲的・呼吸器病の自然と腫れベースにおけるアッセイの感度をマージしようとしました。ここでは、腫れを用いた測定³⁰個別 CFTR の研究のための HNEs の 3 次元「回転楕円体」文化を生成する手法について述べる。HNE スフェロイド二極化確実に球の中心、または内腔に向かって上皮の頂点。このモデルは、下気道上皮の多数の特徴を繰り返す、アリの文化よりも早く成熟します。機能アッセイとして HNE 回転楕円体は確実に範囲の「CFTR 機能としてよく研究の突然変異のグループ (例えば、F508del CFTR) で変調を定量化します。この腫れベースの試金を直接測定されない流体流入回転楕円体に水が根尖部の塩排出を通り CFTR のイオン/塩の輸送特性における大文字します。この方法で機能的 CFTR の誘導回転楕円体膨らむ頑健、CFTR 機能不全とのそれら、うねりの少ない縮小中。これは事前のイメージ分析を通して定量化され、1 h 後刺激の回転楕円体、内腔領域を測定し、割合の決定を変更します。この測定は、患者特異的薬物活性のスクリーニング実験群間で比較できます。

プロトコル

HNE サンプル シンシナティ小児病院医療センター CF 研究センターによって募集された被験者から手に入れられました。ここで説明したすべてのメソッドは、シンシナティ小児病院医療センター制度検討委員会 (IRB) によって承認されています。書面による同意は、テストの前にすべての被験者から得られました。

1. 拡張メディアと抗生物質

1. 表 1に記載されているメディア コンポーネントを収集します。部屋の温度で冷凍材料を解凍し、「拡張メディア」の下の表 1に示されているように必要な在庫ソリューション。
   注: は、コレラ毒素は、摂取すると有毒、皮膚、目、呼吸器を刺激を処理するときに注意をしてください。すべてのソリューションやバイオ セーフティ キャビネットのクリーンな環境下でメディアを結合します。
2. 50 mL の血清学のピペットを使用して、削除し、他の材料の付加を補うために 1 つのコンテナーから基本媒体 (ダルベッコ変更イーグル培地/f12 キー) の 50 mL を破棄します。オートクレーブ 1 L ガラス瓶の中に基本のすべてのメディアを手で注ぐ。
3. 適切な 50 mL の血清学のピペットや 1 mL ピペットを使用して、メディアを含むオートクレーブ処理したガラス瓶の中に表 1の「拡張メディア」セクションからすべて残りコンポーネントを転送。優しく手でミックスするボトルを旋回します。
4. 新鮮な滅菌 1 L、0.22 μ m ポリエーテルサルホン (PES) にフィルター メディアは、製造元の指示を使用してフラスコをフィルターし、「拡張メディア」と日付にコメントを付けます。
5. 抗生物質のメディアを準備します。「抗生物質のメディア」下の表 1 に示されているように必要な抗生の貯蔵液
   1. 50 mL の血清ピペットを使用して、新鮮な 250 mL のオートクレーブ処理したガラス瓶に拡張メディアの 150 mL を転送します。
   2. 1 mL ピペットを使用して、メディアを含むオートクレーブ処理したガラス瓶の中に表 1の「抗生物質メディア」セクションからすべてコンポーネントを追加します。旋回手でメディアが外観で均一になるまで混ぜます。
   3. フィルター滅菌、新鮮な 250 mL、製造元の指示を使用して 0.22 μ m PES フィルター フラスコにメディアと「抗生物質メディア」と日付にコメントを付けます。
6. 曇り、汚染を示唆している場合の破棄まで 1 ヶ月、4 ° C でメディアを保管します。

2. 分化メディアを準備します。

1. 表 2に記載されているメディア コンポーネントを収集します。部屋の温度で冷凍材料を解凍し、表 2に示されているように必要な溶液を作る。
   注: 生殖毒素であるレチノイン酸を処理する場合は注意飲み込んだ場合有害であることができます、皮膚の炎症を引き起こします。分注とすべてのソリューションとバイオ セーフティ キャビネットのクリーンな環境下でメディアを組み合わせます。
2. 削除し、他の材料の付加を補うために 1 つのコンテナーから基本培地中の 52 mL を破棄します。ベースのすべてのメディアをオートクレーブの 1 リットルのガラス瓶に注ぐ。
3. 適切な 25 mL の血清ピペット、1 mL ピペットを使用して、メディアを含むオートクレーブ処理したガラス瓶に、表 2から残りのすべてのコンポーネントを転送し、混ぜて手で優しく渦します。
4. 新鮮な滅菌 1 L、0.22 μ m ポリエーテルサルホン (PES) にフィルター メディアは、製造元の指示を使用してフラスコをフィルターし、「分化メディア」と日付にコメントを付けます。
5. 曇り、汚染を示唆している場合の破棄まで 1 ヶ月、4 ° C でメディアを保管します。

3. コート培養皿とフィーダー線維芽細胞をプレート

注: は、バイオ セーフティ キャビネットのクリーンな環境の下ですべての手順を実行します。

1. 0.5 mL コラーゲン株式の 37.5 mL の 50 mL の円錐管に滅菌水を混ぜます。
2. 表面全体が覆われていることを確認各クリーン P100 培養皿に 4-5 mL のコラーゲン溶液をピペットします。
3. 蓋が付いている皿をカバーし、37 ° C、5% CO₂で一晩インキュベートします。
4. キャビネットのバイオ セーフティにおけるすべての皿の蓋を削除します。渦巻き模様の皿をカバーし、吸引するソリューション。
5. Uv (紫外線) 料理に戻って 1 h. 場所蓋、アルミ箔で料理をスタック、カバーのライトへの露出によって殺菌しなさい。
6. 4 ° C で 3-6 ヶ月、紫外線滅菌再コーティング店料理光セル文化使用前に 15-30 分。
7. HNE サンプルを取得する前に 24 時間殺菌塗装皿とマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) と日付ラベル。
8. 血清学のピペットでプレート (約 5 mL) をカバーする拡張メディアを追加します。
9. 37 ° C の洗浄器の 2 × 10⁶照射 MEFs のバイアルを解凍します。MEFs がフリーズ解除、すぐに分散させるために手で旋回 1 mL ピペットで皿にバイアル (約 10 の⁶セル) の半分を追加します。
10. HNE 文化のための準備で一晩の 37 ° C および 5% の CO₂で孵化させなさい。
    注: 3.7 3.10 の手順をすることができます必要に応じて、めっきセルの前に 60 分遅く実行も一晩です。

4. 取得して HNE サンプルを処理

1. すべての科目の IRB 承認承諾・同意が得られることを確認します。
2. 緩やかな粘液をクリアする忍耐強い打撃鼻を持っています。
3. 下かを使用して鼻甲介を視覚化します。病変やポリープにサンプル コレクションを妨げることがあります現在がないことを確認します。
4. 掻爬やブラッシングによって最初の鼻孔から鼻の細胞を収集します。
   1. 掻爬: ベンド キュレット掻爬カップから頂点がわずか 〜 135^°の角度を作成する中点で。キューレットを鼻孔に挿入し、下鼻甲介の下のキュレット カップを進めます。そっと鼻甲介下に対してキュレット カップを押すし、キューレットを引いて、鼻甲介をこすり、繰り返し 3-4 回の合計します。
   2. ブラシ: パス、細胞診ブラシ下の下鼻甲介、回転し、鼻孔を終了せずわずか 4-5 回、入出庫のブラシを移動します。
5. 場所キュレット/ブラシ 15 mL の円錐形には、抗生物質のメディアでいっぱい。同じ円錐管にキュレット/ブラシを配置すること、他の鼻孔に 4.3 4.4 手順繰り返します。
6. 氷の上の処理の準備が整うまで円錐を格納します。処理サンプルの収集の 4 時間以内に発生しますできます必要に応じて取得後 24 h として遅く発生することを確認します。

5. 処理し、料理の HNE 細胞を展開

注: は、バイオ セーフティ キャビネットのクリーンな環境の下ですべての手順を実行します。

1. 同じ円錐管キュレット/細胞診ブラシのすべてのセルを洗う 1 mL ピペットと円錐形のサンプルからメディアを使用する。きれいになったら破棄用キュレット/ブラシします。
2. 360 x g と 4 ° C、5 分で円錐形遠心分離機します。
3. 細胞ペレットを邪魔しないように世話上清を吸引します。
4. 再細胞剥離溶液、均質混合物に先端が 1 mL ピペット 3 mL の細胞ペレットを中断します。
5. 360 x g と 4 ° C、5 分で円錐形遠心分離機します。
6. 5.3 5.5 の手順をもう一度繰り返します。
7. 細胞ペレットを邪魔しないように世話残りの上清を吸引します。
8. 再抗生物質メディアと診断数セルの 1 mL にペレットを中断します。
9. 3.10 準備したコーティング、線維芽細胞種の皿の上に滴下し細胞をプレート 1 mL ピペットを使用して。完全にカバー皿や分散細胞表面に抗生物質のメディアを追加します。内容と日付が付いている皿にラベルを付けるし、37 ° C、5% CO₂で孵化させなさい。
10. 48 時間後、細胞は培養皿に接続されていることを確認します。メディアを吸引し、プレートをカバーする十分な新鮮な抗生物質メディアに置き換えます。
11. 変更するメディア 3 x の週間、真空ラインとパスツール ピペット、古いメディアを吸引し、プレートをカバーする十分な新鮮なメディアに置き換えます。抗生物質メディアの 5 日後、メディアを交換して週 3 回続けて拡張メディアに変更します。
    注: 汚染リスクが高い文化の最初の週に。交差汚染のリスクを最小限に独立したインキュベーターで新鮮なサンプルを保ちます。
12. 毎週数回の細胞の成長を確認してください。細胞は約 70-80% 合流、通路のセルに進みます。

6. 通路 HNE セル

1. エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 0.1% トリプシン溶液を準備します。
   注: は、皮膚、呼吸器、眼刺激、トリプシンを扱う注意を使用します。
   1. 円錐管でブタ膵臓由来トリプシンの 15 mg の重量を量る。
   2. 別の円錐管に EDTA の 56 mg の重量を量る。
   3. 安全キャビネットのオートクレーブ 250 mL ガラスボトルにトリプシンおよび EDTA を転送します。完全な転送を確実にトリプシン EDTA/チューブを洗浄するのに滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の小さい因数を使用します。
   4. 150 mL に合計のソリューションをもたらすため滅菌 PBS を追加します。蓋をしめてください。
   5. 37 ° C 洗浄器に完全に溶解するまでにトリプシン溶液を孵化させなさい。15 分毎にチェックし、速やかに一度解散を削除します。
      注: を放置しないでくださいオフ長期間 (例えば一晩中)、長時間加熱した場合、トリプシン溶液が変化させなさいと。
   6. 2-3 70% のエタノールのスプレー ボトルをきれいにしキャビネット、バイオ セーフティに戻る。
   7. 製造元の指示を使用して 0.22 μ m PES フィルター フラスコ 250 mL の新鮮な滅菌に 0.1% トリプシン EDTA 溶液をフィルターし、日付と内容にコメントを付けます。
   8. 曇り場合破棄まで 1 ヶ月、4 ° C でトリプシン EDTA 溶液を格納します。
2. 室温 70% エタノールとクリーン バイオ セーフティ キャビネットへの移動には 30 分以上のクリーンに分化メディア、0.1% トリプシン-EDTA 溶液、滅菌 PBS をもたらします。
3. キャビネットのバイオで吸引し、細胞培養用ディッシュからメディアを破棄する真空ラインとパスツール ピペットを使用します。追加、旋回、きれいな血清ピペットを使用して PBS の 5 mL を吸引してお皿を洗ってください。
4. 5 mL の血清ピペットを使用して、細胞培養用ディッシュに 0.1% トリプシン EDTA 溶液の 5 mL を追加し、5 分で 37 ° C、5% CO₂インキュベーターに戻ります。
5. 4-10 X で倒立顕微鏡で細胞を可視化します。セルお皿からデタッチし、ラウンドになる、フロートをチェックしてください。細胞を遊離させるおよび/またはほとんどの細胞を取り外すまでさらに 5 分間インキュベート再培養皿の側を軽くたたきます。
   注: すばやく一度培養皿; から切り離されたセルを削除する注意してください。トリプシン-EDTA が低下 0.1% への長期暴露細胞生存率。
6. 10 mL の血清ピペットを使用して、皿に増殖培地 5 mL を追加し、ラベル、滅菌の 50 mL の円錐管にすべての液体の内容 (合計 10 mL) を収集します。
7. セルが残っている場合培養皿に付着、繰り返し 6.4 から 6.6 にステップ アップ 2 回、同じ円錐管の収集内容。
   1. セルが残っている場合トリプシン ソリューションへの露出の 3 つのラウンドを使用後、培養皿に付着無菌細胞スクレーパー軽く残りの部分を削除します。皿を削り後、スクレーパーと増殖培地 5 mL で皿を洗うし、同じラベルの付いた円錐管の収集します。
      注: 回転楕円体に継は、差動 trypsinization を実行するこの手順を変更します。トリプシンを追加した後、ソリューション (手順 6.4。)、チェック料理よく線維芽細胞をデタッチ (通常 1-2 分)、までだけ多角形の上皮細胞を残して皿に接続されています。収集しておきますこの上清、拡大のため前方が継代することができます。6.4 6.6 同じトリプシン溶液を使用して手順を繰り返し、回転楕円体の文化の残りの上皮細胞のみを収集します。
8. 遠心分離機の 5 分の 4 ° C 360 x g で円錐形円錐形からメディアを吸い出しなさい。
9. 拡張メディアと数の細胞、血球を使用しての 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
10. 必要に応じて細胞を分けることができます一度、定量化し、継代 (5.9 5.12 の手順の拡張用めっきと線維芽細胞の共培養、ステップ 3 の準備を含む) 新しい培養皿に転送またはスフェロイド (ステップ 7) として培養しました。
    注: 拡張、0.5-1 × 10 の播種密度の新しい培養皿に継 P100 皿に⁶セル推奨です。

7. HNE スフェロイド培養の細胞を播種

注: は、このステップでは、遠心分離、クリーン バイオ セーフティ キャビネットの以外のすべての手順を実行します。

1. 製造元の指示 (回転楕円体よくあたり 100 μ L) あたりの氷の基底膜マトリックスを解凍します。
   注: は、領収書の基底膜マトリックスの滅菌 500 μ 因数この金額は、単一 4 ウェル プレートに播きます。
2. 差動トリプシン、継代細胞 (ステップ 6.9) 行列の mL あたり 500,000 セルの最終的な集中のための適切な番号を区切ります。4 ウェル プレート 200,000 セルを使用します。1.5 mL チューブに収集します。
3. 4 ° C で 5 分間 360 x g でセルとメディアの混合物を遠心分離します。完全に、しかし慎重に吸引し、細胞ペレットを邪魔しないように世話 1 mL ピペットを使用してメディアを破棄します。
4. 1 mL のピペット チップを使用すると、セルを含む 1.5 mL チューブに基底膜マトリックスのよく計画あたり 100 μ L を追加します。氷の上の管を保ちます。
5. 上下に慎重にピペットし、基底膜マトリックス内のセルを完全に再懸濁します。行列の凝固を避けるために迅速に移動します。マトリックスのセル/ミックスに空気の泡が起きないようにピペット先端を完全に空けることは避けてください。
6. 4 よく体外受精培養プレートの各ウェルに 100 μ L 行列因数をシードします。
   1. 200 μ L ピペット チップの遠位 3-4 mm を切り落とすハサミのきれいなペアを使用して。
   2. 各井戸の中心にセル/マトリックス混合物の 100 μ L をピペット慎重にトリムの先端を使用して。各ウェルの中心部の単一マトリックス「ドロップ」を作ることを目標に、ゆっくりとピペットします。ドロップは球状、残っているし、井戸の側に触れないでください。プレートを移動する場合は、これらの低下の不安を避けるためにそう慎重に行います。
   3. 固体まで 30 分の CO₂を 37 ° C、5% で基底膜マトリックス滴を孵化させなさい。
   4. 慎重にピペットのマトリックス ドロップを邪魔しないように世話を各ウェルに分化メディアの 500 μ。行列は削除し、必要に応じてさらに追加のメディア カバーだけを確認します。

8. 差別化し、HNE 回転楕円体の成熟

1. 井戸からすべてのメディアを優しく吸引 1 mL のピペット チップを使用して、筒先のマトリックス、任意の回転楕円体を残した可能性があります実行可能に残るが、マトリックスの部分の回転楕円体を破壊します。
2. マトリックス周辺井戸に 500 μ 微分メディアを追加軽く新鮮な 1 mL のピペット チップを使用して。ピペットを持つ行列をタッチしないし、行列ドロップを妨害しません。
3. 回転楕円体を 37 ^oC でインキュベーターと継続的な成長のための 5% CO₂に戻ります。8.1 から 8.3 手順を繰り返します 3 回毎週。
4. 20 X で倒立顕微鏡下での毎日の回転楕円体の形態を評価します。回転楕円体は、めっき、3-5 日以内を形成し、約 10 日以内に成熟に達する必要があります。

9. 前処理、刺激、およびイメージ HNE 回転楕円体の分析のため

1. 前述の³⁰としてのイメージングの前に必要に応じて回転楕円体を前処理します。
   注: VX809 前処理としては、VX809 の 3 μ M をイメージ作成前 48-72 時間メディアに追加します。ミックス 10 mM の 1 μ L VX809 在庫 (材料表参照) この集中のためのメディアの 3.3 mL の。
2. 各変更新鮮な分化などのメディア、回転楕円体のイメージングの前に前処理 (ステップ 8.1 8.3) 1 mL に回転楕円体のことをよくします。
3. 新鮮な刺激薬ソリューション (フォルスコリン、3-イソブチル-1-メチルキサンチン [IBMX] VX770 と CFTR 阻害剤 172 [Inh172]) (材料表参照) にある在庫を準備します。フォルスコリン/IBMX 98 μ L の滅菌水に 1.5 mL チューブをラベル付けシングルに各銘柄の 1 μ L を追加します。VX770 と Inh172 は、独立したラベル付き 1.5 mL チューブの滅菌水の 99 μ L を各銘柄の 1 μ L を追加します。それぞれ十分にテスト用ソリューションの 50 μ L を可能にする容量を作る。バイオ セーフティ キャビネットの無菌条件下でソリューションを準備します。
4. 回転楕円体のプレートを設定し 37 ° C、5% CO₂の電子イメージをキャプチャ ソフトウェアと XY 調整のメカニカル ステージを搭載した倒立顕微鏡にマウントされている培養室に転送します。顕微鏡カメラと画像処理コンピューターをオンにします。
5. 1 つの井戸の回転楕円体のベースライン イメージをキャプチャします。
   1. 画像キャプチャ ソフト (下方向の Slidebook 5.5) を開きます。初期化した後は、「ファイル」、「新しい」をクリックして新しいファイルを開きます。それに応じてファイルの名前し、「保存」をクリック。
   2. 慎重に文化板蓋を取り外し、中央 1 つのマトリックスのドロップ目的。
   3. 顕微鏡の接眼レンズで 20 倍の倍率で回転楕円体を見つけること、グリッド内の移動マトリックス ドロップの上部に開始。最も広いポイントで球をキャプチャする上下に焦点を当てます。各回転楕円体再イメージング後識別するマトリクス ドロップ地図上の場所を指定します。
   4. ソフトウェアで、「イメージ キャプチャ」をクリックしてします。露出、「マニュアル」を選択し、50 ms の入力その他の設定が適切なことを確認 (ビン要因: 1 x 1、w: 512、h: 512、X および Y オフセット: 0).「名」ボックスを (例えば、回転楕円体 1 基準) に各イメージの適切な名前を入力します。ライブ画像を表示して「保存」ベースライン イメージをキャプチャする「スタート」をクリックします。
   5. 手順 9.5.1-9.5.4 を繰り返して目標数に達するか、マトリックス全体のドロップのイメージを作成します。
      注: 条件あたり 3-5 を回転楕円体として、いくつかのグループに差を検出できる、ただし、1 つの力を高めるための条件 10 以上回転楕円体を画像を当社の慣例となっています。試金の変動は「代表結果」セクションの例として主題ごとの 8-10 回転楕円体のサンプル、図 2で示されます。
6. 回転楕円体を刺激します。
   1. 200 μ L ピペットを使用して、マトリックスを邪魔しないように世話井戸内メディアに適切な刺激薬の 50 μ L を追加します。
      注: この 10 倍希釈 (500 μ L のメディアに 50 μ L) 後、最終的な薬物濃度になります: フォルスコリン 10 μ M、IBMX 100 μ M、VX770 1 μ M、Inh172 10 μ M。
   2. キャンプのみ、唯一フォルスコリン/IBMX を追加します。
   3. キャンプ + VX770 は、2 分後、フォルスコリン/IBMX 最初、VX770 を追加します。
   4. 抑制に対しては、Inh172 を追加、まずフォルスコリン/IBMX 2 分後。
7. 刺激した直後後、回転楕円体 1 h のタイムラプス イメージングによる膨潤を監視します。ソフトウェアで、「イメージ キャプチャ」をクリックしてします。「タイムラプス」をクリックし、30 秒、持続時間 60 分適切な名を入力して「保存」をクリックして微速度撮影を開始する間隔を設定します。
   注: 標準のタイムラプスはすべて 30 単一の回転楕円体の画像をキャプチャする高品質ビデオを確保するため s。また、(例えば4 X)、全体をしっかりと少ない画像必要な場合の低倍率キャプチャを実行します。自動ステージを使用する場合は、あらかじめ定義された座標を使用してすべての回転楕円体のタイムラプスを実行します。それ以外の場合、腫れの質的な見直しを提供し、体系的な問題がない (例えば、井戸から行列剥離)、イメージング中に回転楕円体のサブセットのタイムラプスを使用します。
8. すぐに 1 h タイムラプス画像が完了したら、すべての回転楕円体 (1 ステップ 9.5) あたりの後刺激画像をキャプチャ手順 9.5.3 で作成したマップを使用します。
   1. 前刺激画像 (セル、回転楕円体、または破片を大きく周囲の焦点の品質は、このプロセスを促進する) フォロー アップの画像の焦点の同じ平面を使用するを参照してください。
   2. 9.5.4 (例えば、回転楕円体 1 後刺激) のステップから対注釈ファイルを保存します。
      注: 回転楕円体が膨張するのにつれ、タイムラプスの直後にこの手順を完了します。
9. 新鮮な分化のメディアでも、イメージでメディアを交換してください。
10. 各井戸/条件、実験条件に示されているように、刺激薬を調整する手順 9.5 9.9 を通じてを繰り返します。
11. すべてのイメージングが完了すると、回転楕円体を 37 ° C、5% CO₂インキュベーターに返します。
    注: に応じて培養顕微鏡室の不妊、回転楕円体の後刺激汚染が非常に一般的ですることができます。交差汚染のリスクを最小限に抑えるため、別のインキュベーターでイメージ化された回転楕円体を保存するか、画像の直後に回転楕円体を破棄します。

10. HNE 回転楕円体画像を分析します。

1. キャプチャされたすべての画像を画像解析ソフトと互換性のある形式にエクスポートします。ソフトウェアで、「表示」、「エクスポート」にカーソルを置きますをクリックし、「既定のビューのすべての画像を TIFF...」を選択します。ハード ディスク ドライブまたはフラッシュ ドライブ分析のために保存します。
   注: A 商業分析ソフトウェア (材料表) および .tiff ファイルよく実行し、他のプラットフォームを使用して、解析を実行することができますが、ここで説明します。ファイルの名前付け、画像解析スタッフは、盲検で実験の条件が同等の分析を確保するためペア (前と後の刺激) 画像の認識する必要があります。
2. 解析ソフトウェアを使用すると、各回転楕円体イメージの内腔領域を表し、データ解析ソフトウェアにエクスポートします。
   1. オープンな分析ソフトウェア。「ファイル」をクリックし「開く」と回転楕円体の画像を含むファイルのフォルダーに移動します。分析のためのすべての画像を選択し、「開く」をクリックします。
   2. 「測定」をクリックし、「地域測定」を選択します。領域測定] ダイアログ ボックス内で droptab の「設定」を選択、「イメージ名」と「地域」のボックスが確認します。
   3. 「ログ」をクリックし、「データ ログを開く」を選択します。ファイルをクリックして"OK"データ ログ対話ボックスと名に応じて (例えば条件 X、日付)。すべての測定値をスプレッドシートに転送されます。
   4. 「トレース地域」ツール ボタンを選択し、分析ため最初イメージの回転楕円体内腔慎重にトレース。領域測定ダイアログ ボックスで Excel に測定を記録する「ログ データ」をクリックしてします。
   5. 手順 10.2.2-10.2.4 を繰り返してすべての回転楕円体を分析します。
3. 変化率を計算する (100 * [ポスト スティミュラス ベースライン] ÷ 基準) それぞれの個々 の回転楕円体のベースラインから内腔領域でペアをイメージし、分析用のデータをコンパイルします。

結果

HNEs が培養皿に添付し、細胞播種; の 72 時間以内の小さな島々 を形成それぞれ図 1 a 1 b、1 週間で良いと貧しい島形成の例のとおりです。これらの島々 を 15-30 日のコース料理をカバーするため展開する必要があります。小規模または次善のサンプルは、かかることがあり、しばしば便利な回転楕円体は得られません。感染性病原体による汚染は、深い黄色/曇りメディア、培養皿にアタッチする細胞の障害および/または菌類・細菌の直接可視化によって証明されます。任意の汚染された文化は、クロス汚染を避けるために直ちに破棄しなければなりません。

基底膜マトリックスにおける文化の最初の 3-4 日内小嚢胞構造はマトリックス内のフォームが開始されます。これらは、薄い壁と内腔表面を示すそのまま回転楕円体に約 10 日間で成熟します。前述の電力密度でメッキ、成功した文化にマト...

ディスカッション

このプロトコルでは、患者由来鼻細胞スフェロイド培養「CFTR 機能個別の特定モデルを生成することができるの生成について説明します。難しさを避けるために密接に出席する必要がありますプロセスでいくつか重要な手順があります。まずは患者さんの鼻から良いサンプル集録です。良いサンプルがあるはず > 50,000 セルは、粘液/破片の限定および 4 時間以内 (ただし、成功は、一晩氷で送料も簡単に達成) を処理するために準備ができています。研究スタッフがブラシやキュレット検体身につける練習は彼らの慰めを最大にする 1 つまたは 2 つのプロバイダーの手に初期サンプルの取得に焦点を当て、促進が必要です。ティッシュ文化のすべての手順の 2 番目、良いクリーン/生殖不能の技術は不可欠です。すべて HNE 文化のため、我々 の経験で、障害が発生したプライマリ ・ モードは、主なサンプルとインキュベーターの他の成長の文化の両方を複雑にすることができます細菌や真菌の汚染です。このリスクの慢性感染症 (例えばCF) 被験者の文化とだけ増加、したがって成功ヒンジ主かつ独立した文化を維持する能力。私達の練習は不注意な汚染から成功した、古い文化を保護...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL Eppendorf Tube	USA Scientific	4036-3204
150 mLフィルターフラスコ	ミッドサイエンス	TP99150	メディア
15 mLコニカルチューブ	ミッドサイエンスをろ過するには
1Lフィルターフラスコ	Midsci	TP99950	メディアをろ過するには
35 mm ガラス底皿	MatTek Corporation	P35G-0-20-C	オプション
3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX)	Fisher Scientific	AC228420010	1 mLのDMSOに22.0 mgの100 mMストック溶液を調製
50 mLコニカルチューブ	ミッドサイエンス
アキュターゼ	・イノベーティブ・セル・テクノロジーズ(株)	AT-104	細胞剥離液
アデニン	Sigma-Aldrich	A2786-25G	表1参照
アムホテリシン B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG	表1参照
ウシ脳抽出物(9mg/mL)	ロンザ	CC-4098	表2参照
セフタジジム水和物	Sigma-Aldrich	C3809-1G	表1参照
セルスクレーパー 20cm	ミッドサイエンス
CFTR Inh172	Tocris Bioscience	3430	1mLに4.0mgの10mMのストック溶液を調製
			1を参照してください
CYB-1	メディカルパッケージングコーポレーション	CYB-1	学ブラシ
メチルスルホキシド(DMSO)	シグマアルドリッチ	D5879-500ML
ダルベッコのモディファイドイーグルメディア(DMEM)/F12ヘペス	ライフテクノロジーズ	11330-057	ベースミディアム;表1および表2を参照してください
上皮成長因子(組換えヒトタンパク質、動物由来フリー)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHG6045	1を参照してください
エピネフリン	シグマ-アルドリッチ	E4250-1G	表2を参照してください
エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	2701
エタノールアミン	Sigma-Aldrich	E0135-500ML	16.6 mM溶液;表2エ
チレンジアミン四酢酸(EDTA)	TCIアメリカ を参照してください。	E0084
ウシ胎児血清(高性能FBS)	Invitrogen	10082147	表1を参照
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886-50	mL に 4.1 mg の 10 mM ストック溶液を調製
	。	356231	Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix、フェノールレッドフリー、LDEVフリー、10 mL。
血球計算盤	Hausser Scientific	1483
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL)	Advanced BioMatrix	5007-A	Collagen solution
HyClone (aka FetalClone II)	GEヘルスケア	SH30066.03HI	表2参照
ヒドロコルチゾン	StemCell Technologies	07904	表1および2参照
インスリン、ヒト組換え、亜鉛溶液	Life Technologies	12585014	4 mg/mL 溶液; 表 2
IVF 4 ウェル ディッシュ、未処理	NUNC (フィッシャー サイエンティフィック経由)	12566350	スフェロイド用 4 ウェル プレートを参照; 24 ウェル プレートと同様のウェル サイズ
MEF-CF1-IRR	Globalstem	GSC-6001G	照射マウス胚性線維芽細胞
Metamorph 7.7	分子デバイス		分析ソフトウェア;引用 https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software
オリンパスIX51倒立顕微鏡	オリンパス株式会社	イメージング顕微鏡を廃止	しました。交換:オリンパスIX53、https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ 引用については
、Strep	Life Technologiesのペン	15140122	表2を参照
フソフリルレテアノールアミン	Sigma-Aldrich	P0503-5G	表2を参照
レチノイン酸	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	表2を参照
Rhinoprobe	Arlington Scientific, Inc.	96-0905	鼻用キュレット
Slidebook 5.5	3i, Intelligent Imaging Innovations	Discontinued	Imaging Software.交換: スライドブック 6、見積もりの https://www.intelligent-imaging.com/slidebook
滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	20012050
滅菌水	Sigma-Aldrich	W3500-6X500ML
組織培養皿 100	テクノプラスチック製品	93100	拡張用組織培養皿
トブラマイシン	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	表1参照
トランスフェリン(ヒトトランスフェリン0.5mL)	ロンザ	CC-4205	表
2 トリヨードスリョニン	Sigma-Aldrich	T6397-1G	3,3′,5-Triiodo-L-thyronine ナトリウム塩 [T3];表2を参照してください
ブタのトリプシン、ブタ、膵臓、	Sigma-Aldrich	T4799-10G
、Ultroser-G	、Crescent Chemical(Fisher Scientific経由)	NC0393024	20mLのリポフィリゼ粉末。表2参照
Streptomyces orientalis	Sigma-Aldrich	V2002-5G	表1参照
VX770	Selleck Chemicals	S1144	DMSO 1 mLに0.4 mgの1 mMの原液を調製
VX809	Selleck Chemicals	S1565	1 mLに4.5 mgの10 mM原液を購入または調製
。ROCK阻害剤	エンツォ・ライフサイエンス	ALX-270-333-M025	表 1 を参照してください