ここで rootworm 胚生殖細胞変換や CRISPR/Cas9-ゲノム編集など機能ゲノム試金の実行の目的のため収集、マイクロインジェクション precellular 西部のトウモロコシのためのプロトコルは提示します。
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方法論記事
マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集
この記事について
サマリー
要約
西部のトウモロコシ rootworm (WCR) トウモロコシの重要害虫であり害虫管理戦略に迅速に適応する能力があることが知られています。RNA 干渉 (RNAi) WCR 生物学を勉強するための強力なツールであることを証明している、それはその限界を持っています。具体的には、RNAi 自体は一時的なもの (すなわちわけで関連する表現型の長期的なメンデル遺伝)、それはターゲット遺伝子の DNA 順序を知る必要があり、。後者ために制限があります興味の表現型が悪い、節約またはも新規の遺伝子によって制御される場合便利なターゲットの識別に挑戦するが、不可能ではない場合。WCR のゲノム] ツールボックスのツールの数は、安定した突然変異系統を作成し、WCR ゲノムのシーケンスに依存しない調査を有効にするために使用できる手法の開発が拡大する必要があります。ここで、収集し、核酸 precellular WCR 胚を microinject するために使用方法を詳しく説明します。ここ記載されているプロトコルは、トランスジェニック WCR の創出を目指したが、一方 CRISPR/Cas9-ゲノム編集も実行でした唯一の違いは、胚に注入液の組成と同じプロトコルを使用しています。
概要
西部のトウモロコシ rootworm (WCR)、Diabrotica virgifera virgifera、トウモロコシ1の重要な害虫であります。興味深いことに、WCR のコントロールを克服するよう措置最も農業害虫よりも急速に以来、彼らだけでなく適応だけでなく、生理学的行動2,3,4,5, 6. 過去 10 年間、RNA 干渉 (RNAi) 強力な機能ゲノム ツール WCR7、8、潜在的な制御法として研究されている、遺伝子機能9を研究手段としても使用されています。しかし、RNAi は頻繁に他の種における二本鎖 rna (dsRNA) によって実行される、インジェクション ベース RNAi は WCR にまれであります。実際、dsRNA の WCR9にマイクロインジェクションによるRNAi の報告は少ないがあります....
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プロトコル
1. コロニー レベル WCR 大人の飼育
- WCR 大人の十分な量を取得 (500-1,000) 信頼性の高い会社や研究所から (例のための参照材料表) し、30 cm3ケージに配置。
注: 非休眠株の使用は強くお勧めします。 - WCR 人工飼料メーカーのプロトコル、次を準備し、38 オンスの容器に 1 cm 厚層を注ぐ (材料の表を参照してください)。混合した後、2 ヶ月未使用ダイエット 4 ° C で保存します。
- 大人の食事 (10-15 g) とペトリ皿 (100 × 15 mm) を 30 cm3ケージに入れます。低または乾燥食品より多くの食事を追加します。
- 水の源として水、コットン ロール (6"x 3/8")、提供する場所に保持するために使用する綿球で覆われているとフラスコ (300 mL) を置きます。低実行するときは、水を変更します。
- 26 ° C 湿度 60% で WCR を維持し、14:10 光インキュベーターを飼育昆虫のサイクルします。
2. 胚のコレクションおよび配置
- シャーレの滅菌 100 × 15 mm2水 1% 寒天を用いた卵コレクション区域を作る。寒天が固化した後、4 ° C で....
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結果
このプロトコルを開発するときの重要な考慮事項は、マイクロインジェクションの時に萌芽期の開発の段階をだった。具体的には、生殖細胞系列変換は萌芽期の cellularization の前に dna マイクロインジェクションを必要です。これは、Dna が細胞膜を容易に通過できないためにです。WCR 胚の dechorionation は本質的にすべての胚の完全性に責任がある保護膜を溶解するため、WCR 核染色を使用して萌芽期の開発の段階を視覚化する試みは成功しなかった。ただし、このラインの問い合わせは、タイムリーに胚の十分な量を取得 – 別の難しさに取って代わられました。フィールドに、WCR 女性は土に卵を産む、従ってそれ驚きべきである、演習では、女性のみ卵を産む暗闇の中。これは短い昼間コレクション (2-4 h) を困難になります。この問題を克服するために単一の一晩卵レイは行ったし、胚の大量をもたらすことがわかった。(図 1) を収集し、インジェクションのため (図 2
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ディスカッション
これはマイクロインジェクション precellular WCR 胚生殖細胞への変換を行うための重要なプロセスのためのベストプラクティスを確立する最初のプロトコルで RNAi を目的として二本の WCR のマイクロインジェクション報告9がずっと、および/またはこの種の編集 CRISPR/Cas9 ゲノム。WCR 胚の正常なマイクロインジェクションは、変換効率は、多くの要因に依存しています。後述はいくつかの主要な問題に影響を与えるこのカブトムシの生殖細胞の変形のためのプロトコルを使用しての結果。
Precellular 胚を取得
前述のように、DNA は方法 dsRNA が細胞膜を交差させない。つまりは重要な重要性の DNA、mRNA やタンパク質が前に cellularization を注入します。射出のタイミングが重要なので nondiapausing WCR ひずみ30胚形成を完了するのにかかる時間に基づく成功のインジェクションの可能性があります.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、モンサント社のトウモロコシ Rootworm 知識研究プログラムからの助成金によって支えられた、NCSU から MDL に番号 AG/1005 (MDL と YC) してスタートアップ資金を与えます。(MDL) に番号 MCB 1244772 を付与する FC は、モンサント社のトウモロコシ Rootworm 知識研究プログラム (AG/1005)、全米科学財団からの助成金によって支えられました。著者は競争の興味を宣言しません。FC と MDL の考案設計実験;FC、PW、SP で行う実験。FC と MDL の分析結果FC、NG、MDL は原稿を書いていた。WCR のスクリーニングでの専門的な支援、テレサ o ' leary、ウィリアム Klobasa とステファニーと感謝します。我々 はまた飼育プロトコルを提供するラボのコロニーを確立する卵の出荷のため博士のウェイドのフランス語 (農務省、北中央農業研究所、ブルッキングズ, サウスダコタ) を感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 定性的濾紙(ブラック) | Ahlstrom | 8613-0900 | 卵マイクロインジェクション用 |
| 1オンス容器 | Anny's プラスチック食器 | ASET101 | 卵容器 |
| ショウジョウバエ寒天 II 型 | Apex | 66-103 | WCR 産卵皿用基板 |
| フェザーウェイト鉗子 | Bioquip | 4748 | 虫と蛹の取り扱い |
| クロロックスレギュラーブリーチ1 | クロロックス | 44600-30770 | ウォッシュコーンと皿 |
| のお気に入りのイエロー | クアファームサプライ | 502 | ますWCR |
| マイクロインジェクションシステム(自家製) | NA | 部品&説明書ご要望に応じて利用可能な | 制御注入圧力(0-20 psi) |
| エルマーの非毒性接着剤 | エルマーズプロダクツ株式会社 | E304 | 濾紙に卵のり |
| epTIPS マイクロローダー | Eppendorf | C2554691 | 埋め戻し針 ローディングのヒント |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | 発芽トウモロコシ /150 x 25 mm |
| Fisherbrand 定量的グレードの濾紙サークル | フィッシャーサイエンティフィ | S47576C | 卵産卵用の寒天皿を作る/9cm |
| スパークリーン | フィッシャーサイエンティフィック | 04-320-4 | ウォッシュディッシュ |
| プレーン顕微鏡スライド | フィッシャーサイエンティフィック | 12-549-3 | マイクロインジェクション用の濾紙と卵の保持 |
| ウエスタンコーン 根虫 花粉なし 代替 | フロンティア 農業科学 | F9766B | WCR大人の人工ダイエット |
| コットンボール、大型 | ジェネシーサイエンティフィック | 51-101 | スコを閉じる |
| グローブサイエンティフィック3.0mL小型電球トランスファーピペットグローブ | サイエンティフィ | ック137035 | を収集して転送ライ |
| カM165FC蛍光実体顕微鏡 | ライカ | M165 FC | WCR上映 |
| 蛍光実体顕微鏡用DsRedフィルターセット | ライカ | DSR | 励起フィルター:510-560 nm、蛍光フィルター:590-650 nm |
| EGFPフィルター | ライカ | GFP2 | 起フィルター:440–520 nm、発光フィルター:510 nm |
| BugDorm | MegaView 成 | 体コロニー用 | DP1000_5P |
| ミニチュアペイントブラシ | MyArtscape | MAS-102-MINI | ライナー 2/0 |
| ジョイスティックマイクロマニピュレーター | 成重 | MN-151 | マイクロマニピュレーター&ニードルホルダー |
| 顕微鏡XYステージ | オリンパス | 265515 | 顕微鏡ステージ(ステレオスコープ使用に適応) |
| グレード90 チーズクロス | オンラインファブリックストア | CHEE90 | 卵産用 |
| プラスチックパラフィンフィルム | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | マイクロインジェクション後の寒天皿を密封/ロール サイズ 4 インチ x 125 フィート |
| パーシバル インキュベーター | パーシバル | I41VLH3C8 | WCR成長チャンバー(昆虫飼育インキュベーター) |
| ナローマウス三角フラスコVWR | 4980-300-PK | 成体コロニー用水容器 | |
| グリフィンローフォームビー | カーVWR | 1000-600-PK | 卵洗浄編 |
| 組コットンロールス | モンドデンタルコットン株式会社 | 605-3599 | 成体コロニーの給水での使用 |
| ペトリ皿 (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | ダイエットプレート用 |
| フェノールレッド | シグマ | 143-78-8 | マイクロインジェクションバッファー |
| レーザーベースマイクロピピエットプーラー | サッター器具 | P-2000/G | ニードルプーラー/熱=335、FIL=4、VEL=40、DEL=200、PUL=100 |
| プレミアム表土 | スコッツ社 | 71130758 | クロン栽培 |
| 用土壌Relocジップピット2ミルジッパーバッグ | 米国プラスチックコーポレーション | 48342 | バッグ寒天皿マイクロインジェクション/ 5x7 |
| ペトリ皿(100x15m) | VWR | 89038-968 | 卵産卵用寒天皿/ 100 x 15 mm |
| 6オンスコンテナ | Webstaurantstore | 128E506 | WCRシングルペア嵌合チャンバー |
| 38オンスコンテナ | Webstaurantstore | 128NC888 | 虫飼育ボックス/38オン |
| スChoiceHD 16オンス電子レンジ対応半透明プラスチックデリコンテナ | Webstaurantstore | 128HRD16 | 虫飼育ボックス/16オン |
| マイクロインジェクションスコープ | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | XYステージを装備したマイクロインジェクションスコープ |
| 標準ガラスキャピラリー | ワールド精密機器 | 1B100F-4 | マイクロインジェクション針 |
| 大人のウエスタンコーン 根虫 | ノースセンターアクリカルチャー研究 研究室 | 非ジアパーゼ株 | ブライアン・ウェイド博士からのリクエスト フレンチの研究室 |
| プラスミドDNA MIDIキット | キアゲン | 12143 | 注射用プラスミドDNAの精製 |
参考文献
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W.
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