分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

サマリー

ここでは、アダルト住血吸虫から培養体外細胞小胞 (Ev) の分離を記述するプロトコルを提案する.

要約

細胞小胞 (Ev) は、膜小胞の細胞外微小環境に様々 な細胞によって放出です。EVs は、異種の小胞の人口は 40 と 1,000 nm 間のサイズの範囲を表しています。蓄積された証拠は、EVs がホスト病原体の相互作用で重要な規制の役割を果たすことを示した。住血吸虫の EVs の深い理解は、住血吸虫ホスト相互作用、住血吸虫症に対する新しい戦略の開発を有効にするメカニズムに洞察力を提供しなければなりません。ここでは、さらにアダルト日本住血吸虫(S. ササユリ) から分離・同定 EVs のためのプロトコルを提示による住で EVs 機能を研究を目指しています。EVs は体外培養液遠心商業エキソソーム分離キットと組み合わせての使用から分離しました。分離されたs. ササユリEVs (SjEVs) は通常 100-400 nm の直径を持つし、透過電子顕微鏡と西部にしみが付くことによって特徴付けられます。PKH67 色素標識 SjEVs の使用は、SjEVs は受信者の細胞によって内面化を実証しています。全体として、我々 のプロトコルは大人住; から EVs を分離するための代替方法を提供します。分離 SjEVs の機能解析が適さない場合があります。

概要

細胞小胞 (Ev) は、様々 なタンパク質、脂質、核酸でカプセル化されます小さな膜結合型ベシクルの人口です。EVs が細胞間の情報伝達に重要な役割を果たして、細胞の分化、免疫調節、血管新生、セル移行^{2など多数の生理学的なプロセスの規則にかかわる最近の研究を実証 3,4,5}。証拠の蓄積は、EVs を, 循環エクソソーム、および miRNA 貨物が特定疾患⁶の潜在的なバイオ マーカーを表すことを示します。

トリコモナス、 cruzi トリパノソーマの原因、リーシュ マニア属などのいくつかの原生動物、EVs; を分泌することができることが示されている。寄生虫が見つかってまた⁷をホストの生活に EVs を分泌します。寄生 EVs 感染、病原性⁸、および免疫調節⁹の維持に関与することが示されています。住での最近の調査は両方のマンソン住血吸虫(マンソン住血吸虫など

プロトコル

上海中国農業科学院獣医研究所倫理委員会で承認されたすべての動物実験 (許可番号: SHVRIAU-14-0101)。

1住の体外培養。

注:住は、バイオハザードを表しています。労働者は関連生物学的材料をワーム、感染後懸濁液、または他を処理する場合もすべてのラテックス手袋を着用ください。ニュージーランドのウサギは、腹部の被曝経由~ 2,000 セルカリアに感染していた。肝の段階で住は肝臓と腸間膜静脈の血流で 28 日後の感染症で米住血吸虫セルカリアに感染ウサギから収集されました。ワーム コレクションのプロシージャは、マウス¹⁸研究報告以前の出版物で参照されています。

1. 500 mL ビーカーに寄生虫を収集します。それらを徹底的に洗浄し、200 ml の軽く 3 倍予熱 (37 ° C) PBS (pH 7.4)。
2. 各 90 mm のシャーレの ~ 200 ワームのペアを区切ります。寄生虫を徹底的に洗うし、軽く 2 倍の 50 mL の予熱 (37 ° C) RPMI 1640 培養液中のペニシリンとストレプトマイシンの 100 mg/mL 100 U。
3. 37 ° C 未満 5 %90 mm ペトリ....

結果

記述のプロトコルを使用して孤立した SjEVs の収量を定量化するには、28 日アダルト住から分離された SjEVs の蛋白質の集中をアクセスするのに BCA タンパク質アッセイを使用しました。表 1に示すように、SjEV 蛋白質の集中は媒体 (表 1) の 100 mL あたり 250 μ g 208 μ g からであった。粒子サイズ モールヴァン ナノ粒子解析によって決定される表示分離 SjEVs が 100 であった nm ~ 400 nm、最高の人口約 220 nm の (図 1)。透過電子顕微鏡による SjEVs のさらなる特性 (図 2) の直径の約 100-200 nm の丸い小胞に EVs を明らかにしました。ウエスタンブロット分析表示、分離 SjEVs 認め CD63 抗体を用いた典型的な EV マーカー (図 3

ディスカッション

Ev に関する最近の研究は、EVs は、宿主-病原体相互作用^3,9,12,16で重要な役割を果たす、住血吸虫を実証しています。さらにアドレスに規制機能のそれは住から EVs を分離するため不可欠であります。ここでは、SjEV の分離のための代替方法をについて説明します。このメソッドは、100 から、SjEVs の広い範囲のサイズを生成 nm ~ 400 nm、アダルトs. ササユリ。次の細胞取り込みアッセイでは、EVs の記述の議定書の下で分離された正常に受信者の細胞によって内面化されたことと、関連付けられている Mirna が潜在的規制の役割¹⁷を再生を示されています。

EVs は、可能性がありますは、さまざまな種類の細胞によって分泌され、体液

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Material
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)	ThermoFisher SCIENTIFIC	4478359	S. japonicum細胞外小胞の単離用
PKH67	Sigma-aldrich	MINI67	ラベリング用
Evs RPMI 1640 Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC	11875119	寄生虫培養用
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャー SCIENTIFIC	15140122
0.22μmシリンジフィルター	Merck	SLGP033RB
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo SCIENTIFIC	68035
PEG8000	Sangon Biotech	A100159
RIPA	Beyotime	P0013B
EMDミリポア™イモビロン&トレード;ウェスタン化学発光HRP基質(ECL)	Fisher scientific	WBKLS0100
DAPI	細胞シグナル伝達技術	4083
BCAキット	Beyotime	P0010
CD63抗体	Sangon Biotech	D160973-0025
PVDF	Bio-Rad	1704273
Formvar/Carbon 400メッシュ	Ted Pella	01754-F
Phosphotungstic Acid	Ted Pella	19402
抗マウスIgG-HRP	CWBIO	CW0102
NCTCクローン1469細胞	ATCC	ATCC®CCL-9.1&トレード;
FBS	HyClone	SV30087.02
Equipments
GE 化学発光イメージングシステム	GE	ImageQuant LAS4000mini
透過型電子顕微鏡	Hitachi	H-7600
Milli-Q water	Milli-Q	Milli-Q Elix
Eppendor遠心分離機	エッペンドルフ	遠心分離機 5804R
ゼータサイザー ナノ	マルバーン	ゼータサイザー ナノ ZS
超遠心分離機	Beckman	Optima L-100 XP 超遠心
インキュベーター	ESCO	CCL-107B
顕微鏡	Zeiss	Zeiss Axin Observer Z1