作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウム イオン選択的な電極を使用して

Summary

カリウム イオンは細胞の静止膜電位に貢献し、細胞外の K⁺濃度細胞興奮性の重要な調節因子であります。確認、調整、モノポーラ K⁺を使用する方法について説明-選択的な電極。そのような電極を使用すると、大人の海馬スライスにおける電気的誘発 K⁺濃度動態の測定ができます。

Abstract

カリウム イオンは細胞の静止膜電位に貢献し、そのため、細胞外の K⁺濃度は細胞興奮性の重要な調節因子。活動電位の根底にある電位依存性イオン チャネルのクローズ、オープン、不活化状態間の平衡をシフトすることによって静止膜電位および細胞内興奮性細胞外の K⁺影響の濃度を変更発生と伝導。したがって、健康と病気にかかった状態で細胞外の K⁺のダイナミクスを直接測定する貴重なです。ここでは、確認、調整および単極 K⁺を使用する方法について述べる-選択的な電極。我々 は電気的誘発 K⁺濃度動態を測定する成体海馬スライスで展開します。そのような電極の賢い使用は神経系における細胞外の K⁺の濃度を制御する細胞および生物物理学的メカニズムを評価するために必要なツール キットの重要な部分です。

Introduction

カリウム イオンの濃度が脳内で堅く調整され、それらの変動はすべての細胞の静止膜電位に強力な影響を及ぼします。これらの重要な貢献の観点から、生物学の重要な目標は、¹体のさまざまな器官の細胞外スペースでしっかりと K⁺の濃度を調節するために使用する細胞および生物物理学的メカニズムを決定することです。^,2。 これらの研究で重要な要件は、K⁺濃度を正確に測定する能力。健康と病気の状態では、脳でカリウムの恒常性に貢献する多くのコンポーネントされているが、識別された^3,4、5、さらに進行中の専門にされた性質のため抑制されていますカリウム測定用イオン選択性電極の準備。電極センサーを表す K⁺濃度の in vitro組織スライスのin vivo測定のゴールド スタンダード。

監視 K⁺のための新しいアプローチがしかし、これらは生物学的関連性の高い範囲の K⁺濃度を検出しないまたはない吟味されている完全に生体が光センサーを使用して開発中の最初の結果有....

Protocol

すべての動物実験は、ケアと実験動物の使用のため国立の研究所に従って健康ガイドを実施し、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で一等書記官の動物研究委員会によって承認されました。すべてのマウスは、12 h 光暗い環境で食料や水の利用可能な自由で収容されました。すべての動物は明らかな行動変化と健康だったが以前の研究に関与していない、ライト サイクルの犠牲になった。実験のデータは、成体マウス (6-8 週間すべての実験のために古い) から収集されました。

1 K⁺の選択的な電極の作製

1. ホウケイ酸ガラスのシリル化
   1. 包装から十分なガラス管を取り外し、50 mL の円錐管に入れます。穏やかな撹拌一晩塩酸または最低 6 時間で 1 M 塩酸洗浄電極上部に円錐形の管を埋めます。
   2. 70% エタノールで毛細血管を簡単に洗浄し、6-8 時間 100-120 ° C で完全に乾燥します。さらに使用する前に最大 4 週間の無水カルシウム硫酸塩の乾燥剤を容器に洗った毛細血管を格納します。
   3. シリル化、前に電極の引き手を使用してファインチップに毛細血管を引き出します。使用する電極は、直径約 2-5 ミクロンです。皮膚からオイルがシリル化を妨げることができます常に手袋で洗った毛細血管を処理します。
   4. 電極が先端の破損を防ぐために下から上昇しているので、ガラスの容器に電極を配置し....

Results

細胞外 K⁺の選択的測定のきれいなホウケイ酸ガラス ピペット (図 1 a) のシリル化による疎水性の層で被覆されたイオン選択性電極を作製しました。このコーティングにより、バリノマイシン電極の先端に置き、電極先端 (図 1 b) の狭い開口部を通って K⁺フラックスのみを許可するを含む K⁺イオノフォアです。埋食塩と K⁺イオノフォア電極をプライミング後バス K⁺濃度 (図 3 a) の段階的な変化に彼らの急速なと線形応答への応答として、電極はテストできます。バス K⁺は、生理食塩水の調整範囲内 (図 3 b) で変更またはネルンスト式²によって予測された方法.......

Discussion

ここで説明するメソッドを使用して、K⁺大人のマウスから急性海馬スライスでシャファー側枝の電気刺激に対する応答のダイナミクスを評価するためができました。K⁺イオン選択的な電極を準備するための手法は、以前記載されている手順^12,13,14,15に似ています。ただし、このメソッドでは、迅速であり、K⁺の選択的な電極を準備するために複雑で、代替電極構成上の利点をします。適切な校正後しっかり電気刺激中にスライスの K⁺のダイナミクスを測定するこれらの電極が見つかりました、そのような応答は TTX によってブロックされました。これらの実験では 10 Hz で 80 160 uA の刺激は使用された;ただし、特定の実験のため、興味の脳領域の刺激条件の最適化が必要になります。これらの値は、ガイドとして表示されます.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ビブラトーム	DSK	マイクロスライサー Zero 1
マウス C57BL/6NTac 近交系マウス	タコニック	ストック#B6
顕微鏡	オリンパス	BX51
電極プーラー	サッター	P-97
Ag/AgCl 粉砕ペレット	WPI	EP2
pCLAMP10.3	分子デバイス	n/a
カスタムマイクロフィル28Gチップ	精密機器	CMF28G
タングステンロッド	AMシステム	716000
バイポーラ刺激電極	FHC	MX21XEW(T01)
刺激アイソレータ	世界の精密機器	A365
S88刺激装置	グラスインスツルメンツカンパニーS88
ホウケイ酸ガラスピペット	世界の精密機器	1B150-4
AからDボード	Digidata 1322A	Axon Instruments
信号増幅器	マルチクランプ 700Aまたは700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
パッチコンピュータ	Dell	n/a
塩化ナトリウム	シグマ	S5886
カリウム	シグマ	P3911
HEPES	シグマ	H3375
炭酸ナトリウム	シグマ	S5761
ナトリウム一塩基性	シグマ	S0751D
-グルコース	シグマ	G7528
カルシウム	シグマ	21108
塩化マグネシウム	シグマ	M8266
ノマイシン	シグマ	V0627-10mg
1,2-ジメチル-3-ニトロベンゼン	シグマ	40870-25ml
カリウムテトラキス(4-クロロフェニル)ホウ酸	シグマ	60591-100mg
ヘプタン中の5%ジメチルジクロロシラン	シグマ	85126-5ml
TTX	ケイマン化学会社	14964
塩酸	Σ	H1758-500mL
ショ糖	Σ	S9378-5kg
ピペット マイクロマニピュレーター	サッター	MP-285/ROE-200/MPC-200
対物レンズ	オリンパス	PlanAPO 10xW