体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ サイトの免疫隔離について述べる。
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この記事について
サマリー
要約
効率的で堅牢な分離とプライマリ オリゴデンドロ サイト (OLs) の文化はオリゴデンドログリアの開発だけでなく、多発性硬化症などの疾患を脱髄の生物学の生体外で研究のための貴重なツールとPelizaeus メルツバッハー様疾患 (PMLD)。ここでは、単純な効率的な選択方法の免疫隔離のためステージ 3 O4+ preoligodendrocytes 細胞新生仔マウスの子犬。未熟な OL が、80% 以上の生後 7 日目で齧歯動物脳白質 (P7) この分離方法だけでなく細胞高利回りを保証も既に別個の系統にコミット OLs の特定の分離を構成するので減少、アストロ サイトなど汚染細胞とマウスの脳から他の細胞を分離することの可能性。このメソッドは、以前、報告方法の変更です、オリゴデンドロ サイト準備純度約 4 時間で 80% 以上を提供します。
概要
オリゴデンドロ サイト (OLs) は、中枢神経系 (CNS)1の髄の細胞です。分離と規制の厳しい環境でプライマリ オリゴデンドロ サイトの文化はオリゴデンドログリアの開発だけでなく、脱髄疾患多発性硬化症2 などの生物の生体外で研究のための貴重なツール.これは、効率的で堅牢なオリゴデンドロ サイト分離と培養法3を必要があります。本研究では迅速かつ具体的変更された分離手法を実装する、特徴的なオリゴデンドロ サイト細胞の表面マーカーの発現を利用をしました。
成熟オリゴデンドロ サイトの 4 つの明瞭な段階を識別されている、各各発育ステージ (図 1) 特徴的な細胞表面マーカーの発現が特徴します。これらの細胞の表面のマーカー抗体4、5、によって認識することができます、特定の段階で最小二乗法を分離する使用ことができます。最初の段階では、オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) は増殖、移行、および具体的にはエクスプレス ・血小板由来成長因子受容体 (PDGF-Rα)6, ガングリオシド A2B5, プ....
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プロトコル
本研究で使用されるマウスは、SUNY ダウンステート医療センター部門の研究室動物資源 (DLAR) プロトコル番号 15 10492 のガイドラインに従って介抱され。
注: プライマリ オリゴデンドロ サイトが新生児 (P5 P7 野生型 C57Bl/6 n) から分離されたマウス。この段階では、未熟な最小二乗法は、高細胞収量を確保する齧歯動物の白質の 80% 以上を構成します。すべてのバッファーと試薬組成材料のテーブルの末尾にあります。
1. Coverslips 準備
注: ポリ D リジン (PDL)/ラミニン コート coverslips OL 分離前に準備されるべきです。
- 場所 #1 ドイツ語 50 mL の円錐管に coverslips をガラスし、70% の 35 mL を追加しそれらをきれいに江藤。
- 管を閉じてならびにミキサーに軽くロッキングしながら少なくとも 30 分間室温でインキュベートします。Coverslips は夜通し孵化することができます。
- 70 %etoh を破棄します。
- 脱イオン水で 3 回 coverslips を洗浄、真空吸引で毎回水を削除します。
- PDL 50 μ g/mL の 30-35 mL ....
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結果
本研究の目的は O4 の改善の分離法を確立、+プライマリ マウス オリゴデンドロ サイト ターゲット細胞の最低限の操作を必要とします。Coverslips のセルのめっきに子犬の安楽死から全体のプロシージャは約 4 時間、ここで表示されるデータを表す 3 つの独立した実験。組織解離後 4.3 ± 0.46 × 107セルの平均値が 91% ± 5.6% の生存率をそれぞれ独立した実験のため分離されました。アンチ O4 を使用して免疫隔離タグ マイクロ磁気ビーズ後 6.9 ± 0.38 x 106の平均最小二乗法が得られた (10 x 1 1.5 マウスあたり6 ) 16.2% である最初解離; 合計セルの ± 1.6%生存率 96.3% ± 3.5% であった。
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ディスカッション
この通信は、高純度の未熟なマウス オリゴデンドロ サイト文化の効率的な分離法を提案する.以前に公開されたプロトコル39,40に比べると、このメソッドは、GFAP 陽性アストロ サイトの非常に低いレベルと他の非特徴の細胞の割合が非常に低い高い純度を得られました。オリゴデンドロ サイトの血統に既にコミット未熟な最小二乗法であることを指摘することが重要です。したがって、これらの細胞は、分化の初期段階の研究の役に立たないでしょう。
Dincman プロトコル40から変更の 1 つは、私たちの拡散メディアから塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF) の除去だった。報告されているその体外bFGF の強い細胞増殖因子として機能分化から Opc を阻害するだけでなく、またプロセス46,47の数が減少しま.......
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開示事項
著者の開示があります。
謝辞
本研究は、国民の多数硬化の社会 (RG4591A1/2) および健康の国民の協会 (R03NS06740402) からの助成金によって支えられました。著者は、実験スペース、機器やアドバイスを提供するため博士イバン エルナンデスと彼の研究室のメンバーをありがとうございます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10ml血清ピペット | フィッシャーサイエンティフィック | 13-676-10J | |
| 10mlシリンジLuer-Locチップ | BD、ベクトンディキンソン | 309604 | |
| 15ml円錐管ファ | ルコン | 352097 | |
| 24ウェル組織培養プレート | ファルコン | 353935 | |
| 40µm細胞ストレーナー | フィッシャーサイエンティフィック | 22368547 | |
| 50mlコニカルチューブ | ファルコン | 352098 | |
| 5ml血清ピペット | フィッシャーサイエンティフィック | 13-676-10H | |
| 60mm組織培養プレート | ファルコン | 353002 | |
| 70µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体 | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgM (H+L) 二次抗体 | Invitrogen | A21042 | |
| Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgM (H+L) 二次抗体 | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 594ヤギ抗鶏IgG(H + L)二次抗体 | Invitrogen | A11042 | |
| O4ビーズ-抗O4マイクロビーズ | Miltenyi Biotec | 130-094-543 | |
| Apo-Transferrinヒト | シグマ | T1147 | |
| オートフィルコンプリートボトルトップフィルターアセンブリ、0.22umフィルター、250ml | 米国科学 | 6032-1101 | |
| フィルコンプリートボトルトップフィルターアセンブリ、0.22umフィルター、250ml | USAサイエンティフィック | 6032-1102 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| ウ酸 | シグマ | B7660 | |
| シ成長血清(BGS) | GEヘルスケアライフサイエンス | SH30541.03 | |
| BSA | フィッシャーサイエンティフィック | BP-1600-100 | |
| CNTF | ペプロテック | 450-50 | |
| d-ビオチン | Sigma B4639 | ||
| デオキシリボヌクレアーゼ I (DNAse I) | Worthington | LS002007 | |
| EDTA Fisher | Scientific | S311 | |
| 落射蛍光顕微鏡 オリンパス DP70 カメラ付き | オリンパス | Bx51 | |
| フェザー使い捨てメス | Andwin Scientific | EF7281C | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| ドイツ製ガラスカバースリップ、#1 厚さ、直径 12mm 丸型 | NeuVitro | GG-12-oz | |
| GFAP 抗体 | Aves | GFAP | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-61 | |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | |
| 磁気セパレータースタンド - MACSマルチスタンド | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 磁気セパレーター - MiniMACSセパレーター | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex PES 0.22µm フィルターユニット | Millipore | SLG033RS | |
| Mounting media- Prolong Gold with DAPI | Thermo Fisher | P36930 | |
| N-acetyl-cysteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Neurobasal Medium A | Invitrogen | 10888-022 | |
| Neurotrophin-3 (NT-3) | Peprotech | 450-03 | |
| NG2 | ミリポア | AB5320 | |
| パパイン | ワーシントン | LS003126 | |
| Ca2+およびMg2+ | Sigma | D5652 | |
| PDGF | ペプロテック | 100-13A | |
| シャーレ | ファルコン | 351029 | |
| ポリ-D-リジン | シグマ | P6407 | |
| プリモシン | Invivogen | ant-pm-2 | |
| プロゲステロン | シグマ | P8783 | |
| プトレシン | シグマ | P5780 | |
| セレクション column-LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 亜セレン酸ナトリウム | Σ | S5261 | |
| 微量元素 B | コーニング | 25-000-CI | |
| トリヨードチロニン (T3) | シグマ | T6397 | |
| トリトン-X | シグマ | T8787 | |
| トリパン ブルーソリューション | コーニング | 25-900-CI | |
| トゥイーン 20 | シグマ | P1379 | |
| B27NBMA | 487.75 mL ニューロベースルミディアムA;10 mL B27サプリメント;プリモシン1mL;1.25mLグルタマックス;フィルター滅菌し、4°Cで保管します。使用までC。 | ||
| B27NBMA + 10% BGS | 27 mL B27NBMA; 3 mL ウシ成長血清 | ||
| CNTF溶液ストック(10 & micro;グラム/ミリリットル;1000X) | Peprotech(450-50)から注文してください。メーカーによると0.1〜1 mg / mlでメイクアップバッファー(例:DPBS + 0.2% BSA)中の命令(ロットごとに異なる場合があります)。-80°C. 作業溶液(10&�マイクロ;g/ml、1000X) 1.DPBSの解決およびろ過sterilize. 2の0.2% BSA(フィッシャー科学BP-1600-100)で作りなさい。マスターストックアリコートを10µに希釈します。g/mL 滅菌済み、冷蔵 0.2% BSA/DPBS. 3.アリコート(20µL / tube)と液体窒素でスナップフリーズします. 4.アリコートは-80°Cで保管してください。 | ||
| d-ビオチンストック溶液(50 & micro;グラム/ミリリットル;5000X) | d-ビオチン(Sigma-B4639)を50μで再蒸留したH2Oに再懸濁します。g / ml(例:50 mlのddH2Oに2.5 mg)。再懸濁には、かなりの量の攪拌/渦、または37°Cでの穏やかな温暖化が短時間かかる場合があります。それでもd-ビオチンが可溶化しない場合は、濃度の低いもの(例:10µg/ml)、B27NBMAに体積を多く追加する(1/5000ではなく1/1000)。4°Cで保管してください。 | ||
| DNase Iストック溶液 | 1。氷上で冷やしたHBSSに12,500UデオキシリボヌクレアーゼI / mlで溶解します. 2.氷上でフィルター滅菌します 3.200 µのアリコート;lと一晩で凍結し、-20°Cで 4。アリコートは-20〜-30°Cで保管してください。 | ||
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca2+およびMg2+なし) | ポーチを1リットルの水に溶解して、培地1リットルあたり9.6グラムの粉末で1リットルの培地を生成します。2-8°Cで保管します。 | ||
| フォルスコリン原液(4.2 mg/ml、1000X) | mLの滅菌DMSOをボトル(Sigma-F6886)の50 mgフォルスコリンに加え、再懸濁するまでピペットで固定します。15 mLの遠心分離チューブに移し、11 mlの滅菌DMSOを加えて4.2 mg / mlにします。l)で保存し、-20°Cで保管します。 | ||
| ハンクs バランス塩 (HBSS) (Sigma | 1.900mlの水を測定します(温度15-20°C;C)シリンダーに入れ、穏やかにかき混ぜます. 2.力を加え、溶けるまでかき混ぜます. 3.元のパッケージを少量の水ですすいで、粉末のすべての痕跡を取り除きます. 4.手順 2. 5 でソリューションに追加します。最終容量1リットルあたり0.35グラムの重炭酸ナトリウム(7.5%w / v)を追加します. 6。溶解するまで攪拌を続けます. 7.攪拌しながら緩衝液のpHをpH = 7.4より0.1〜0.3単位下に調整します。pH. 8を調整するために、1N HClまたは1N NaOHの使用をお勧めします。水を追加して、最終容量を 1L. 9 にします。気孔率0.22ミクロンのメンブレンを使用したろ過により滅菌します. 10。2-8°Cで保管します。 | ||
| インスリンストック溶液(4000µg / ml) | ボトルを解凍し、分注25µマイクロ遠心チューブあたりのlで、-20°Cで保管します。 | ||
| ラミニン溶液 | ラミニンを寒さでゆっくりと解凍します(2°C;Cから8°C;C)ゲル形成を避けるため。次に、ポリプロピレンチューブに分注します。5°Cで保管します。Cから-20°C;アリコート中のC(例:20 µl)そして繰り返し凍結/解凍しないでください。ラミニンは、これらの温度で最大6か月間保存できます。 | ||
| 磁気セルソーティング(MCS)バッファー | リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.2、および0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.5 mM EDTA、5µを含む溶液を準備します。g / mlインスリン、1g / Lグルコース。滅菌し、0.22µに通すことにより緩衝液をろ過することにより、脱気します。mミッレクフィルター。バッファを4°Cで保存します。 | ||
| N-アセチル-L-システイン(NAC)ストック溶液(5 mg / ml; 1000X) | 、N-アセチル-L-システイン(Sigma-A8199)をDMEMに5 mg / mlで溶解します(例:. 10 ml B27NBMAに50 mg NAC)。.フィルター滅菌とアリコート(例:20 µ-20°Cで保管してください。 | ||
| NT3ストック溶液(1 & micro;グラム/ミリリットル;1000X) | マスターストック: Peprotech(450-03)からの注文。メーカーによると0.1〜1mg / mlでメイクアップの指示(ロットごとに異なる場合があります)、バッファー(例:DPBS + 0.2% BSA)で。-80°C. Working stock (1µグラム/ミリリットル;1000X): 1.DPBS溶液で0.2%BSAを調製し、滅菌. をろ過します 2.マスターストックアリコートを1µに希釈します。g/mL 滅菌済み、冷蔵 0.2% BSA/DPBS. 3.アリコート(例:20µL / tube)と液体窒素でスナップフリーズします. 4.アリコートは-80°Cで保管してください。 | ||
| PDGFストック溶液(10 µグラム/ミリリットル;1000X) | マスターストック: Peprotech(100-13A)からの注文。メーカーによると0.1〜1mg / mlでメイクアップの指示(ロットごとに異なる場合があります)をバッファー(DPBSなど)+ 0.2%BSA)で保存します。-80°C. Working stock (1µグラム/ミリリットル;1000X): 1.DPBS溶液で0.2%BSAを調製し、滅菌. をろ過します 2.マスターストックアリコートを1µに希釈します。g/mL 滅菌済み、冷蔵 0.2% BSA/DPBS. 3.アリコート(例:20µL / tube)と液体窒素でスナップフリーズします. 4.アリコートは-80°Cで保管してください。 | ||
| ポリ-D-リジン (1mg/ml; 100X) | ポリ-D-リジン、分子量 70-150 kD (Sigma P6407) を 0.5mg/ml で 0.15M ホウ酸 pH 8.4 で再懸濁します (例: 50 ml ホウ酸緩衝液に 50 mg)。フィルター滅菌と分注(例:100µL /チューブ)。使用前に、100Xストック(1mg / ml)を50°Cに希釈してください。滅菌水中のg / ml。 | ||
| オリゴデンドロサイト増殖培地 | 補足表 1 | ||
| オリゴデンドロサイト分化培地 | 参照 補足表 1 | ||
| >佐藤サプリメント (100X) | 参照:補足表1 | ||
| 参考文献:試薬とレシピのリストは、Emeryら2013年(Emery, B. &Dugas, J. C. イムノパニングによるマウス皮質からのオリゴデンドロサイト系譜細胞の精製。コールドスプリングハーブプロトック。2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) および Dincman et.(Dincman、TA、Beare、JE、Ohri、S.S.&ホイットモア、SR皮質マウスオリゴデンドロサイト前駆細胞の単離。J Neurosciメソッド。日本木材処理学会誌, 209, 1, 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012)) |
参考文献
- Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
- Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods.
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