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方法論記事

PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定

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DOI：

10.3791/57547

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2018年4月16日

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

この記事について

サマリー

低細胞クロマチン免疫沈降 (チップ) を実行することによってゲノム内でバインド オリゴデンドロ サイトのトランスクリプション要因 2 の (Olig2) 鋭く精製脳オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) を分析するように設計されたプロトコルを紹介します。、ライブラリの準備、高スループット シーケンスおよびバイオインフォマティクス データ解析。

要約

哺乳類セルの遺伝子の転写はゲノム DNA と転写因子の相互作用によって細胞型固有の方法で調整されます。系統特異的転写因子は、セル仕様と開発中に分化に重要な役割を再生すると見なされます。ゲノム DNA の転写因子 (またはその関連付けられた複合体) のゲノム結合部位を分析する高スループット DNA シーケンス (チップ seq) と相まってチップが使用されています。ただし、多数のセルが 1 つ標準チップの反応、分離細胞または珍しいセル人口の限られた数を検討することは困難になるため必要です。オリゴデンドロ サイトの系統特異的転写調節機構を理解するために因子 Olig2 鋭く浄化されたマウス Opc、チップ seq を使用して Olig2 (または複雑な Olig2) のゲノム結合部位を特定する詳細な方法が表示されます。プロトコルが血小板由来成長因子の受容器のアルファ (PDGFRα) を浄化する方法を説明しますまず、マウスの脳から肯定的な Opc。次に、Olig2 抗体チップとライブラリーの構築が実行されます。最後の部分では、バイオインフォマティクス ソフトウェアと Olig2 チップ seq 解析に使用するプロシージャについて説明します。要約すると、転写因子 Olig2 鋭く精製脳内 Opc のゲノムワイドなバインディングを分析する方法を報告します。

概要

それは蛋白質 (または蛋白質の複合体) を研究することが重要 DNA バインディングおよびエピゲノム様々 な生物学的過程に関与する転写制御ネットワークを構築します。特に、ゲノム DNA への転写因子の結合は、遺伝子発現制御、細胞分化と組織の発達に重要な役割を再生できます。転写制御とエピジェネティクス機構を研究するための強力なツールは、クロマチン免疫沈降 (チップ) です。おかげで次世代シーケンシング技術の急速な進歩によって、蛋白質・ DNA バインディングおよびエピゲノム1の分析に高スループット DNA シーケンス (チップ seq) と相まってチップが使用されます。ただし、標準的なチップ seq プロトコルには、反応は、細胞の数が限られている孤立した初代培養細胞などのまれな細胞集団のこの技術の応用を難しくあたり約 2000 万セルが必要です。

オリゴデンドロ サイト細胞オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) とオリゴデンドロ サイトなどを含む脳の全体に広く分散、開発や脳の機能が不可欠です。前駆細胞型として Opc は自己複製と分化の両方が可能です。Opc は、オリゴデンドロ サイト前駆細胞として機能するだけでなく、脳細胞2の他の種類との通信によって神経信号の伝播の重要な役割を果たします。以前の研究では、オリゴデンドロ サイト開発が Olig2 および Sox103,4など系統特異的転写因子によって調節されていることを示唆しています。これらの転写因子は、オリゴデンドロ サイト仕様と分化の間に彼らの表現に影響を与えるいくつかの重要な遺伝子のプロモーターやエンハンサー領域にバインドする発見されました。しかし、DNA 細胞の非常に限られた数で鋭く精製プライマリ Opc に興味の蛋白質 (または蛋白質の複合体) のバインドを識別するは困難です。

このプロトコルでは、チップ seq を用いたゲノム規模で浄化されたマウス Opc で Olig2 によるゲノム DNA の沈澱を体系的に調査する方法について説明します。マウス脳から Opc 急性 immunopanning で精製され増殖体外なしチップ実験で使用されます。Opc の限られた数は immunopanning によって得ることができる、標準チップ seq 実験のために十分ではないです。ここで、低細胞チップ seq プロトコルはトランスクリプション要因のためチップ反応あたり 2 万セルとして低記載されて。簡単に言えば、架橋細胞分離, クロマチンをせん断する超音波装置による超音波処理.Olig2 抗体ゲノム DNA を沈殿させる A をコートしたビーズの蛋白質と同様、Olig2 抗体とせん断のクロマチンを孵化すると。A コートしたビーズとタンパク質・ リバース架橋から溶出後 Olig2 抗体によって引き起こされる DNA がフェノール-クロロホルム抽出法で精製した.結果として得られる製品は定量化され T テーリングを受ける、プライマーアニー リングのテンプレート スイッチとエクス テンション、アダプター、増幅、ライブラリ サイズ選択、浄化の追加チップ seq ライブラリ構築の手順します。

シーケンス処理の後 Olig2 転写因子抗体調製した試料コントロールのサンプルから raw 読み取りの品質を調べた。質の低い塩基対とアダプターを含むフラグメントされたトリミングをお読みください。次に、トリミングされた読み取りマウス参照ゲノムに一直線に並んだ。コントロールのサンプルと比較してチップの読み取りがピークとして検出されたため大幅濃縮したゲノム領域。潜在的な転写因子結合部位を表す重要なピークはフィルターされ、ゲノムのブラウザーで可視化します。

特に、このプロトコルで説明する方法は、限られた数の任意のセル型と他の転写因子のチップ seq の広く使用できます。

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プロトコル

すべての動物の使用と実験的プロトコル ケアと実験動物の使用のためのガイドに従って実行され、機関のバイオ セーフティ委員会とテキサス大学健康科学センターで動物福祉委員会によって承認ヒューストン。

1. PDGFRα 肯定的なオリゴデンドロ サイト (前述の immunopanning プロトコル5,6,7より改変) マウス脳細胞の浄化

  1. PDGFRα 陽性細胞の選択と血管内皮細胞とミクログリアの枯渇のため 2 プレート immunopanning プレートの準備。
    注意: シャーレがない細胞培養皿が immunopanning 実験のために働くことを注意してください。バイオ セーフティ キャビネットの immunopanning 手順が遂行されなければならない場合は浄化された細胞は、培養に使用される、
    1. 10 cm 30 μ L ヤギ抗ラット IgG pH 9.5、4 ° C で一晩 50 mM トリス塩酸 10 ml をペトリネット プレート コートします。プレートの表面は、コーティング液で完全に均等にカバーされているかどうかを確認するプレートを揺り動かしなさい。
    2. ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 0.2 %bsa を含む 12 ml ラット抗 PDGFRα 抗体の希釈 40 μ L PDGFRα 抗体溶液を準備します。
    3. 10 mL で igg 抗体コーティング プレートの 3 洗浄後各、1 x DPBS は igg 抗体コーティング プレート 4 時間室温で PDGFRα 抗体溶液を孵化させなさい。
    4. ラット抗 PDGFRα 抗体コーティング プレート 3 回 10 mL で 1 x DPBS 洗浄。優しくプレートの側壁に沿って DPBS ソリューションを追加し、塗装面を邪魔しないでください。
    5. 20 ml Banderiaea simplicifoliaレクチン 1 (BSL-1) 2 h のための 2.3 μ g/mL を含む DPBS の血管内皮細胞とミクログリアの枯渇のための 2 新しい 15 cm ペトリ プレートをコートします。
    6. BSL 1 コーティング洗浄 1 x DPBS 20 mL で 3 回のプレートします。優しくプレートの側の壁に沿って DPBS ソリューションを追加し、塗装面を邪魔しないでください。
  2. 浄化の PDGFRα 肯定的なオリゴデンドロ サイト細胞が以前に発行されたメソッド6から変更,7, 8.
    1. 日 7 (P7) 生後 2 から大脳皮質組織を解剖マウス脳以前によると公開プロトコル5,6。
    2. 詳細の製造元の指示に従って神経組織解離キット (P) で単一細胞懸濁液を生成するために組織を切り離して考えます。
    3. 簡単に言えば、メスで切り裂かれた大脳皮質組織を切るし、37 ° C で酵素消化に消化後手動で単一細胞懸濁液をパスツール ピペット火磨かれたガラスを使って作品を切り離します。
    4. 室温で 10 分間 300 x g で単一細胞懸濁液を遠心し、15 mL の immunopanning バッファーを使用して細胞ペレットを中断 (immunopanning バッファーは 0.02 %bsa と 5 μ g/ml インスリン DPBS)。
    5. ミクログリアと血管内皮細胞のより良い枯渇を確保するため 2 の BSL 1 コーティング プレート プレート 5 分ごとの穏やかな攪拌を室温で 15 分間で順次 2 マウス脳から単一細胞懸濁液を孵化させなさい。
    6. 細胞懸濁液の非付着性のセルを収集し、45 分間室温のラット PDGFRα 抗体をコーティングしたプレートにそれらをインキュベートするプレートを軽く旋回します。
    7. ラット PDGFRα 抗体をコーティングしたプレートに細胞懸濁液の培養後優しく細胞懸濁液を収集するために版は渦巻きし、非付着性のセルを取り除く DPBS にプレートを 8 回をすすいでください。優しくプレートの側の壁に沿って洗浄ソリューションを追加し、非付着細胞を取り除くためにプレートの数回を揺り動かします。
    8. 37 ° C で 10 分間細胞剥離ソリューション治療の 4 つの mL を用いたラット PDGFRα 抗体コーティング プレートから細胞をデタッチします。付着性のセルを除去するプレートを振る。
    9. 室温で 300 × g で遠心分離による精製の Opc を収集、2 mL OPC 細胞培養培地で細胞ペレットを中断、トリパン ブルー色素と診断を使用して、セルをカウント (500 mL 細胞培養液は 5 mL を含む DMEM/F12 培地ペニシリン-ストレプトマイシン液 (P/S)、N2 5 mL、10 mL B27、5 μ g/mL インスリン、0.1 %bsa、20 ng/mL bFGF と 10 ng/mL PDGFRα)。
  3. Immunopanning 後の Opc の純度検証。
    1. Immunopanning 後 Opc の充実を評価するために、製造元の指示に従って guanidium 基づくチオシアン酸抽出による RNA 抽出精製した Opc のいくつかを使用します。
    2. QRT PCR を実行するには、以前に公開された資料4によると解離脳細胞と比較して精製した Opc の PDGFRα 式の濃縮を確認する緑の蛍光染料のマスターの組合せを使用します。
    3. さらに、いくつかの精製の Opc をポリ-D-リジン コーティングにシード 24 ディープウェル プレート アンチ NG2 コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (NG2) 抗体を用いた免疫染色は前述材料9を公開。

2. 低細胞チップの作製と高スループット シーケンスのチップ ライブラリ構築

  1. 市販の超音波システムと市販低細胞数チップ Olig2 低細胞チップ作製キット製造元から詳細な標準的な手順に従うことによっての (材料の表を参照してください)。
    1. ラット抗 PDGFRα からデタッチ後抗体をコーティングしたプレートとトリパン ブルーと診断を数えるセルは 1 mL OPC 培各チップの反作用のための 20,000 精製 Opc を置きます。
    2. 室温で 10 分間細胞懸濁液を修正する 36.5% ホルムアルデヒドの 27 μ L を追加します。
      注意: ホルムアルデヒドを化学の発煙のフード安全上の理由のため使用することに注意してください。
    3. 室温で 5 分間 50 μ L 2.5 M のグリシンと DNA タンパク質架橋を停止します。
      注: すべての手順遂行されなければならない氷の上またはこのポイントから 4 ° C の低温室内で。
    4. カクテル 1 ml の冷たいハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) プロテアーゼ阻害剤と架橋細胞ペレットを洗浄し、4 ° C で 300 x g で予冷遠心分離機によるペレットのセルを取得
    5. 25 で細胞ペレットを溶解 μ L 氷の上 5 分の換散バッファーの完了します。
      注: は、換散バッファーのセルを中断するチューブを揺り動かしなさい。
    6. セル lysate 75 μ L 冷たい HBSS プロテアーゼ抑制剤のカクテルと剪断を含む細胞ライセートでのクロマチン事前冷却 30 s および 30 s オフ プログラムの 5 サイクルの超音波システムを補足します。常に一緒に 6 管を超音波、100 μ L の水を含んでいるバランス チューブを確認します。
    7. 後は、14,000 × g 10 分間 4 ° C で遠心し、遠心分離後新しいチューブに上清を収集します。
    8. プロテアーゼ阻害剤と氷の完全なチップ バッファーの等量せん断クロマチンの 100 μ L を希釈します。
    9. 入力コントロールのサンプルとして希薄せん断クロマチンの 20 μ L を保存します。
      メモ: 入力コントロールのサンプルも Olig2 抗体免疫沈降された DNA を特定する Olig2 沈澱サンプルへの比較として必要です。
    10. 180 μ L の希釈ウサギ抗 olig2 抗体の 1 μ L, クロマチンを剪断が 4 ° C で 16 時間 40 rpm で回転ホイールの反応管をインキュベートを追加します。
      注: は、冷蔵室でこの手順を実行します。
    11. 各チップ反応ウォッシュ 55 μ L 11 μ L 磁気蛋白質 A コーティング ビーズ ビーズ洗浄バッファーとビーズを入れて 2 洗浄後 11 μ ビーズ洗浄バッファーでペレットします。
      注: は、冷蔵室でこの手順を実行します。
    12. 各チップ反応チップ反応管にあらかじめ洗浄蛋白質 A をコートしたビーズの 10 μ L を追加します。冷蔵室でこの手順を実行します。
    13. 4 ° C 回転ホイール上の別の 2 h でチップ反応管を孵化させなさい。
    14. 1 分の磁気ラックにチップ反応管を置きます。
      注: は、冷蔵室でこの手順を実行します。
    15. 上澄みを除去し、ビーズのペレットを除去しないでください。
    16. 4 ° C で回転ホイール上で 4 分間それぞれ 4 種類の洗浄バッファーの各ビード ペレット 100 μ L を洗う
    17. 洗浄後、ビーズ ペレットに 200 μ L の溶出バッファーを追加し、架橋蛋白質・ DNA を逆に 4 h 65 ° C でチップ反応管を孵化させなさい。
    18. さらに、20 μ L 入力コントロールのサンプルを溶出バッファーの 180 μ L を追加し、, 逆に架橋蛋白質・ DNA 同様 4 h の 65 ° C で。
    19. 各チップの反応管にフェノール、クロロホルム ・ イソアミル アルコールの 200 μ L 25:24:1 (v/v) の混合物を追加します。
    20. 1 分、室温で 15 分間 13,000 × g で遠心分離を精力的に渦。新しい管へ転送の上部の段階。
    21. 40 μ L 3 M 酢酸ナトリウム溶液、100% のエタノールの 1,000 μ L、2 μ L グリコーゲン変性の-20 ° C で一晩各チップの反応管に青い染料に共有にリンクを追加します。
    22. 13,000 x g で 4 ° C で 20 分間遠心
    23. 上澄みを廃棄、500 μ L 冷たい 70% エタノールで洗浄し、4 ° C で 20 分 13,000 × g で遠心
    24. 上澄みを廃棄、ペレット空気を 10 分で乾いた状態に保つ、50 μ L の水でペレットを溶解します。
  2. 高スループット シーケンスのチップ ライブラリ構築
    1. 清潔でクリーン アップ キット メーカーの指示に従ってチップ DNA を集中します。
    2. 製造元の指示に従ってピコ グリーン チップ サンプルを定量化します。
    3. T テーリング、レプリケーションおよびテーリング、テンプレートの切り替えおよび拡張、製造元の指示に従って浄化ライブラリ サイズ選択と増幅アダプターの追加チップ seq キットを使用します。
      1. DsDNA の変性後、エビのアルカリホスファターゼによって一本鎖 Dna の 3' 末端を dephosphorylate し、する ssDNA ターミナルトランスフェラーゼによるポリ (T) 尾を追加します。
      2. DNA 複製とテンプレートの切り替え ssDNA テンプレート DNA ポリ (dA) プライマーをアニールします。
      3. 後の鋳型の切り替え、インデックス作成のための前方および逆プライマーと pcr 法によるチップ seq ライブラリを増幅します。
      4. PCR はフラグメントに至る 250 500 でチップ seq ライブラリを増幅選択オプション 2 をダブル サイズ選択による常磁性ビーズで bp。
      5. マイクロ流体チップ キャピラリー電気泳動装置を使用して選択したチップ seq ライブラリの品質を確認します。

3. データ分析

  1. ディレクトリ構造を準備します。
    1. チップ seq データ分析の実行用のディレクトリを作成します。新しく作成されたディレクトリの中で次の名前 6 サブディレクトリを作成: raw.files、fastqc.output、bowtie.output、homer.output、macs2.output、motif.analysis、およびレポート。
  2. データを準備し、塩基配列データの品質管理分析を実行します。
    1. "Raw.files"ディレクトリに移動し、チップ seq データ ファイルをダウンロードします。
    2. ファイル名を確認します。ペアエンド シーケンス場合、同様のベース名と 4 つのファイル (治療のため 2)、入力のための 2 がある: PDGFRα_Olig2.read1.fastq、PDGFRα_Olig2.read2.fastq、PDGFRα_input.read1.fastq、および PDGFRα_input.read2.fastq。ファイル名が異なる場合は、"mv"コマンドを使用してそれらの名前を変更します。
    3. "Fastqc.output"ディレクトリに移動します。
    4. Fastq ファイル品質管理ソフトウェア10を使用して raw 読み取りから品質コントロールのメトリックを取得します。図 S1Aで fastq ファイルごとに個別に品質管理プロセスを実行するのにコマンドを使用します。ソフトウェアは、いくつかの品質管理基準を html ファイルに表示されます。
    5. Html 品質管理ファイルを開き、読み取りの数を確認、品質スコアがシーケンス、シーケンス GC 含量、シーケンス重複レベル、アダプターのコンテンツ及び造営尺度内容ごとの塩基質ごとの長さをお読みください。
  3. 末尾の低品質の読み取りとアダプターのコンテンツをトリミングします。
    1. 「あたり塩基品質」と「コンテンツ アダプター」のプロットを観察します。両方の頭と尾の各読み取りのトリミングの長さを決定します。トリミングの十分な長さは、基本品質が 30 を下回るし、アダプター内容の証拠があります。
    2. "Raw.files"ディレクトリに移動します。
    3. ダウンロードしてトリミング読み取り11用ソフトウェアをインストールします。図 S1Bで治療と入力の両方を個別にトリミングのコマンドを使用します。パラメーター '収穫' は、後端からトリミング拠点し、'HEADCROP' は、読み取りの開始から除去する拠点数を指定します残りの読み取りの長さを示します。
    4. トリミング コマンドには、最小の読み取り 'MINLEN' パラメーターでフィルター処理した後で受け入れられるために長さも含まれています。場合は読み取りが少なくとも 50 bp、読み取りの長さのしきい値として使用 35 bp。
    5. "Fastqc.output"ディレクトリに移動します。
    6. 読み取りをトリミング後 fastq ファイル品質管理分析を実行します。品質管理の問題が解決されたことを確認します。図 S1Cで品質コントロールのメトリックを取得するのにコマンドを使用します。
  4. シングル エンドまたはペアエンド チップ seq 読み取りマウス参照ゲノムの位置を合わせます。
    1. マッピングの"bowtie.output"ディレクトリに移動します。
    2. GENCODE mm10 マウス参照ゲノムをダウンロードします。"Mm10.fa"として mm10 マウスゲノムの参照を変更します。
    3. 読み取りマッパー12をダウンロードしてシステムにインストールします。
    4. 図 S2Aでコマンドを使用してダウンロードされた参照ゲノムのインデックス ファイルを作成します。6 つのファイルが自動的に作成されます: mm10.1.bt2、mm10.2.bt2、mm10.3.bt2、mm10.4.bt2、mm10.rev.1.bt2、および mm10.rev.2.bt2。
    5. 図 S2Bでコマンドを使用して配置を実行し、パラメーターを調整する"-p"システム設定に従って処理コアの数に。ペアエンド モードを実行中の場合、「-1」と「-2」のパラメーターはトリミング fastq ファイルの名前を示します。
      注: のマッピングは、治療と入力サンプルの別途に実行され、各サンプルのメトリック ログの出力ファイルが作成されます。
    6. サム形式13でファイルを操作するためのソフトウェアをダウンロードしてシステムにインストールします。図 S2Cでコマンドを使用して BAM ファイルに一直線に並べられた SAM ファイルを変換します。
  5. 両方のペアエンド治療とコントロール サンプルを呼び出すのピーク前にマップされたリードの品質管理基準を取得します。
    1. 1 つのアドレスに最も重要な品質管理指標はシーケンスの深さです。Bowtie.output ディレクトリにファイル"log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt"と"log.bowtie.PDGFRα_input.txt"を開き、各サンプルに一意に割り当てられた読み取りペア数が 1000 万より大きいことを確認します。
    2. "Homer.output"ディレクトリに移動します。
    3. モティーフの発見の次世代シーケンス解析14ソフトウェアをダウンロードし、システムにインストールします。
    4. "TagDir"という名前のディレクトリを作成します。
    5. タグ クローナリティを確認するには、図 S3Aに示されているコマンドを使用します。"MakeTagDirectory"コマンドは、4 つの品質管理出力 files:tagAutocorrelation.txt、tagCountDistribution.txt、tagInfo.txt、および tagLengthDistribution.txt に生成されます。
    6. "TagDir"ディレクトリに移動します。
    7. "TagCountDistribution.txt"ファイルを「レポート」ディレクトリにコピーします。
    8. 「レポート」ディレクトリに移動します。
    9. スプレッドシート プログラムを使用して tagCountDistribution.txt ファイルを開き、バーを作成するゲノム上の地位ごとのタグ数のプロット。ヒストグラム ファイル名"tag.clonality.xlsx"を格納します。
    10. システム プログラミング言語15 R をインストールします。
    11. ターミナルの 'R' を入力し、R のプログラミング環境にアクセスする ENTER キーを押します。
    12. 16チップ seq データを処理するための R パッケージをダウンロードしてS3B 図に示されているコマンドを使用してそれをインストールします。
    13. 鎖の相関をプロットするのに図 S3Cの R スクリプトを使用します。
  6. ピーク マッパーを使用してピークの検出。
    1. "Macs2.output"ディレクトリに移動します。ダウンロードし、お使いのシステムでピーク マッパー17をインストールします。
    2. 関数"callpeak"を使用し、治療し、3.4.6 のステップで生成される BAM ファイルを制御します。
      注: その他のパラメーターを含める"-f"入力ファイル形式の"-g"ゲノムのサイズの」-名」、すべての出力ファイルの基本名を示すためと"-B"フラグメント玉突き事故を bedgraph 形式で格納するため。コマンドを呼び出して完全なピークは、図 S4Aに含まれます。ペアエンド サンプルの BEDPE を使用します。
    3. ピーク時マッパーに 6 つのファイルが生成されることを確認してください: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_control_lambda.bdg と PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg。
    4. ファイルを開くと呼ばれるピーク、場所、長さ、位置、玉突き事故で、ピーク濃縮メトリックを表示する PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls:-log10(pvalue)、濃縮と log10(q-value) を折る。
  7. フィルターし、呼ばれるピークに注釈を付けます。
    1. 前の手順で開いたファイルを使用して、倍濃縮、p 値や q 値によりピーク フィルターの結果します。適切なフィルターのしきい値を決定するには、各メトリックの密度を決定するヒストグラム プロットを作る。著しいピークを取得する選択されたしきい値を下回る値を除外します。
    2. Mm10 ブラック リスト (地域は人工的に高信号と知られている) をダウンロードし、フィルター チップ seq をピークにそれらの成果物の地域の内にあります。
    3. 次の列を含むフィルターのピークを持つベッド ファイルを作成: 染色体、開始、終了、peakID、モック、およびストランド。ドットでモックの列を埋める"."使用していないので。鎖列のすべての値を設定「+」。ベッド ファイルを"filtered.peakData2.bed"として保存します。
    4. 「レポート」ディレクトリに"filtered.peakData2.bed"ファイルをコピーします。
    5. 「レポート」ディレクトリに移動します。
    6. 特定の遺伝子領域にフィルター処理されたピークを注釈付け、関数"annotatePeaks"ベッド ファイルに前の手順で作成したを使用します。図 S5Aに使用するコマンドを示します。
    7. 統計ソフトウェアを使用して"filtered.annotatedPeaks.txt"ファイルを開きます。
    8. 注釈付き TSS から 5 kb を超える距離の遺伝子間領域に横になっている結果のピークをフィルター処理します。フィルターのファイルの距離としての「距離に TSS」列を使用します。"5kbup.geneBody.peakData.txt"という名前の excel ファイルにフィルターのピークを格納します。
    9. 結果ストア フィルター列を持つ bedGraph ファイルのピーク: 染色体、開始、終了、および log10(q-value)。"5kbup.geneBody.peakData.bedGraph"ファイルを名前します。
  8. ブラウザーの可視化のための大物ファイルを生成します。
    1. ダウンロードしてゲノム算術18のためのソフトウェアをインストールします。
    2. 大物を bedgraph に変換するツールをダウンロードしてシステムにインストールします。'Mm10.chrom.sizes' ファイルをダウンロードします。
    3. 図 S6Aで大物ファイルを生成するのにコマンドを使用します。
    4. ダウンロードしてシステムに19ゲノム ブラウザーをインストールします。
    5. ゲノムのブラウザーを開き、フィルターの重要なピークと知られていた遺伝子に関してその場所を可視化する"5kbup.geneBody.peakData.bigwig"ファイルをロードします。
  9. モチーフ検索。
    1. "Motif.analysis"ディレクトリに移動します。
    2. スキャン・ デ ・ ノボモチーフとモチーフのウラン濃縮プログラムをダウンロードしてシステム20にそれをインストールします。
    3. Olig2 のモチーフを含む包括的なモチーフ データベースをダウンロードします。
    4. 大きなピークの頂上を中心とした 500 bp の領域のゲノムの配列を取得します。Peak.sequences.txt としてシーケンスを格納します。図 S7で Olig2 モチーフ各 500 bp ピーク領域内を検索するコマンドを使用します。
    5. 十分な E-値を使用して結果のモチーフをフィルター (既定 = 0.05)。

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結果

低細胞チップ seq を行い精製急性脳 Opc でゲノム DNA と転写因子 Olig2 の潜在的な相互作用を調査するため情報の解析が行われました。図 1は、実験とデータ解析手順の一般的なワークフローを示します。このプロトコルでは生後マウス脳単一細胞懸濁液に分離。組織解離後 immunopanning は PDGFRα 抗体を用いた Opc を浄化するために行われました。図 2は、PDGFRα、神経細胞マーカー Tuj1 の小さな表現の重要な濃縮 (ニューロン固有のクラス III β-チューブリン)、アストロ サイトのマーカー GFAP (グリア線維性酸性蛋白)、ミクログリア マーカー イオン化カルシウム結合アダプターを示しています分子 1 (Iba1)、髄成熟オリゴデンドロ サイト マーカー ミエリン塩基性タンパク質 (Mbp) やミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) 精製 Opc から RT qPCR による評価。さらに、免疫染色結...

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ディスカッション

哺乳類遺伝子制御ネットワークは非常に複雑であります。チップ seq、ゲノム蛋白質 DNA の相互作用を調査する強力な方法です。このプロトコルは、(低反応あたり 2 万セルとして) マウス脳から精製した Opc の数が少ないを使用して Olig2 チップ seq を実行する方法を説明します。このプロトコルの最初のキーのステップは、PDGFRα 抗体を用いた immunopanning によるマウス脳から Opc の浄化です。PDGFRα コーティング プレートと Opc の肯定的な選択のため、PDGFRα にしばしば弱バインドする Opc 塗布鋼板。いくつかの洗浄後もまだ左にいくつかの非付着性のセルがあります。各 D PBS 後非付着細胞を顕微鏡下で洗うをチェックすることが重要です。非付着性のセルの数を減らすためにより多くの D PBS 洗浄が解決しない場合に余分な洗浄が接続されている Opc を取り除くし、浄化された細胞の収量を減らすので選択したセルの収集です。しかし、他の脳細胞の種類の汚染に十分な洗浄があります。したがって、分離後、毎回GFAPのアストロ サイト、既知の細胞型のニューロン、 Tuj1...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

JQW、XD、RCDD、YY は、国家機関の健康 R01 NS088353; からの補助金によって支えられました。NIH グラント 1R21AR071583-01;Staman オギルビー基金記念ヘルマン財団;UTHealth 脳イニシアチブと CTSA UL1 TR000371;テキサス システム神経科学・神経研究所 (補助金 #362469) の大学からの助成金。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬/ 機器
Banderiaea simplicifolia lectin 1Vector Laboratories# L-1100
ラット抗PDGFRa抗体BD Bioscience# 558774
神経組織解離キット (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
AccutaseSTEMCELL technologies#07920
TRIzolThermo Fisher#15596026
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan AntibodyMillipore# AB5320
Bioruptor Pico sonication deviceDiagenode# B01060001
True MicroChIPキットDiagenode# C01010130
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)ThermoFisher# 15593031
NucleoSpin ゲル&PCR クリーンアップキットMACHEREY-NAGEL# 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher# P11496
DNA SMART ChIP-Seq kitClontech Laboratories# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
pico-greenThermo Fisher# P11496
D-PBSThermo Fisher# 14190-144
SYBR Green Master mixBio-Rad Laboratories# 1725124
DMEM/F12Fisher Scientific# 11-320-033
Penicillin-Streptomycin (P/S)Fisher Scientific# 15140122
N-2 サプリメントフィッシャー・サイエンティフィ#17502048
B-27 サプリメントフィッシャー・サイエンティフィ#17504044
インスリンシグマ#I6634mgのインスリンを10 mlの水と50 μに溶解して、0.5 mg / mlのインスリン溶液を調製します。1 N HClのl。
細胞培養(BSA)に適したウシ血清アルブミン(BSA)Sigma#A4161100mlのD-PBSに4 g BSAを溶解し、pHを7.4に調整することにより4%BSA溶液を調製します
線維芽細胞成長因子基本タンパク質、ヒト組換え(bFGF)EMDミリポア#GF003
ヒトPDGF-AAVWR#102061-188
-D-リジンVWR#IC1501751010 mgのポリD-リジンを10 mLの水に溶解して1 mg / mlのポリD-リジン溶液を調製し、使用する場合は100倍に希釈してください。.
ファルコン使い捨てペトリ皿、滅菌、コーニング、100x15mmVWR#25373-100
ファルコン使い捨てペトリ皿、滅菌、コーニング、150x15mmVWR#25373-187
HBSS、10X、カルシウムなし、マグネシウムなし、フェノールなし レッドフィッシャーサイエンティフィ#14185-052
トリパンブルーステムセルテクノロジー#07050
プロテアーゼ阻害剤カクテルSigma# 11697498001
ソフトウェア
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/生リードとトリミングリードの品質管理メトリクスの取得
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic生リード
のトリミングとフィルタリングGENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gzMouse reference genome
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
SAMTools 1.5[13] http://samtools.sourceforge.net/SAMファイルのBAM形式への変換
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/タグディレクトリを作成し、遺伝子記号R
3.2.215] https://www.R-project.org/スクリプトのプログラミングと関数の実行
SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/spp鎖相互相関プロットの作成
MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACS制御上のChIP濃縮領域の検索
BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ゲノム演算
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/bedGraph ファイルをbigwig
IGVブラウザに変換する 2.3.58[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/の視覚化と閲覧重要なChIP-seqピーク
Microsoft ExcelSpreasheetプログラム
ENCODEのブラックリストhttps://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklistsフィルタリングピーク
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes。bedGraphファイルのbigwig
ENCODEのモチーフデータベース[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/モチーフエンリッチメントに必要な包括的なモチーフデータベース
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.htmlenrichmentの分析と発見
<プライマー名>qPCR
Mbp-F:CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R:AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F:ACTGCCCCTAAGACAACC
Iba1-R:GCTTTTCCTCCTCTCGCAAATCC
Mog-F:GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R:><TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-RCATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFR&α;-FAGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-RGTCCCTCCACGGTACTCCT
ックック 5 ポリックで濃縮されたゲノム領域に注釈を付ける[への変換 qPCR motif

参考文献

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PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定
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