PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定

それは蛋白質 (または蛋白質の複合体) を研究することが重要 DNA バインディングおよびエピゲノム様々 な生物学的過程に関与する転写制御ネットワークを構築します。特に、ゲノム DNA への転写因子の結合は、遺伝子発現制御、細胞分化と組織の発達に重要な役割を再生できます。転写制御とエピジェネティクス機構を研究するための強力なツールは、クロマチン免疫沈降 (チップ) です。おかげで次世代シーケンシング技術の急速な進歩によって、蛋白質・ DNA バインディングおよびエピゲノム¹の分析に高スループット DNA シーケンス (チップ seq) と相まってチップが使用されます。ただし、標準的なチップ seq プロトコルには、反応は、細胞の数が限られている孤立した初代培養細胞などのまれな細胞集団のこの技術の応用を難しくあたり約 2000 万セルが必要です。

オリゴデンドロ サイト細胞オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) とオリゴデンドロ サイトなどを含む脳の全体に広く分散、開発や脳の機能が不可欠です。前駆細胞型として Opc は自己複製と分化の両方が可能です。Opc は、オリゴデンドロ サイト前駆細胞として機能するだけでなく、脳細胞²の他の種類との通信によって神経信号の伝播の重要な役割を果たします。以前の研究では、オリゴデンドロ サイト開発が Olig2 および Sox10^3,4など系統特異的転写因子によって調節されていることを示唆しています。これらの転写因子は、オリゴデンドロ サイト仕様と分化の間に彼らの表現に影響を与えるいくつかの重要な遺伝子のプロモーターやエンハンサー領域にバインドする発見されました。しかし、DNA 細胞の非常に限られた数で鋭く精製プライマリ Opc に興味の蛋白質 (または蛋白質の複合体) のバインドを識別するは困難です。

このプロトコルでは、チップ seq を用いたゲノム規模で浄化されたマウス Opc で Olig2 によるゲノム DNA の沈澱を体系的に調査する方法について説明します。マウス脳から Opc 急性 immunopanning で精製され増殖体外なしチップ実験で使用されます。Opc の限られた数は immunopanning によって得ることができる、標準チップ seq 実験のために十分ではないです。ここで、低細胞チップ seq プロトコルはトランスクリプション要因のためチップ反応あたり 2 万セルとして低記載されて。簡単に言えば、架橋細胞分離, クロマチンをせん断する超音波装置による超音波処理.Olig2 抗体ゲノム DNA を沈殿させる A をコートしたビーズの蛋白質と同様、Olig2 抗体とせん断のクロマチンを孵化すると。A コートしたビーズとタンパク質・ リバース架橋から溶出後 Olig2 抗体によって引き起こされる DNA がフェノール-クロロホルム抽出法で精製した.結果として得られる製品は定量化され T テーリングを受ける、プライマーアニー リングのテンプレート スイッチとエクス テンション、アダプター、増幅、ライブラリ サイズ選択、浄化の追加チップ seq ライブラリ構築の手順します。

シーケンス処理の後 Olig2 転写因子抗体調製した試料コントロールのサンプルから raw 読み取りの品質を調べた。質の低い塩基対とアダプターを含むフラグメントされたトリミングをお読みください。次に、トリミングされた読み取りマウス参照ゲノムに一直線に並んだ。コントロールのサンプルと比較してチップの読み取りがピークとして検出されたため大幅濃縮したゲノム領域。潜在的な転写因子結合部位を表す重要なピークはフィルターされ、ゲノムのブラウザーで可視化します。

特に、このプロトコルで説明する方法は、限られた数の任意のセル型と他の転写因子のチップ seq の広く使用できます。

すべての動物の使用と実験的プロトコル ケアと実験動物の使用のためのガイドに従って実行され、機関のバイオ セーフティ委員会とテキサス大学健康科学センターで動物福祉委員会によって承認ヒューストン。

1. PDGFRα 肯定的なオリゴデンドロ サイト (前述の immunopanning プロトコル^5,6,7より改変) マウス脳細胞の浄化

1. PDGFRα 陽性細胞の選択と血管内皮細胞とミクログリアの枯渇のため 2 プレート immunopanning プレートの準備。
   注意: シャーレがない細胞培養皿が immunopanning 実験のために働くことを注意してください。バイオ セーフティ キャビネットの immunopanning 手順が遂行されなければならない場合は浄化された細胞は、培養に使用される、
   1. 10 cm 30 μ L ヤギ抗ラット IgG pH 9.5、4 ° C で一晩 50 mM トリス塩酸 10 ml をペトリネット プレート コートします。プレートの表面は、コーティング液で完全に均等にカバーされているかどうかを確認するプレートを揺り動かしなさい。
   2. ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 0.2 %bsa を含む 12 ml ラット抗 PDGFRα 抗体の希釈 40 μ L PDGFRα 抗体溶液を準備します。
   3. 10 mL で igg 抗体コーティング プレートの 3 洗浄後各、1 x DPBS は igg 抗体コーティング プレート 4 時間室温で PDGFRα 抗体溶液を孵化させなさい。
   4. ラット抗 PDGFRα 抗体コーティング プレート 3 回 10 mL で 1 x DPBS 洗浄。優しくプレートの側壁に沿って DPBS ソリューションを追加し、塗装面を邪魔しないでください。
   5. 20 ml Banderiaea simplicifoliaレクチン 1 (BSL-1) 2 h のための 2.3 μ g/mL を含む DPBS の血管内皮細胞とミクログリアの枯渇のための 2 新しい 15 cm ペトリ プレートをコートします。
   6. BSL 1 コーティング洗浄 1 x DPBS 20 mL で 3 回のプレートします。優しくプレートの側の壁に沿って DPBS ソリューションを追加し、塗装面を邪魔しないでください。
2. 浄化の PDGFRα 肯定的なオリゴデンドロ サイト細胞が以前に発行されたメソッド⁶から変更^{,7, 8}.
   1. 日 7 (P7) 生後 2 から大脳皮質組織を解剖マウス脳以前によると公開プロトコル^5,6。
   2. 詳細の製造元の指示に従って神経組織解離キット (P) で単一細胞懸濁液を生成するために組織を切り離して考えます。
   3. 簡単に言えば、メスで切り裂かれた大脳皮質組織を切るし、37 ° C で酵素消化に消化後手動で単一細胞懸濁液をパスツール ピペット火磨かれたガラスを使って作品を切り離します。
   4. 室温で 10 分間 300 x g で単一細胞懸濁液を遠心し、15 mL の immunopanning バッファーを使用して細胞ペレットを中断 (immunopanning バッファーは 0.02 %bsa と 5 μ g/ml インスリン DPBS)。
   5. ミクログリアと血管内皮細胞のより良い枯渇を確保するため 2 の BSL 1 コーティング プレート プレート 5 分ごとの穏やかな攪拌を室温で 15 分間で順次 2 マウス脳から単一細胞懸濁液を孵化させなさい。
   6. 細胞懸濁液の非付着性のセルを収集し、45 分間室温のラット PDGFRα 抗体をコーティングしたプレートにそれらをインキュベートするプレートを軽く旋回します。
   7. ラット PDGFRα 抗体をコーティングしたプレートに細胞懸濁液の培養後優しく細胞懸濁液を収集するために版は渦巻きし、非付着性のセルを取り除く DPBS にプレートを 8 回をすすいでください。優しくプレートの側の壁に沿って洗浄ソリューションを追加し、非付着細胞を取り除くためにプレートの数回を揺り動かします。
   8. 37 ° C で 10 分間細胞剥離ソリューション治療の 4 つの mL を用いたラット PDGFRα 抗体コーティング プレートから細胞をデタッチします。付着性のセルを除去するプレートを振る。
   9. 室温で 300 × g で遠心分離による精製の Opc を収集、2 mL OPC 細胞培養培地で細胞ペレットを中断、トリパン ブルー色素と診断を使用して、セルをカウント (500 mL 細胞培養液は 5 mL を含む DMEM/F12 培地ペニシリン-ストレプトマイシン液 (P/S)、N2 5 mL、10 mL B27、5 μ g/mL インスリン、0.1 %bsa、20 ng/mL bFGF と 10 ng/mL PDGFRα)。
3. Immunopanning 後の Opc の純度検証。
   1. Immunopanning 後 Opc の充実を評価するために、製造元の指示に従って guanidium 基づくチオシアン酸抽出による RNA 抽出精製した Opc のいくつかを使用します。
   2. QRT PCR を実行するには、以前に公開された資料⁴によると解離脳細胞と比較して精製した Opc の PDGFRα 式の濃縮を確認する緑の蛍光染料のマスターの組合せを使用します。
   3. さらに、いくつかの精製の Opc をポリ-D-リジン コーティングにシード 24 ディープウェル プレート アンチ NG2 コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (NG2) 抗体を用いた免疫染色は前述材料⁹を公開。

2. 低細胞チップの作製と高スループット シーケンスのチップ ライブラリ構築

1. 市販の超音波システムと市販低細胞数チップ Olig2 低細胞チップ作製キット製造元から詳細な標準的な手順に従うことによっての (材料の表を参照してください)。
   1. ラット抗 PDGFRα からデタッチ後抗体をコーティングしたプレートとトリパン ブルーと診断を数えるセルは 1 mL OPC 培各チップの反作用のための 20,000 精製 Opc を置きます。
   2. 室温で 10 分間細胞懸濁液を修正する 36.5% ホルムアルデヒドの 27 μ L を追加します。
      注意: ホルムアルデヒドを化学の発煙のフード安全上の理由のため使用することに注意してください。
   3. 室温で 5 分間 50 μ L 2.5 M のグリシンと DNA タンパク質架橋を停止します。
      注: すべての手順遂行されなければならない氷の上またはこのポイントから 4 ° C の低温室内で。
   4. カクテル 1 ml の冷たいハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) プロテアーゼ阻害剤と架橋細胞ペレットを洗浄し、4 ° C で 300 x g で予冷遠心分離機によるペレットのセルを取得
   5. 25 で細胞ペレットを溶解 μ L 氷の上 5 分の換散バッファーの完了します。
      注: は、換散バッファーのセルを中断するチューブを揺り動かしなさい。
   6. セル lysate 75 μ L 冷たい HBSS プロテアーゼ抑制剤のカクテルと剪断を含む細胞ライセートでのクロマチン事前冷却 30 s および 30 s オフ プログラムの 5 サイクルの超音波システムを補足します。常に一緒に 6 管を超音波、100 μ L の水を含んでいるバランス チューブを確認します。
   7. 後は、14,000 × g 10 分間 4 ° C で遠心し、遠心分離後新しいチューブに上清を収集します。
   8. プロテアーゼ阻害剤と氷の完全なチップ バッファーの等量せん断クロマチンの 100 μ L を希釈します。
   9. 入力コントロールのサンプルとして希薄せん断クロマチンの 20 μ L を保存します。
      メモ: 入力コントロールのサンプルも Olig2 抗体免疫沈降された DNA を特定する Olig2 沈澱サンプルへの比較として必要です。
   10. 180 μ L の希釈ウサギ抗 olig2 抗体の 1 μ L, クロマチンを剪断が 4 ° C で 16 時間 40 rpm で回転ホイールの反応管をインキュベートを追加します。
       注: は、冷蔵室でこの手順を実行します。
   11. 各チップ反応ウォッシュ 55 μ L 11 μ L 磁気蛋白質 A コーティング ビーズ ビーズ洗浄バッファーとビーズを入れて 2 洗浄後 11 μ ビーズ洗浄バッファーでペレットします。
       注: は、冷蔵室でこの手順を実行します。
   12. 各チップ反応チップ反応管にあらかじめ洗浄蛋白質 A をコートしたビーズの 10 μ L を追加します。冷蔵室でこの手順を実行します。
   13. 4 ° C 回転ホイール上の別の 2 h でチップ反応管を孵化させなさい。
   14. 1 分の磁気ラックにチップ反応管を置きます。
       注: は、冷蔵室でこの手順を実行します。
   15. 上澄みを除去し、ビーズのペレットを除去しないでください。
   16. 4 ° C で回転ホイール上で 4 分間それぞれ 4 種類の洗浄バッファーの各ビード ペレット 100 μ L を洗う
   17. 洗浄後、ビーズ ペレットに 200 μ L の溶出バッファーを追加し、架橋蛋白質・ DNA を逆に 4 h 65 ° C でチップ反応管を孵化させなさい。
   18. さらに、20 μ L 入力コントロールのサンプルを溶出バッファーの 180 μ L を追加し、, 逆に架橋蛋白質・ DNA 同様 4 h の 65 ° C で。
   19. 各チップの反応管にフェノール、クロロホルム ・ イソアミル アルコールの 200 μ L 25:24:1 (v/v) の混合物を追加します。
   20. 1 分、室温で 15 分間 13,000 × g で遠心分離を精力的に渦。新しい管へ転送の上部の段階。
   21. 40 μ L 3 M 酢酸ナトリウム溶液、100% のエタノールの 1,000 μ L、2 μ L グリコーゲン変性の-20 ° C で一晩各チップの反応管に青い染料に共有にリンクを追加します。
   22. 13,000 x g で 4 ° C で 20 分間遠心
   23. 上澄みを廃棄、500 μ L 冷たい 70% エタノールで洗浄し、4 ° C で 20 分 13,000 × g で遠心
   24. 上澄みを廃棄、ペレット空気を 10 分で乾いた状態に保つ、50 μ L の水でペレットを溶解します。
2. 高スループット シーケンスのチップ ライブラリ構築
   1. 清潔でクリーン アップ キット メーカーの指示に従ってチップ DNA を集中します。
   2. 製造元の指示に従ってピコ グリーン チップ サンプルを定量化します。
   3. T テーリング、レプリケーションおよびテーリング、テンプレートの切り替えおよび拡張、製造元の指示に従って浄化ライブラリ サイズ選択と増幅アダプターの追加チップ seq キットを使用します。
      1. DsDNA の変性後、エビのアルカリホスファターゼによって一本鎖 Dna の 3' 末端を dephosphorylate し、する ssDNA ターミナルトランスフェラーゼによるポリ (T) 尾を追加します。
      2. DNA 複製とテンプレートの切り替え ssDNA テンプレート DNA ポリ (dA) プライマーをアニールします。
      3. 後の鋳型の切り替え、インデックス作成のための前方および逆プライマーと pcr 法によるチップ seq ライブラリを増幅します。
      4. PCR はフラグメントに至る 250 500 でチップ seq ライブラリを増幅選択オプション 2 をダブル サイズ選択による常磁性ビーズで bp。
      5. マイクロ流体チップ キャピラリー電気泳動装置を使用して選択したチップ seq ライブラリの品質を確認します。

3. データ分析

1. ディレクトリ構造を準備します。
   1. チップ seq データ分析の実行用のディレクトリを作成します。新しく作成されたディレクトリの中で次の名前 6 サブディレクトリを作成: raw.files、fastqc.output、bowtie.output、homer.output、macs2.output、motif.analysis、およびレポート。
2. データを準備し、塩基配列データの品質管理分析を実行します。
   1. "Raw.files"ディレクトリに移動し、チップ seq データ ファイルをダウンロードします。
   2. ファイル名を確認します。ペアエンド シーケンス場合、同様のベース名と 4 つのファイル (治療のため 2)、入力のための 2 がある: PDGFRα_Olig2.read1.fastq、PDGFRα_Olig2.read2.fastq、PDGFRα_input.read1.fastq、および PDGFRα_input.read2.fastq。ファイル名が異なる場合は、"mv"コマンドを使用してそれらの名前を変更します。
   3. "Fastqc.output"ディレクトリに移動します。
   4. Fastq ファイル品質管理ソフトウェア¹⁰を使用して raw 読み取りから品質コントロールのメトリックを取得します。図 S1Aで fastq ファイルごとに個別に品質管理プロセスを実行するのにコマンドを使用します。ソフトウェアは、いくつかの品質管理基準を html ファイルに表示されます。
   5. Html 品質管理ファイルを開き、読み取りの数を確認、品質スコアがシーケンス、シーケンス GC 含量、シーケンス重複レベル、アダプターのコンテンツ及び造営尺度内容ごとの塩基質ごとの長さをお読みください。
3. 末尾の低品質の読み取りとアダプターのコンテンツをトリミングします。
   1. 「あたり塩基品質」と「コンテンツ アダプター」のプロットを観察します。両方の頭と尾の各読み取りのトリミングの長さを決定します。トリミングの十分な長さは、基本品質が 30 を下回るし、アダプター内容の証拠があります。
   2. "Raw.files"ディレクトリに移動します。
   3. ダウンロードしてトリミング読み取り¹¹用ソフトウェアをインストールします。図 S1Bで治療と入力の両方を個別にトリミングのコマンドを使用します。パラメーター '収穫' は、後端からトリミング拠点し、'HEADCROP' は、読み取りの開始から除去する拠点数を指定します残りの読み取りの長さを示します。
   4. トリミング コマンドには、最小の読み取り 'MINLEN' パラメーターでフィルター処理した後で受け入れられるために長さも含まれています。場合は読み取りが少なくとも 50 bp、読み取りの長さのしきい値として使用 35 bp。
   5. "Fastqc.output"ディレクトリに移動します。
   6. 読み取りをトリミング後 fastq ファイル品質管理分析を実行します。品質管理の問題が解決されたことを確認します。図 S1Cで品質コントロールのメトリックを取得するのにコマンドを使用します。
4. シングル エンドまたはペアエンド チップ seq 読み取りマウス参照ゲノムの位置を合わせます。
   1. マッピングの"bowtie.output"ディレクトリに移動します。
   2. GENCODE mm10 マウス参照ゲノムをダウンロードします。"Mm10.fa"として mm10 マウスゲノムの参照を変更します。
   3. 読み取りマッパー¹²をダウンロードしてシステムにインストールします。
   4. 図 S2Aでコマンドを使用してダウンロードされた参照ゲノムのインデックス ファイルを作成します。6 つのファイルが自動的に作成されます: mm10.1.bt2、mm10.2.bt2、mm10.3.bt2、mm10.4.bt2、mm10.rev.1.bt2、および mm10.rev.2.bt2。
   5. 図 S2Bでコマンドを使用して配置を実行し、パラメーターを調整する"-p"システム設定に従って処理コアの数に。ペアエンド モードを実行中の場合、「-1」と「-2」のパラメーターはトリミング fastq ファイルの名前を示します。
      注: のマッピングは、治療と入力サンプルの別途に実行され、各サンプルのメトリック ログの出力ファイルが作成されます。
   6. サム形式¹³でファイルを操作するためのソフトウェアをダウンロードしてシステムにインストールします。図 S2Cでコマンドを使用して BAM ファイルに一直線に並べられた SAM ファイルを変換します。
5. 両方のペアエンド治療とコントロール サンプルを呼び出すのピーク前にマップされたリードの品質管理基準を取得します。
   1. 1 つのアドレスに最も重要な品質管理指標はシーケンスの深さです。Bowtie.output ディレクトリにファイル"log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt"と"log.bowtie.PDGFRα_input.txt"を開き、各サンプルに一意に割り当てられた読み取りペア数が 1000 万より大きいことを確認します。
   2. "Homer.output"ディレクトリに移動します。
   3. モティーフの発見の次世代シーケンス解析¹⁴ソフトウェアをダウンロードし、システムにインストールします。
   4. "TagDir"という名前のディレクトリを作成します。
   5. タグ クローナリティを確認するには、図 S3Aに示されているコマンドを使用します。"MakeTagDirectory"コマンドは、4 つの品質管理出力 files:tagAutocorrelation.txt、tagCountDistribution.txt、tagInfo.txt、および tagLengthDistribution.txt に生成されます。
   6. "TagDir"ディレクトリに移動します。
   7. "TagCountDistribution.txt"ファイルを「レポート」ディレクトリにコピーします。
   8. 「レポート」ディレクトリに移動します。
   9. スプレッドシート プログラムを使用して tagCountDistribution.txt ファイルを開き、バーを作成するゲノム上の地位ごとのタグ数のプロット。ヒストグラム ファイル名"tag.clonality.xlsx"を格納します。
   10. システム プログラミング言語¹⁵ R をインストールします。
   11. ターミナルの 'R' を入力し、R のプログラミング環境にアクセスする ENTER キーを押します。
   12. ¹⁶チップ seq データを処理するための R パッケージをダウンロードしてS3B 図に示されているコマンドを使用してそれをインストールします。
   13. 鎖の相関をプロットするのに図 S3Cの R スクリプトを使用します。
6. ピーク マッパーを使用してピークの検出。
   1. "Macs2.output"ディレクトリに移動します。ダウンロードし、お使いのシステムでピーク マッパー¹⁷をインストールします。
   2. 関数"callpeak"を使用し、治療し、3.4.6 のステップで生成される BAM ファイルを制御します。
      注: その他のパラメーターを含める"-f"入力ファイル形式の"-g"ゲノムのサイズの」-名」、すべての出力ファイルの基本名を示すためと"-B"フラグメント玉突き事故を bedgraph 形式で格納するため。コマンドを呼び出して完全なピークは、図 S4Aに含まれます。ペアエンド サンプルの BEDPE を使用します。
   3. ピーク時マッパーに 6 つのファイルが生成されることを確認してください: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_control_lambda.bdg と PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg。
   4. ファイルを開くと呼ばれるピーク、場所、長さ、位置、玉突き事故で、ピーク濃縮メトリックを表示する PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls:-log10(pvalue)、濃縮と log10(q-value) を折る。
7. フィルターし、呼ばれるピークに注釈を付けます。
   1. 前の手順で開いたファイルを使用して、倍濃縮、p 値や q 値によりピーク フィルターの結果します。適切なフィルターのしきい値を決定するには、各メトリックの密度を決定するヒストグラム プロットを作る。著しいピークを取得する選択されたしきい値を下回る値を除外します。
   2. Mm10 ブラック リスト (地域は人工的に高信号と知られている) をダウンロードし、フィルター チップ seq をピークにそれらの成果物の地域の内にあります。
   3. 次の列を含むフィルターのピークを持つベッド ファイルを作成: 染色体、開始、終了、peakID、モック、およびストランド。ドットでモックの列を埋める"."使用していないので。鎖列のすべての値を設定「+」。ベッド ファイルを"filtered.peakData2.bed"として保存します。
   4. 「レポート」ディレクトリに"filtered.peakData2.bed"ファイルをコピーします。
   5. 「レポート」ディレクトリに移動します。
   6. 特定の遺伝子領域にフィルター処理されたピークを注釈付け、関数"annotatePeaks"ベッド ファイルに前の手順で作成したを使用します。図 S5Aに使用するコマンドを示します。
   7. 統計ソフトウェアを使用して"filtered.annotatedPeaks.txt"ファイルを開きます。
   8. 注釈付き TSS から 5 kb を超える距離の遺伝子間領域に横になっている結果のピークをフィルター処理します。フィルターのファイルの距離としての「距離に TSS」列を使用します。"5kbup.geneBody.peakData.txt"という名前の excel ファイルにフィルターのピークを格納します。
   9. 結果ストア フィルター列を持つ bedGraph ファイルのピーク: 染色体、開始、終了、および log10(q-value)。"5kbup.geneBody.peakData.bedGraph"ファイルを名前します。
8. ブラウザーの可視化のための大物ファイルを生成します。
   1. ダウンロードしてゲノム算術¹⁸のためのソフトウェアをインストールします。
   2. 大物を bedgraph に変換するツールをダウンロードしてシステムにインストールします。'Mm10.chrom.sizes' ファイルをダウンロードします。
   3. 図 S6Aで大物ファイルを生成するのにコマンドを使用します。
   4. ダウンロードしてシステムに¹⁹ゲノム ブラウザーをインストールします。
   5. ゲノムのブラウザーを開き、フィルターの重要なピークと知られていた遺伝子に関してその場所を可視化する"5kbup.geneBody.peakData.bigwig"ファイルをロードします。
9. モチーフ検索。
   1. "Motif.analysis"ディレクトリに移動します。
   2. スキャン・ デ ・ ノボモチーフとモチーフのウラン濃縮プログラムをダウンロードしてシステム²⁰にそれをインストールします。
   3. Olig2 のモチーフを含む包括的なモチーフ データベースをダウンロードします。
   4. 大きなピークの頂上を中心とした 500 bp の領域のゲノムの配列を取得します。Peak.sequences.txt としてシーケンスを格納します。図 S7で Olig2 モチーフ各 500 bp ピーク領域内を検索するコマンドを使用します。
   5. 十分な E-値を使用して結果のモチーフをフィルター (既定 = 0.05)。

低細胞チップ seq を行い精製急性脳 Opc でゲノム DNA と転写因子 Olig2 の潜在的な相互作用を調査するため情報の解析が行われました。図 1は、実験とデータ解析手順の一般的なワークフローを示します。このプロトコルでは生後マウス脳単一細胞懸濁液に分離。組織解離後 immunopanning は PDGFRα 抗体を用いた Opc を浄化するために行われました。図 2は、PDGFRα、神経細胞マーカー Tuj1 の小さな表現の重要な濃縮 (ニューロン固有のクラス III β-チューブリン)、アストロ サイトのマーカー GFAP (グリア線維性酸性蛋白)、ミクログリア マーカー イオン化カルシウム結合アダプターを示しています分子 1 (Iba1)、髄成熟オリゴデンドロ サイト マーカー ミエリン塩基性タンパク質 (Mbp) やミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) 精製 Opc から RT qPCR による評価。さらに、免疫染色結果は細胞の大半が NG2図 2に示すように、肯定的なことを示します。その後、反応あたり 2 万精製 Opc はホルムアルデヒドによって修正され、クロマチンが超音波システムを用いたせん断されました。Olig2 低細胞チップを行い、図書館が建設されました。チップ ライブラリの準備の後マイクロ流体チップ キャピラリー電気泳動デバイスによって生成された製品の品質が検証されました。図 3は、Olig2 低細胞チップ ライブラリの例レーザービームを示しています。250 から 500 に至るまで明確なピークの Oligo2 ライブラリ製品 bp はライブラリの PCR の製品のサイズを選択した後表示する必要があります。Olig2 転写因子抗体とコントロールのサンプル両方サンプルのチップ seq ライブラリを受けたペアエンド 50 を生成する高スループット シーケンスにシーケンス リード サイクルします。長い読み取りの長さはマッピング率を改善し、シーケンシング コストを犠牲にして、複数のマッピングの確率を減らします。50 bp チップ seq ペアエンド シーケンス ライブラリと良い結果は通常達成します。

Raw 読み取りとアダプターのトリミングと末尾の低品質塩基対の品質コントロールの初期評価の後品質管理のプロットは図 4に描かれています。トリミングの読み取りする必要があります 30、ないアダプター シーケンスを超える基本品質を持っているし、(図 4 b-D) 低重複率を持っています。質の良いトリミングを読み取ります全体の配置率を増加します。GC の内容などの他のパラメーターも重要であり、トリミングを考慮すべき。

シーケンス サンプルが整列して、一度シーケンスの深さを確認する必要です。それは弱いサイトより有意21になるので高いシーケンス深さと呼ばれるピークの数が増加を知られています。飽和の解析は、時間と予算を犠牲にして、使用する特定のトランスクリプション要因の十分な配列の深さを判定する必要です。転写因子結合のコンセンサス配列の深さは、哺乳類のサンプルに関するエンコード コンソーシアムによって示唆されている: 1000 万の最小値は一意に22をレプリケートに少なくとも 2 つの生物のそれぞれの読み取りをマップします。読み取りのマッパーによって一意にマップされた読み取りと全体の配置率の数を求めた。図 5 aによいマッピング指標の例を示します。一直線に並べられた読み取りタグ クローナリティとも呼ばれます、適切なライブラリ複雑さを示す個別のゲノム位置にマップします。エンコード コンソーシアムは、1000 万の一直線に並べられた読み取りの少なくとも 80% は異なるゲノム領域22に対応することを示唆しています。図 5Bは、読み取りの 90% 以上が 1 つだけのゲノム位置にマップされます適切なタグ クローナリティを示しています。低複雑さのライブラリ通常場合に発生する十分な DNA を得、PCR 増幅フラグメントは、繰り返しシーケンスします。低複雑さライブラリ高偽ピーク検出率が得られます。

ペアエンド チップ seq データを使用して、フラグメントは分離の一定の距離を持つ転写因子をバインドします。ペアエンド シーケンスは、降伏よりバインドが発生したゲノム領域のより良い推定平均フラグメントの長さのより正確な推定のためになります。鎖の相関プロットは、優勢なフラグメントの長さに応じた利得のピークを示しています。図 5において、計算されたフラグメントの長さは 130 bp リードの長さは 50 bp。フラグメントの長さは読み取りの長さよりも長いチップ seq データセットは、高品質の16を表しています。

ピークの呼び出しのゲノム領域の転写因子 (またはその複合体) に拘束される可能性がありますの一覧です。ゲノム領域またはピークのリストは、ゲノムのブラウザーで表示できる「ベッド」ファイルに含まれます。各ピークにこのファイルと含まれますピーク ID、ピーク頂上のゲノム位置として FDR log10 (q 値)。大きく豊かなピーク、高倍濃縮と意義メトリックです。図 6Aに出力ピーク ファイルの例を示します。カスタムしきい値を使用して、エンコードのブラック リスト23、内のピークをフィルター処理および識別する遺伝子のプロモーター領域 (5 kb 上流と全体の遺伝子体) 内ピークで著しいピークを選択すると、「大物」ファイルはゲノム上のピークを表示するのに役立ちますブラウザー。最も豊かなピーク地域転写因子結合のより高い確率があります。知られているトランスクリプション要因の規定する領域でピークの存在だけでなく、転写因子結合が可能性が高い地域でピークがないことを確認することが重要です。図 6B-E遺伝子領域とエンコード プロモーター領域に関して彼らの位置と同様、ピーク濃縮なしの例を示しています。

インシリコチップ seq 実験に相補的なメソッドは、モチーフ濃縮分析およびde novoモチーフ検索。Opc における Olig2 連結の前にまだ検討されていない、Olig2 チップ seq 由来運動ニューロン前駆細胞のピーク、胚性幹細胞は、デノボモチーフ同定4,24に使用されました。Olig2デノボ識別モチーフ25包括的なエンコード モチーフ データベースに加え、モチーフ濃縮分析を行った。De novoの高濃縮 OLIG2 モチーフと知られているトランスクリプション要因 (HDAC2、SP1、FOXP1、NR3C1、NFKB2/4、SMAD2/3、PAX5、および ASCL1) モチーフが精製した PDGFRα 細胞チップ seq ピークで発見されました。強化 E 値 30 のde novo識別モチーフの < 0.05 が発見されました。Olig2 の上位 2 ・ デ ・ ノボ識別されるモチーフを図 7に示します。これら 2 つの識別・ デ ・ ノボOlig2 モチーフで発見された > チップ seq ピークの 60% 細胞から得られた精製 PDGFRα、また知られているモチーフに。

図 1: プロトコルのワークフローの概要。PDGFRα 正 Opc 生後早期のマウスの脳から分離された Olig2 チップを受けたと実験します。沈殿した DNA のフラグメントは、チップ ライブラリを準備するために使用されました。ライブラリの品質を評価した後のサンプルは、シーケンスを使用しました。データ集合を解析していた、ピークが同定された細胞を精製した OPC の電位 Olig2 結合部位を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: immunopanned Opc qPCR や免疫染色による純度評価します。(A) PDGFRα 抗体 immunopanned 細胞を播種し、OPC 系統マーカー NG2 抗体を用いて免疫染色を行った。青: DAPI、緑: NG2。スケール バー = 10 μ m. (B) 神経細胞マーカー Tuj1 精製 Opc (PDGFRα +) および解離脳細胞 (ミックス) の相対発現レベルを検討しました。解離脳細胞における Tuj1 の発現は、1 に設定されました。(C) アストロ サイトの相対発現レベル マーカー GFAP 精製 Opc (PDGFRα +) および解離脳細胞 (ミックス) を評価しました。解離脳細胞における GFAP 発現は、1 に設定されました。マーカー OPC の相対発現レベル (D) PDGFRα 精製 Opc (PDGFRα +) および解離脳細胞 (ミックス) を評価しました。解離脳細胞における PDGFRα の発現は、1 に設定されました。(E) 髄成熟オリゴデンドロ サイト マーカーの相対発現レベル モグ精製 Opc (PDGFRα +) および解離脳細胞 (ミックス) を評価しました。モグ式解離脳細胞では、1 に設定されました。(F) 髄成熟オリゴデンドロ サイト マーカーの相対発現レベル Mbp 精製 Opc (PDGFRα +) および解離脳細胞 (ミックス) を評価しました。解離脳細胞における発現を Mbp は、1 に設定されました。(G) ミクログリア マーカー Iba1 精製 Opc (PDGFRα +) と解離脳の相対発現レベル細胞 (ミックス) を行った。Iba1 式解離脳細胞では、1 に設定されました。B G のデータは帳票実験を表し、誤差範囲は標準誤差を示します。T-テスト分析 * P < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: Olig2 低細胞チップからライブラリの例一塩。2 倍のサイズを選択した後 Olig2 チップ ライブラリの品質は、マイクロ流体チップ キャピラリー電気泳動装置によって分析されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 50 bp 読み込む長さ低細胞チップ seq サンプルの代表的な品質管理の結果。(A) 表読み取りの合計数、質の悪いリード、シーケンスの長さ、および全体的な GC コンテンツ数を描いたします。(B) プロット、読み取り位置別基本品質スコアの分布を示します。(C) プロット読み取りで異なる位置に潜在的なアダプターのコンテンツを表示します。(D) 行の % を示すプロットがシーケンスを複製します。読み取りの大半はライブラリ内の低重複率や高いライブラリの複雑さを示すしたがって一度のみ発生するシーケンスに属します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: ピーク呼び出す前に品質管理の指標が得られた: bowtie2 の配置のメトリック、ストランドの相互相関とタグのクローナリティ。(A) 読み取りマッパーから配置の指標が得られます。最も重要なメトリックは、「的外れ丁度 1 時間を揃え」、および全体の配置率として示される一意にマップの読み取りペアの数です。(B) ヒストグラム表示タグ クローナリティ。バーでは、タグが発見された genomic 位置の割合を示します。(C) 質の良いデータを示す相関プロットの例。赤い線は 50 bps で読み取りの長さと 130 bps で優勢なフラグメントの長さを表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6: チップ seq ピーク領域とゲノムの異なる場所で重要なチップ seq ピークのゲノムのブラウザー ビュー 。 (A) ではピークの発信者識別ピーク領域の例。(B) 重要なチップ seq ピークは Cspg4、知られている OPC マーカー遺伝子の遺伝子の体で発見します。(プロモーター領域または Mbp 遺伝子、成熟オリゴデンドロ サイト、(C) Tubb3 神経細胞マーカーのマーカーまたは (D) GFAP、アストロ サイトの細胞のマーカーの遺伝子体内チップ seq ピークが見つかりません B) でした。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 7: PDGFRα Olig2 チップ seq のピークは、Olig2 のde novo識別されるモチーフを高濃縮します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 S1: チップ seq データ セットの準備。(A) ディレクトリ アーキテクチャの定義。(B) 計算の生では、品質管理基準をお読みください。読み取りの (C) トリミング。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

図 S2: 読み取り参照ゲノムとの整列します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

図 S3: アドレスへの一直線に並べられた読み取りの品質管理ストランドの相互相関とタグ クローナリティを決定します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

図 S4: ピーク呼び出し。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

図 S5: 著しいピークの注釈します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

図 S6: bedGraph ファイル形式のゲノムのブラウザーでピーク可視化のための大物への変換。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

図 S7: De novoモチーフ検索、モチーフ濃縮します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

図 S8: フローチャートのチップ seq データのバイオインフォマティクス解析について記述します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。