方法論記事

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

DOI：

10.3791/57519

⸱

2018年5月10日

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Alberta RNA Research and Training Institute, University of Lethbridge, 2Department of Neuroscience and the Canadian Centre for Behavioral Neuroscience (CCBN), University of Lethbridge, 3Arnie Charbonneau Cancer Institute, University of Calgary

この記事について

サマリー

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体外の能力を計測する Toeprinting の目的は、リボソームさまざまな条件の下でフォームの翻訳開始複合体に RNA を転写しました。このプロトコルは toeprinting 哺乳類の RNA のための方法を記述してキャップ依存、IRES 駆動の両方の翻訳を勉強する使用ことができます。

要約

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翻訳開始は、タンパク質合成の律速段階で細胞でタンパク質出力を調節する重要なポイントを表します。タンパク質合成の調節は、細胞のストレス応答するキーと不全、癌などの多くの病気の状態の中心。例えば、帽子独立した方法で細胞ストレスは減衰キャップ依存主導によるグローバル翻訳の阻害につながるが、特定のストレス応答タンパク質群選択的に変換されます。これらの特定の Mrna の翻訳のため、細胞内部リボソームのエントリ サイト (沢のカキツバタ) などの控えめな RNA 規制要素を許可します。このような Mrna の同定とそれらの調節機構の解析、分子生物学の主要な領域をされています。翻訳開始に関連した、Toeprinting、RNA の構造と機能の研究の方法です。Toeprinting の目標は体外の能力を評価するためにどのシーケンス、構造要素、またはアクセサリー要因がリボソームに関与しているを決定するためにさまざまな条件下でリボソームと安定な錯体を形成する RNA を転写バインド-効率的な翻訳開始前のカーソル。西部の分析やポリソームのプロファイリングなどの他の技術と一緒に翻訳開始制御機構の堅牢な特性の toeprinting ことができます。

概要

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翻訳は、ほとんどの携帯電話のエネルギーを消費すると厳しく規制された1を翻訳には理にかなって。逆に、翻訳の制御不全- とタンパク質出力の結果として変化-がん1,2などのストレス応答と疾患の状態が多くみられます。翻訳調節の主な利点は、細胞が様々 な刺激3に対応するため、タンパク質の出力を変更することが速度です。翻訳の規制はこのように細胞の生存と死1,2,3に影響を与えることができる重要なメカニズムを表します。翻訳の手順の開始はほとんど高度規制で複雑な3です。簡単に言えば、真核生物の Mrna には翻訳のために不可欠であるほとんど常に 5' m7G キャップが含まれています。真核生物の開始因子 eIF4E、eIF4A、eIF4G 帽子依存した開始が必要です (キャップ認識複合体) の mRNA の 5' 端と対話します。43 細胞リボソーム複雑、eIF2 バインド イニシエーターを含む tRNA および eIF3、mRNAを介してeIF3 と eIF4G の相互作用の 5' 端に募集しています。開始前複合体は eIF4A 援用 mRNA をスキャンすると思った (RNA ヘリカーゼ) 開始コドン (AUG) が見つかるまで。48 s 開始複合体が形成されその後、tRNA はリボソームの P サイトに配信。最後に、60 s と 40 s リボソームのサブユニットは翻訳伸長1,3,4に続いて 80 年代開始複合体の形成に統一されています。対照的に、内部リボソームのエントリ サイト (沢のカキツバタ) は、開始コドン3に直接 subunit 40 代を募集して 5' キャップの要件をバイパスします。生理的ストレス条件キー一般的な真核生物の開始因子 (eIFs) の変更による mRNA 翻訳を減衰させます。しかし、ストレス応答タンパク質をエンコードよく特定の Mrna の選択的な翻訳を可能にする非正規翻訳開始機構、癌のような病気の状態で非正規翻訳開始の破綻が関与して1,2。 細胞の沢のカキツバタなど、控えめな RNA 規制要素32,などの Mrna の翻訳を可能にします。

翻訳調節の 1 つの特に興味深い側面は、正規と非正規の特定の mRNA の翻訳のメカニズムを理解することです。Toeprinting は、特定の Rnaの生体外の翻訳開始機構の詳細な解明ができるテクニックです。Toeprinting の全体的な目標はどのシーケンス、構造要素またはアクセサリーを決定するために翻訳開始さまざまな条件下でリボソーム複合体の形成を核に関心の RNA の能力を評価するには要因は、効率的な翻訳開始に必要です。たとえば、リボソーム募集を 5' キャップの不在で妨げが、IRES の存在によって刺激があります。

技術の原理は体外にある開始複合体フォーム、し、逆に書き写すように翻訳のコンポーネント (または浄化されたコンポーネント) を含む細胞抽出物の存在下でそれを孵化、関心の RNA を転写特定のプライマー RNA。安定 RNA リボソーム複合体にはリボソームのいわゆる 'toeprint'5,6、7の 3' 端に失速する逆のトランスクリプションが原因となります。

このプロトコル、ribosomal 亜単位、eIFs、Trna、IRESトランスで-因子 (ITAFs) は便利なウサギ網状赤血球ライセート (RRL) に寄贈します。このプロトコルの別の利点は、標識プライマーではなく、蛍光標識したプライマーとジェル ベースの蛍光イメージャの使用です。これは、プライマーを標識化と同様にゲルを乾燥増に公開するなど、追加の手順を排除します。蛍光バンドより高い解像度を可能にするゲルの実行中に、リアルタイムに記録されます。アポトーシス蛋白 (XIAP) IRES RNA の上限なし X リンク阻害剤は、キャップ Mrna はこのテクニック8でも分析できますがここでは、例として使用されます。

セル lysates の翻訳プロセスの最終的な出力を測定する西部の分析とは異なり toeprinting、RNA の翻訳開始複合体形成を測定するための in vitroアプローチです。この還元主義的アプローチは、基板や翻訳開始因子の非常に詳細な研究 (e.g、キャップまたは国連おおわれた mRNA IRES の構造、有無、ポリ A の尾、特定の蛋白質の要因の規定の。など)。したがって、翻訳8のさまざまなモードや mRNA の構造の沢のカキツバタなどタンパク質合成9,10の効果を研究する toeprinting を使用できます。

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プロトコル

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注: RNA はリボヌクレアーゼ (RNases) による劣化に非常に敏感です。RNA のままを維持する標準的な予防策を講じる。手袋を頻繁に変更します。プロトコルのすべての手順でフィルター処理されたピペット チップ、ヌクレアーゼ フリー容器、ヌクレアーゼ フリー化学物質を使用します。ヌクレアーゼ フリーの使用またはピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC)-すべてのソリューションのための水を処理します。

1. 溶液の調製

  1. Toeprinting バッファーを準備: 20 mM トリス-HCl (pH 7.6)、100 mM KOAc、2.5 mM Mg(OAc)2, 5% (w/v) スクロース, 2 mM ジチオトレイトール (DTT) と 0.5 mM スペルミジン。
    1. 凍結融解の繰り返しを避けるために-20 ° C で使い捨ての因数で DTT とスペルミジンを保存します。
      注: DTT とスペルミジン使用の直前に toeprinting バッファーに追加する必要があります。DTT とスペルミジンを欠けているソリューションは、-20 ° C で保存できます。
  2. 85 mM 5'-グアニル imidodiphosphate (GMP PNP) と 91 mM アデノシン三リン酸 (ATP) の因数を準備します。因数-20 ° C で保存します。
  3. 6% ポリアクリルアミド-7 M 尿素ゲル ミックス 450 mL を準備: 67.5 mL 40 %acrylamide:bis-アクリルアミド (19:1)、尿素、112.5 x TBE (トリス、ホウ酸塩、thylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)) 5 mL と 120 mL の水の 189 g。37 ° C の水浴または攪拌しながらホット プレート上に温暖化によって、尿素を溶かします。ソリューションをフィルター (e.g。、0.2 μ m 硝酸セルロース真空フィルター)。
    注: ソリューションは 4 ° C で少なくとも 1 か月間保存できます。
    注意: アクリルアミド単量体は皮膚を通して吸収される神経毒です。皮膚への接触を避けるために大きい心配を取る (すなわち。 保護メガネ、手袋、白衣、)。ポリアクリルアミドは重合 100% 完了するまで続行できません、注意して処理も必要があります。
  4. ホルムアミド ローディングの染料の準備: 95% ホルムアミド、18 ミリメートルの EDTA、0.025% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS)、0.025% (w/v) ブロモフェノールの青、0.025% (w/v) キシレンシアノール。-20 ° C にてストア
  5. プライマー (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' IRDye 800 付いた端) の 1 nmol を 100 μ L の 10 pmol/μ L の作業濃度の水に溶解します。光から保護使い捨て因数 (約 10 μ L) で-20 ° C で保存します。

2. mRNA の準備

  1. 適切なテンプレートからポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による mRNA の合成 DNA テンプレートの増幅 (すなわち。、ゲノム DNA やプラスミド DNA、必要に応じて)。高忠実度の製造元の指示に従って DNA ポリメラーゼを使用し次の反応条件 (35 サイクル): 溶融、98 ° C、10 s;アニール、53 ° C、20 s;拡張、72 ° C、30 秒。
    注: 前方のプライマー (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) RNA のトランスクリプション; のように T7 プロモーターが組み込まれています逆のプライマー (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) 51 チミン残基には、転写の RNA のポリ A の尾を提供が含まれます。RNA生体外でプラスミド DNA から転写もあることに注意してください。
  2. 体外に適切な転写キットを使用は、IRES 含む RNA または DNA のテンプレートから頂いた RNA に議事録します。製造元の指示に従ってください。標準の 20 μ L 反応ボリュームの RNA のサンプルを準備します。37 ° C で 30 分間、RNase フリーの DNase の 2 ユニットと新しく合成した RNA を扱う
  3. 110 に DNase 処理 RNA を希釈ヌクレアーゼ フリー水 μ L は、室温で 20,000 × g で 110 μ L 酸フェノール、渦 5 s、3 分間遠心を追加。新しい 1.5 mL および microfuge の管に水相の 100 μ L を削除 10 μ L の 3 M 酢酸ナトリウムと渦 2 s 追加、100% エタノール, 渦 5 s の 3 つのボリュームを追加して、一晩-20 ° C で RNA を沈殿させます。
  4. 遠心分離機 > 4 ° C と上清を捨て、30 分 20,000 × g。冷たい 70% (v/v) エタノール 500 μ l 添加の餌を洗浄し、遠心分離を繰り返します。限り可能と風乾清吸引 5 ~ 10 分のペレットは、ペレットが外れないように注意してください。
  5. ヌクレアーゼ フリー水 0.5 μ g/μ L の作業濃度を生成するための適切な量の RNA を再懸濁します。これは-80 ° C で保存または、すぐに使用できます。

3. Toeprinting 反応

  1. ウサギ網状赤血球ライセート (RRL、ヌクレアーゼ扱われない)、RNase 阻害剤、91 mM ATP (最終 1.82 mM) の 1 μ L と 85 mM GMP PNP (1.7 mM 最終) 1.5 mL および microfuge の管の 1 μ L の 1 μ L (40 台) のミックス 15 μ L。30 の ° c で 5 分間インキュベートします。
    注: RRL は、凍結融解の繰り返しを避けるために単一の使用のため検体必要があります。重要な制御は、RRL、RNA の二次構造のため逆のトランスクリプションの自然な休止時間を明らかにするために不足している反応です。このコントロールの RRL を交換する toeprinting バッファーを追加します。
  2. RNA の 0.5 μ g (1 μ L) を追加し、30 の ° c で 5 分間インキュベートします。
  3. Toeprinting バッファーの 22 μ L を追加し、30 ° C、3 分で孵化させなさい。
  4. 0.5 μ L (5 pmol) IRDye 標識プライマーを追加し、氷上で 10 分間インキュベートします。
  5. 25 mM の dNTPs の 2 μ L を追加 (最終濃度: 1 mM)、2 Toeprinting バッファーの 3.5 μ、1 μ L の鳥 Myeloblastosis ウイルス逆転写酵素 (RT-AMV) 100 mM Mg(OAc)2μ L。最終巻は 50 μ L です。
  6. 45 分 30 ° C で反応を孵化させなさい。
  7. ヌクレアーゼ フリー水の 200 μ L を追加し、25:24:1 フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (pH 約 8.0) の 250 μ L を即座に抽出します。渦 5 s と 20,000 × g で室温で 3 分間遠心します。新しい 1.5 mL および microfuge の管に水相を削除 100% エタノール, 渦 5 s の 3 つのボリュームを追加して、-20 ° C で一晩沈殿します。
  8. 遠心分離機 > 4 ° C と上清を捨て、30 分 20,000 × g。冷たい 70% (v/v) エタノール 500 μ L の DNA の餌を洗います。遠心分離機 > 4 ° C で 15 分間 20,000 × gくらい上清を吸引と 5 ~ 10 分のペレット、ペレットが外れないように気をつけて乾燥した空気。
  9. ヌクレアーゼ フリー水 6 μ l 中でペレットを溶解し、ホルムアミド ローディングの染料の 3 μ L を追加します。

4. シーケンス反応

  1. チェーンの終端文字として dideoxynucleotides (ddNTPs) を使用して、標準的な配列の反作用のための 2.1 からの DNA のテンプレートそして 3.4 の手順から IRDye 標識プライマーを使用します。該当の DNA シーケンス キットを使用し、製造元の指示に従ってください。
  2. ホルムアミド ローディングの染料の 3 μ L の各シーケンス反応のミックス 6 μ L は。

5. ゲル法と電気泳動の配列の作製

メモ: このプロトコル ゲル ベースの蛍光イメージャと 21 cm × 23 cm × 0.2 mm のゲルを使用してが必要な場合、他のシーケンサーやゲル-サイズ、合わせることができます。

  1. 0.2 mm スペーサー ショート (23 × 25 cm)、100% エタノールで長い (30 × 25 cm) ガラス板を徹底的に掃除します。空気が乾燥。
  2. 6% ポリアクリルアミド-7 M 尿素ゲルのミックス 30 mL を混ぜて 10% (w/v) 過硫酸アンモニウム (AP) の 200 μ L、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L。泡を避けるために世話、ゲルを注ぎなさい、' サメの歯 ' ゲル櫛を挿入します。室温で 1 h の重合にゲルを許可します。
  3. シーケンス装置を組み立てるし、1 で貯水池を埋める x TBE。
  4. 中古 1500 V で実行 15 分の 55 の ° C の温度を達成するまで。
  5. 配列のゲルの上に 5 分負荷 1 μ L 85 ° C まで (から 3.9 または 4.2 の手順) サンプル/読み込み染料混合物を加熱します。
  6. 8 h の 1500 V でゲルを実行します。マシンは、リアルタイムでバンドを読み取ります。
  7. 装置を分解し、アクリルアミドゲルと連続したバッファーを破棄します。

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結果

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8,10体外帽子独立した翻訳開始をサポートする XIAP IRES の能力は前述しました。Toeprinting は XIAP IRES 開始複合体のメカニズムの詳細を調査する重要な技術です。XIAP IRES (図 1A) を含む mRNA は DNA コンストラクトだったの in vitro転写、toeprinting 分析を受けます。ここで使用される IRES XIAP mRNA の突然変異体の変形は、図 1Bで表されます。XIAP mRNA リボソーム複合体の逆のトランスクリプションをもたらした典型的な toeprints +17 +19 に下流 (図 1

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ディスカッション

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Toeprinting は、高度に制御された状況下での翻訳開始複合体の形成を支援する目的の RNA の能力を直接測定する強力な手法です。このプロトコルは toeprinting の簡略化手法を記述する哺乳類の Rna。ウサギ網状赤血球ライセート (RRL)、リボソーム、eIFs、イニシエーターの便利なソースとして使用されます、tRNA、IRESトランス-要因 (ITAFs) の演技します。実験者は選択の彼らの RNA を提供し、自分で選択した特定の補因子と toeprinting 反応を補うことができます。例えば、翻訳開始複合体対80 48 s は、toeprints7の蛍光強度分布に基づく区別できます。観察開始複合体は使用されるグアニン塩基の種類によって異なります。ここで説明した XIAP IRES、場合 GMP PNP プラス ATP 安定 48 開始前複合体、18 + 17≥ toeprint 分布によって特徴付けられる > +19。GMP PNP 架橋ブロック 48 ステップ13で翻訳開始、参加する...

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開示事項

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著者は開示する利害の対立があります。

謝辞

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イノベーション ジョン r. エヴァンス リーダー基金 (35017)、キャンパス アルバータ州革新プログラムおよびアルバータ州省の自然科学と工学研究会のカナダ発見助成 (RGPIN-2017-05463)、カナダの財団によって資金が供給されたこの作品経済発展と貿易。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DEPC (ジエチルピロカーボネート)ΣD5758-100ML
TRIS ベース、超高純度JT Baker4109-01
KOAc (酢酸カリウム)Bio BasicPB0438
Mg(OAc)2 (酢酸マグネシウム四水和物)Bio BasicMB0326
ショ糖、分子生物学グレードCalbiochem573113-1KG
スペルミジンΣ85558
GMP-PNP (グアノシン 5′-[&β;,γ-imido]三リン酸三ナトリウム塩水和物) 0.1 M 溶液Σ G0635
ATP (アデノシン 5′-三リン酸) 二ナトリウム塩、100 mM 溶液ΣA6559
19:1 アクリルアミド:ビスアクリルアミド、40%Bio 塩基性A0006
尿素バイオベーシックUB0148
500mLボトルトップろ過ユニット、0.2 µmSarstedt83.1823.101
ホルムアミドシグマF9037-100ML
EDTA(二ナトリウム塩、二水和物)バイオベーシックEB0185
SDSバイオベーシックSB0485
モフェノールブルーバイオベーシックBDB0001
キシレンシアノールFFバイオベーシックXB0005
MEGAshortscript T7転写キットAmbionAM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 転写キットAmbionAM1344
酸性フェノール:クロロホルム (5:1)アンビオンAM9722
25:24:1 フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールInvitrogen15593-049
ウサギ網状赤血球溶解物 (RRL).ヌクレアーゼ処理しないでください。グリーンヘクタール、米国グリーンヘクタールに問い合わせて、1:1 RRL:水
RiboLock RNase 阻害剤 (40 U/µL)Thermo FisherE00382
100 mM dNTPsInvitrogen56172, 56173, 56174, 56175それぞれ25 mMのストックにします。
AMV-RT、10 U/µLPromegaM5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing KitThermo Fisher707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzerLI-COR製品が販売終了しました
APS (Ammonium Persulfate)Bio BasicAB0072
TEMEDBio BasicTB0508
Phusion High Fidelity PolymeraseNewイングランドBiolabsM0530
ターボDNaseサーモフィッシャーAM2238
ブロ 等量を混合して、

参考文献

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