後根神経節 (DRG) の初代培養は、生理機能や感覚ニューロンの病理に関連するイベントを研究するよく使用されます。ここでは、我々 は FF 神経ペプチド受容体選択的なアゴニスト 2 刺激を入力後、神経伝達物質の放出を検出するための腰部後根神経節文化の使用を示します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
後根神経節 (DRG) では、感覚ニューロンの細胞体が含まれています。ニューロンのこのタイプは、皮膚、筋肉、内臓、中枢神経系の脊髄後角などの末梢組織を支配する 2 つの軸索と、擬似単極です。感覚ニューロンは、体性感覚、タッチ、痛み、熱、および自己感応の感覚を送信します。したがって、DRG 初代培養は、侵害受容の分子機構、感覚ニューロンと神経系の発達の生理機能を研究に活躍しています。培養神経細胞は、電気生理学、シグナル伝達、神経伝達物質のリリース、またはカルシウム イメージングを含む研究で適用できます。DRG 初代培養、科学者が単一の生化学の変化を監視する解離の DRG ニューロンの文化や生体内で実験に関連付けられている複数のセルは、多くの制約を克服します。市販に比べて利用 DRG ハイブリドーマ細胞不死化後根神経節神経細胞、組成や一次電池の特性より組織の感覚ニューロンに似ています。ただし、1 つの動物から分離できる培養後根神経節細胞の数が限られたため薬物標的の探索のハイスループット画面を実行することは困難です。現在の記事では、DRG のコレクションおよび文化のための手順を示します。さらに、FF の神経ペプチド受容体 2 型のアゴニストと後根神経節細胞 (カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CRGP) と P 物質 (SP)) ペプチド神経伝達物質の放出を誘発する (NPFFR2) の治療を紹介します。
概要
感覚ニューロンの細胞体は後根神経節内に含まれます。これらのニューロンは擬似単極、末梢組織と中枢神経系を支配します。感覚ニューロンの末梢神経終末は、筋肉、皮膚、内臓器官や骨、他の組織.の間であります。体性感覚1,の2つの昇順経路を介して脳に転送される脊髄後角、および信号の終末神経の末梢の感覚信号します。体性感覚を可能に (すなわちタッチ、痛み、および熱感覚) を感じ、知覚運動と空間的な向き (固有受容感覚)1,の3体。4 がある骨格筋、皮膚の受容に応答グループ II (a β) 繊維の感覚に対応し、グループ III (Aδ) (核内局在) 繊維と痛みに応答グループ V (C) 繊維を含むプライマリの求心性軸索のサブクラス群と温度。C 線維のみ、残りが異なる度に有髄髄、おりません。
侵害受容器は、組織の損傷の可能性を運ぶ侵害刺激 (機械的、熱的、化学的刺激) によって活性化される第一次感覚ニューロンです。これらのニューロンは、Aδ 有髄線維と無髄の C 線維1,4で構成されます。Aδ 繊維エクスプ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
実験動物を使用するすべてのメソッドに記載は、動物介護制度や長庚大学 (CGU 13-014) の使用委員会 (IACUC) によって承認されました。
1. 実験的ラットの腰部後根神経節を収集します。
- 腰椎の DRG コレクションの 3 週齢 Sprague-dawley (SD) ラットに 2 を使用します。
注: 以上 4 週齢ラットから収集した DRG ニューロンは、記載の培養条件下でよく成長はありません。 - オートクレーブですべての手術器具を滅菌します。
- チレタミンとチレタミン (20 mg/kg; 腹腔内注入 (IP)) の 1:1 混合物のラットを麻酔し、動物は、つま先ピンチ テストで足撤退応答を示さないまで待ちます。
注: 異なる麻酔戦略は、このプロトコルでは正常に使用できます。 - 商業ギロチンで斬首でラットを犠牲に。
- ギロチンを使用すると、前肢と大腿骨の間ラットの体幹を分離します。収集する地域の図は、図 1 aを参照してください。
注: 尾側切断線は大腿骨に吻側だけはずです。脊柱のカットのサイトが大きすぎる場合、腰椎の L6 DRG が摘出されます。 - 胸骨に沿ってカットし、解剖はさみ (図 2 a....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
24 ウェル プレートで培養ラット腰椎 DRG ニューロンは、グリア細胞の増殖を抑制する追加 Ara C と NGF 神経成長をサポートするための培養培地で栽培されました。生活の形態後根神経節細胞が観察されました。図 3に示すように、単一ニューロンの細胞体は日 1 皿の下部に取り付け、観測用に選択されました。軸索の伸長は 1-3 日目から監視されました。グリア細胞は複製され、感覚ニューロンの細胞体を囲むプロセスを拡張します。別の文化で神経細胞の形状を明らかにする CGRP タンパク質が染まりました。図 4、CGRP タンパク質染色細胞質および感覚ニューロンの軸索に表示されます。ニューロンとグリア細胞の核形態、DAPI 染色とは異なります。ニューロン グリア細胞よりも大きくより丸みを帯びた核があります。比較では、グリア細胞の核がより多くの楕円形 (図 4 b) でです。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
本稿ではラット腰椎のコレクション、酵素分解、文化紹介 DRG。NGF 神経栄養サポート、DRG ニューロンの軸索は細胞播種後 3 日以内延長。拡張の軸索細胞で細胞細胞体で合成され、軸索線維に沿って運ばれる CGRP タンパク質染色後明確に観測される.日以内のニューロンを囲むこれらの分割のグリア細胞をできるように、拡張も衛星細胞のプロセス。このプロトコルにより成長したプライマリの後根神経節細胞はニューロンを調節する細胞メカニズムへの調査に適しています。ここでは、神経ペプチド、CGRP と SP、NPFFR2 の選択的アゴニスト、dNPA による培養 DRG ニューロンからのリリースを刺激します。NPFFR2 は、NPFF の同種の受容体であり痛み感覚と規制経路22,23に参加する報告されています。CGRP と SP リリースの NPFFR2 依存性はさらに NPFFR2 siRNA を用いて検証しました。
DRG の文化には、感覚ニューロンと衛星細胞の両方が含まれてい.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
英語の編集を博士 M. コーキンズを感謝いたします。この作品は、長庚記念病院 (CMRPD1F0482)、長庚大学、健康加齢研究センター (EMRPD1G0171) と省の科学と技術 (105-2320-B-182-012-MY2) によって支持されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| タイルタミンとゾラゼパム(ゾレチル)の混合物 | ビルバック | ゾレチル50 | 麻酔薬 |
| ウシ胎児血清 | 生物産業 | 04-001-1 | 培養培地 |
| ピルビン酸ナトリウム | シグマ | S8636 | 培養培地 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 生物産業 | 03-033-1 | 培地 |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | 培地 |
| ポリ-l-リジン | Sigma | P9011 | コーティング皿 |
| コラゲナーゼ IA | Sigma | 9001-12-1 | 酵素消化 |
| ハンクの平衡塩溶液 | Invitrogen | 14170-112 | 培地 |
| トリプシン EDTA | バイオロジカル インダストリー | 03-051-5 | 酵素消化 |
| パスツールピペット | ヒルゲンベルグ | 3150102 | 細胞トリチュレーション |
| シタラビン (Ara-C) | Sigma | C6645 | 培地 |
| NGF | ミリポア | NC011 | 培地 |
| NPFFR2 siRNA | ダルマコン | L-099691-02-0005 | トランスフェクション |
| ノンターゲティング siRNA | ダルマコン | L-001810-10-05 | トランスフェクション |
| ニューロポーター試薬 | Genlantis | T400150 | トランスフェクション試薬 |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | ケイマン | 589001 | EIA |
| SP ELISA | ケイマン | 583751 | EIA |
| CGRP 抗体 | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
参考文献
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
