方法論記事

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

7.3K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/57518

⸱

2018年4月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア リング方法を提示します。

要約

クラスター化された定期的に散在させていて回文繰り返し (CRISPR) - CRISPR - に関連したタンパク質 9 (Cas9) 原核生物の適応免疫の防衛システムが抱き込まれてしまった正確な真核生物ゲノム工学のための強力なツールとして線虫のゲノムの点変異の効率的で正確な世代キメラ シングル ガイド Rna (sgRNA) と CRISPR Cas9 Ribonucleoproteins (結合) を使用して迅速かつ簡単な方法を紹介します。SgRNA ターゲットの選択、ホモロジー監督修復 (HDR) テンプレート デザイン、CRISPR Cas9 RNP 錯化と配信、および正しく編集した動物の堅牢かつ迅速な同定を可能にする遺伝子型戦略のパイプラインについて述べる。我々 のアプローチは、変異動物安易な世代とゲノムの任意の場所の同定が可能だけでなく、高効率および減らされたスクリーニング作業負荷で約 4-5 日で他の複雑な塩基の対立遺伝子の検出を容易にも。

概要

最近の技術の進歩が根本的に形質転換し、正確にエンジニアのゲノムに能力を加速します。特に、RNA 誘導エンドヌクレアーゼの興味のターゲット シーケンスに近い二重鎖切断 (DSB) を誘導する Cas9 に頼る、CRISPR Cas9 システムは広くモデル有機体の使用の大半のゲノムを正確にエンジニアに使用されています生物医学研究1,2,3,4。大幅に CRISPR Cas9 の使用は、ゲノムはc. の elegans5のような困難な種でも編集ロックを解除が。種に関係なく編集システム基づく CRISPR Cas9 ゲノムと点突然変異を生成する 3 つのコア コンポーネントに依存しています: 1) Cas9 エンドヌクレアーゼ、ターゲット シーケンスと 3) 設計ユーザーに Cas9 エンドヌクレアーゼを指示する 2) シングル ガイド RNA (sgRNA)2興味の目的の編集を含むホモロジー監督修理 (HDR) テンプレートです。

ターゲットの sgRNA と Cas9 を紹介するために使用できるいくつかの方法があるプラスミッド、RNA ウイルス ベースの配信方法6などのセルにヌクレアーゼ。最近、中古複合 sgRNA Cas9 Ribonucleoproteins (結合) の直接配信は、CRISPR ベース Cas9 ゲノム編集7で強力で効率的なツールとして浮上しています。中古複合 CRISPR Cas9 結合の直接配信はいくつかのメリット、すなわち: 1) 結合細胞のトランスクリプションのための必要性のバイパス、翻訳、2) 結合が急速にクリアされ、特異性を増加するには可能性があります利用可能な時間の短縮オフ ターゲット胸の谷間、そして 3) 結合に非ネイティブのシーケンスをランダムな統合により宿主ゲノムに導入を回避する外国の DNA ・ RNA 要素が含まれていません。一緒に、これらの属性の可能性が高いターゲットに CRISPR 編集オフターゲット効果を最小限に抑えながらの短いバーストを提供します。

線虫 c. エレガンスのサイト固有の genomic 変更を導入するための簡単かつ効率的なプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、ターゲットに正しく編集した動物を明確に同定のジェノタイピング戦略と配信、sgRNA Cas9 RNP 錯単一鎖オリゴヌクレオチド (ssODN) HDR テンプレート デザイン sgRNA 含まれています。この戦略を使用すると、目的のサイト固有の変更を回復できる、だけでなく他の非特定塩基の変異を回復も可能性があります。したがって、当社の戦略は、1 つの戦略を使用してモノラル対立、bi 対立、対立シリーズの生成を許可、F1世代で塩基変異を生成できます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての動物の世話と実験手順は、国立衛生研究所と動物介護施設使用委員会 (IACUC)、ミシガン大学からガイドラインを追った。RNase フリー ソリューションを使用して、ピペットのプロトコル全体のヒント。RNase 除染液が製造元のガイドライン (表を参照)、次に作業領域、ピペット、チューブ、および遠心分離機をきれい。

1. sgRNA ターゲットの選択

  1. Web ブラウザーを使用して web ページを開く: http://crispor.tefor.net8
    1. 興味の目的の編集を並ぶシーケンスの ~ 60 塩基対 (bp) を入力 (つまり30 bp 5' と 3' の目的の編集)。
    2. 線虫ゲノムをプルダウン メニューから選択します。
    3. Protospacer 隣接するモチーフを選択 (20 bp NGG - SpCas9、SpCas9-HF1、eSPCas9 1.1) プルダウン メニューから。
    4. [送信] をクリックします。結果ページで、関心の編集に最も近い上位ランク ターゲット シーケンスを選択します。並ぶ 60 bp 入力シーケンス内の適切なターゲット ・ サイトがない場合は 100 までクエリ シーケンスを展開 bp (すなわち50 bp 目的のいずれかの側を編集)。
  2. 利用可能なソース、例えばsynthego から以下の仕様で 20 mer ターゲット sgRNA を取得: 3 nmol;変更はありません。
  3. 受領後、遠心チューブを含む凍結乾燥 sgRNA > 室温で 1 分間 12,000 × g。チューブにヌクレアーゼ フリーのテの 60 μ L を追加し、軽く P200 ピペットを使用して 15-20 回上下ピペッティング再停止します。最終濃度は 50 μ M です。

2 相同監督修復テンプレート デザイン

  1. SsODN の HDR テンプレート含む設計: 最初と最後の変異を並ぶ 4) 50 bp 5' と 3' の相同性腕 3) NGG PAM シーケンス内で Gs の一方または両方のサイレント突然変異、2) ユニークなフレームに制限酵素サイト 1) 関心の突然変異。(図 1)9,10。
    1. NGG PAM 一連の突然変異が可能でない場合は、ssODN ヘッダー テンプレートの sgRNA を介した胸の谷間を防ぐために sgRNA ターゲット認識シーケンス内で 5-6 サイレント変異をご紹介します。
  2. 使用可能なソース、例えばidtdna から次のパラメーターを「Ultramer DNA オリゴヌクレオチド」を取得: スケール: 4 nmol;定式化: どれも;浄化: 標準脱塩。
  3. 受領後、遠心チューブを含む凍結乾燥 ssODN > 室温で 1 分間 12,000 × g。軽く P200 ピペットを使用して 15-20 回上下ピペッティングによるにヌクレアーゼ フリー ddH2O の最終濃度 100 μ M の ssODN を中断再。

3. 設計遺伝子型プライマー

  1. 400 ~ 700 bp PCR 増幅11を生成するゲノム修飾を側面に設定プライマーを設計します。
  2. シングル、特定私アンプリコン11を生成する PCR サイクリング条件を最適化します。

4. 注入ミックスを準備します。

  1. 2 分 4 ° C で最大速度でテーブル 1試薬を遠心分離します。
  2. 順番は、ヌクレアーゼ フリー PCR チューブに表 1試薬を追加します。
  3. P20 ピペットでピペッティング 10 回上下に優しくによって徹底的にミックスします。
  4. 注入ミックス室温で 10 分間、インキュベートします。

5. 注入のプロトコル

  1. 注入ミックス12の約半分をインジェクション ピペットをロードします。注射針は下駄や中断に備えて注入ミックスの残りを保存します。
  2. 20 ~ 30 p.s.i. は、段階的な流れるソリューション12を生成できるように、マイクロ ピペット チップを破る。
    注: より大きい直径のヒント否定的動物の健康に影響を与えるし、F1後代の収量を減少させます。
  3. 注入 10-15 若い成虫は両方生殖腕の中で可能であれば12。ない場合は、片腕生殖腺への注入で十分です。
  4. OP50 シード 35 線虫成長メディア (NGM) プレートに注入された動物 (P0) 室温で 1-2 時間を回復するを許可します。その後、白金線ワームを使用して個々 の OP50 シード 35 mm NGM プレートに単一の注入 P0動物は12を選ぶ。

6. 画面 P0板と単一 mCherry(+) F1s

  1. 2 日間投与後、蛍光顕微鏡を用いた咽頭で mCherry を表現する F1子孫を含んでいる P0版を識別する (図 1一日 2-3)。ほとんどの mCherry(+) F1動物を含む 3 つの P0プレートを選択します。
  2. シングル 24 36 mCherry(+) F1のワームを使用しての合計のための 8-12 mCherry(+) F1動物選ぶ、3 つの選択した P0プレートから (図 1一日 2-3)。
    注: mCherry(-) 動物はこれらの P0プレートからも指摘することができますが、正しく識別する確率はあまり動物の編集 (図 2 a) を下げます。
  3. 個々 の F1s を self-fertilize し、室温で 1 〜 2 日のための卵を産みます。

7. シングル ワーム PCR および遺伝子型解析

  1. 産卵の 1-2 日後に、ワーム ピック (表 2図 1一日 4-5) を使用してワームの換散バッファーの 7 μ L を含む個別 PCR ストリップ管キャップに F1s を転送します。
  2. 遠心チューブ下部に動物をもたらす、-80 ° C 1 時間で管を固定するために室温で 1 分最大速度で PCR チューブ。
    注: ワームが-80 ° C で不明確に保存されます。
  3. 次のプログラムを使用してたちで冷凍ワームを溶解: 95 ° C、15 分、60 分の 60 ° C 4 ° C を保持します。
  4. セットアップ PCR マスター ミックス表 3に示すように。
  5. きれいな PCR チューブに PCR マスター ミックスの 21 μ L を追加し、手順 3 からワームの換散の 4 μ L を追加します。ピペットを使用してミックスし、PCR プログラム (材料表参照) 製造業者の指針を次を実行します。
  6. 製造元の指示に従って、DNA 清潔濃縮キットを使用して PCR 反応を浄化 (材料表を参照してください)。スピンの列に 10 μ L の水を追加することによって DNA を溶出します。
  7. 表 4に示すように、セットアップ制限酵素マスターをミックス。
  8. 各洗浄の PCR 反応に制限酵素マスターミックスプロの 10 μ L を追加し、37 ° C13で 1-2 時間インキュベートします。
  9. 個別は、120 V 1 × トリス-酢酸-EDTA (TAE) バッファー14の使用で実行 1.5% の agarose のゲルの PCR の製品を消化しました。

8. 識別と編集された動物のシーケンスの検証

  1. 潜在的な編集動物14 (図 14-5 日) を示すバンドの存在のため消化酵素サンプルを確認します。
    注: は、バンドのサイズおよび/またはバンディング パターン予期しない、複雑な制限の酵素の消化力の変化として観察することができます潜在的な塩基変異を識別するために N2 コントロールを読み込みます。
  2. 潜在的な編集した動物を識別した後ワーム換散の残りの 3 μ L を使用し、PCR 反応を繰り返します。きれいにしていないか、プログラムが完了した後、制限酵素は PCR 反応を消化します。別 1% の agarose のゲルの PCR の反作用をロードし、ゲル抽出キット15を使用してバンドを抽出 (材料表を参照してください)。
  3. サンガー シーケンス16ゲルが F1 のプライマーを使用して正しく編集した動物 (図 1 a) を識別する DNA を抽出
    注: 読み取りは、ヘテロ野生型の存在のためのピークをオーバーレイし、対立遺伝子を設計しました。
  4. 取得してホモ動物検証ヘテロ接合体の編集された動物、単一 8 122動物 7-8 の手順に従います。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

人間スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) の変異は、家族性筋萎縮性側索硬化症、麻痺と死の17に必ずや壊滅的な神経変性疾患の 10 ~ 20% を占めます。ヒト SOD 1 です (図 1 b) c. の elegans SOD 1 タンパク質と 55% のアイデンティティおよび 70% の類似性を共有進化上保存されたタンパク質です。シンプルさ、可能性、CRISPR Cas9 RNP ベースのアプローチの効率を示すためには、ワームのゲノム (図 1 a) 疾患関連の人間 G93A バリアントを紹介する線虫 sod 1遺伝子を対象とします。

線虫ゲノム G93A 変異をエンジニアに、sgRNA が選ばれたが P...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

CRISPR Cas9 システムのモデル生物のゲノムを正確に変更するための強力かつ効果的なツールです。ここでは、そのキメラ sgRNAs20と相まって ssODN HDR 有効テンプレートに線虫の遺伝子の点変異の高効率生成を示します。重要なは、示す共同選択マーカーとして使用する蛍光 RNP 配信が編集効率を生成する使いやすさと手法の信頼性を強調.

線虫ゲノム工学 CRISPR Cas9 メソッドの大半は、特定の遺伝的背景や co CRISPR 戦略1に依存します。Co CRISPR メソッドは、成功したゲノム編集を得ることの可能性を増加させる非常に便利なツールであると証明しました。しかし、co CRISPR メソッドは豊かに関心のゲノム編集用マーカーの軌跡で表現型が選択可能な編集を導入することを必要です。一方、強力な選択可能な表現型ベアリング変異導入望ましくないかもしれない場合編集するひずみまたは自体興味の目的の点突然変異表現型悪化またはマーカーの表現...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

頼むこの原稿の批判的研究室のメンバーに感謝いたします。系統は、線虫の遺伝学センター研究インフラストラクチャ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。頼む研究室での研究は NIH (R01 NS094678) や筋ジストロフィー協会 (MDA382300) からの補助金によってサポートされて A.A.B. に

謝辞

このレポートに関連する利害の関係はありません。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CRISPRevolution sgRNA EZキットシンテーゴ株式会社キメラsgRNA
ヌクレアーゼフリーTESynthego Inc.sgRNAキット、EZキット
Nuclease free waterSynthego Inc.にsgRNAキットに付属 EZキット
4 nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNA TechnologiesssODN HDRテンプレート
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies1078728Cas9タンパク質
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mCherryマーカープラスミド
KClシグマP5405
HEPESシグマH4034
DNAクリーン&コンセントレーターZymo ResearchD4004
Zymoclean ゲル DNA リカバリー キットZymo ResearchD4002
Q5 ホット スタート ハイフィデリティ 2X マスター ミックスニューイングランド バイオラボM0494L
プロテイナーゼ KシグマP2308
ガラス ホウケイ酸ガラス マイクロピペットサッター機器BF100-78-10OD: 1.0mm。ID: 0.78mm
Trizma 塩酸塩ΣT5941
MgCl2ΣM2393
NP-40Σ74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap 除染液Fisher ScientificAM9780
、付属

参考文献

  1. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  5. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
  6. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
  7. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
  8. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  9. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
  10. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
  11. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
  15. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
  16. Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
  17. Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
  18. Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  19. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  21. Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
  22. Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
  23. Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
  24. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

C elegans sgRNA ssODN HDR mCherry

関連記事