ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア リング方法を提示します。
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方法論記事
迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
クラスター化された定期的に散在させていて回文繰り返し (CRISPR) - CRISPR - に関連したタンパク質 9 (Cas9) 原核生物の適応免疫の防衛システムが抱き込まれてしまった正確な真核生物ゲノム工学のための強力なツールとして線虫のゲノムの点変異の効率的で正確な世代キメラ シングル ガイド Rna (sgRNA) と CRISPR Cas9 Ribonucleoproteins (結合) を使用して迅速かつ簡単な方法を紹介します。SgRNA ターゲットの選択、ホモロジー監督修復 (HDR) テンプレート デザイン、CRISPR Cas9 RNP 錯化と配信、および正しく編集した動物の堅牢かつ迅速な同定を可能にする遺伝子型戦略のパイプラインについて述べる。我々 のアプローチは、変異動物安易な世代とゲノムの任意の場所の同定が可能だけでなく、高効率および減らされたスクリーニング作業負荷で約 4-5 日で他の複雑な塩基の対立遺伝子の検出を容易にも。
概要
最近の技術の進歩が根本的に形質転換し、正確にエンジニアのゲノムに能力を加速します。特に、RNA 誘導エンドヌクレアーゼの興味のターゲット シーケンスに近い二重鎖切断 (DSB) を誘導する Cas9 に頼る、CRISPR Cas9 システムは広くモデル有機体の使用の大半のゲノムを正確にエンジニアに使用されています生物医学研究1,2,3,4。大幅に CRISPR Cas9 の使用は、ゲノムはc. の elegans5のような困難な種でも編集ロックを解除が。種に関係なく編集システム基づく CRISPR Cas9 ゲノムと点突然変異を生成する 3 つのコア コンポーネントに依存しています: 1) Cas9 エンドヌクレアーゼ、ターゲット シーケンスと 3) 設計ユーザーに Cas9 エンドヌクレアーゼを指示する 2) シングル ガイド RNA (sgRNA)2興味の目的の編集を含むホモロジー監督修理 (HDR) テンプレートです。
ターゲットの sgRNA と Cas9 を紹介するために使用できるいくつかの方法がある....
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プロトコル
すべての動物の世話と実験手順は、国立衛生研究所と動物介護施設使用委員会 (IACUC)、ミシガン大学からガイドラインを追った。RNase フリー ソリューションを使用して、ピペットのプロトコル全体のヒント。RNase 除染液が製造元のガイドライン (表を参照)、次に作業領域、ピペット、チューブ、および遠心分離機をきれい。
1. sgRNA ターゲットの選択
- Web ブラウザーを使用して web ページを開く: http://crispor.tefor.net8
- 興味の目的の編集を並ぶシーケンスの ~ 60 塩基対 (bp) を入力 (つまり30 bp 5' と 3' の目的の編集)。
- 線虫ゲノムをプルダウン メニューから選択します。
- Protospacer 隣接するモチーフを選択 (20 bp NGG - SpCas9、SpCas9-HF1、eSPCas9 1.1) プルダウン メニューから。
- [送信] をクリックします。結果ページで、関心の編集に最も近い上位ランク ターゲット シーケンスを選択します。並ぶ 60 bp 入力シーケンス内の適切なターゲット ・ サイトがない場合は 100 までクエリ シーケンスを展開 bp (すなわち50 bp....
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結果
人間スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) の変異は、家族性筋萎縮性側索硬化症、麻痺と死の17に必ずや壊滅的な神経変性疾患の 10 ~ 20% を占めます。ヒト SOD 1 です (図 1 b) c. の elegans SOD 1 タンパク質と 55% のアイデンティティおよび 70% の類似性を共有進化上保存されたタンパク質です。シンプルさ、可能性、CRISPR Cas9 RNP ベースのアプローチの効率を示すためには、ワームのゲノム (図 1 a) 疾患関連の人間 G93A バリアントを紹介する線虫 sod 1遺伝子を対象とします。
線虫ゲノム G93A 変異をエンジニアに、sgRNA が選ばれたが P.......
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ディスカッション
CRISPR Cas9 システムのモデル生物のゲノムを正確に変更するための強力かつ効果的なツールです。ここでは、そのキメラ sgRNAs20と相まって ssODN HDR 有効テンプレートに線虫の遺伝子の点変異の高効率生成を示します。重要なは、示す共同選択マーカーとして使用する蛍光 RNP 配信が編集効率を生成する使いやすさと手法の信頼性を強調.
線虫ゲノム工学 CRISPR Cas9 メソッドの大半は、特定の遺伝的背景や co CRISPR 戦略1に依存します。Co CRISPR メソッドは、成功したゲノム編集を得ることの可能性を増加させる非常に便利なツールであると証明しました。しかし、co CRISPR メソッドは豊かに関心のゲノム編集用マーカーの軌跡で表現型が選択可能な編集を導入することを必要です。一方、強力な選択可能な表現型ベアリング変異導入望ましくないかもしれない場合編集するひずみまたは自体興味の目的の点突然変異表現型悪化またはマーカーの表現.......
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開示事項
頼むこの原稿の批判的研究室のメンバーに感謝いたします。系統は、線虫の遺伝学センター研究インフラストラクチャ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。頼む研究室での研究は NIH (R01 NS094678) や筋ジストロフィー協会 (MDA382300) からの補助金によってサポートされて A.A.B. に
謝辞
このレポートに関連する利害の関係はありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| CRISPRevolution sgRNA EZキット | シンテーゴ株式会社 | キメラsgRNA | |
| ヌクレアーゼフリーTE | Synthego Inc. | sgRNAキット、EZキット | |
| Nuclease free water | Synthego Inc.に | sgRNAキットに付属 EZキット | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDRテンプレート | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9タンパク質 |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherryマーカープラスミド |
| KCl | シグマ | P5405 | |
| HEPES | シグマ | H4034 | |
| DNAクリーン&コンセントレーター | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean ゲル DNA リカバリー キット | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 ホット スタート ハイフィデリティ 2X マスター ミックス | ニューイングランド バイオラボ | M0494L | |
| プロテイナーゼ K | シグマ | P2308 | |
| ガラス ホウケイ酸ガラス マイクロピペット | サッター機器 | BF100-78-10 | OD: 1.0mm。ID: 0.78mm |
| Trizma 塩酸塩 | Σ | T5941 | |
| MgCl2 | Σ | M2393 | |
| NP-40 | Σ | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap 除染液 | Fisher Scientific | AM9780 |
参考文献
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(20....
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