成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

サマリー

体外誘導 EndMT に関与する細胞のシグナル伝達経路を調査するために有用である内皮間葉転換 (EndMT) のためのプロトコルを説明します。この実験モデルでは、EndMT は MS 1 血管内皮細胞における TGF-β によって誘導されます。

要約

内皮細胞の表現型可塑性は、心血管系システム開発、心血管疾患や臓器線維症に関連付けられている様々 な条件に基づいています。これらの条件では、差別化された血管内皮細胞は、間葉系のような表現型を取得します。この内皮間葉転換 (EndMT) と呼ばれており血管内皮マーカーのダウンレギュレーション、間葉系のマーカー、および形態学的変化のアップレギュレーションが特徴です。形質転換成長因子 (TGF) を含むいくつかのシグナル伝達経路による EndMT-β、wnt シグナル、およびノッチ、原腸陥入、組織の線維化の分子メカニズム上皮間葉転換 (EMT) 重要のそれらに類似による規制とがんの転移。EndMT のメカニズムの理解は、ターゲット EndMT 診断および治療上のアプローチを開発することが重要です。EndMTの in vitroの堅牢な誘導は、一般的な遺伝子発現シグネチャを特徴付ける、druggable の分子メカニズムを特定する、EndMT の画面に便利です。ここでは、EndMT の誘導のための in vitro法について述べる。MS 1 マウス膵微小血管内皮細胞 TGF-β への長期暴露の後 EndMT を受けるし、複数の炎症性ケモカイン、サイトカインの誘導だけでなく、間葉系のマーカーと形態変化のアップレギュレーションを表示します。マイクロ Rna (miRNA) 変調の解析のためのメソッドが含まれています。これらのメソッドは、EndMT と EndMT する Mirna の貢献を根底にあるメカニズムを調査するためのプラットフォームを提供します。

概要

内皮間葉転換 (EndMT) は、差別化された血管内皮細胞は様々 な線維芽細胞のような間葉系細胞¹分子変化を受けるプロセスです。EndMT は、当初ハート^2,3の開発中に内皮細胞変換として記述されていた。心開発の初期段階、心臓の管は内部の心内膜と外側の心筋で構成されます。これらの 2 つの層は、心臓のゼリーと呼ばれる細胞外のマトリックスの層で区切られます。血管内皮細胞のマーカーを取得するには、胚の心内膜細胞間葉系細胞にトランジット、基になる心臓ゼリーに侵入して房室弁の中隔の基盤を提供する心臓のクッションの形成を促進半月弁。さらに、EndMT は、冠血管、腹部大動脈および肺動脈^4,5,6を含む他の胚の血管システムのペリサイトおよび血管平滑筋細胞の源に示唆されています。さらに、EndMT、発芽⁷生理的血管新生に関与しています。

証拠の蓄積は、EndMT が複数の心血管疾患と他の疾患^1,8にも関与していることを示唆しています。EndMT 関連付けられている条件は、血管石灰化、動脈硬化症、肺動脈高血圧症、海綿静脈奇形、臓器線維症、静脈グラフトを改造、同種移植片機能不全腎移植、癌^{8、します。 9,10、11,12,13,14,15,16,17, 18}. 最近の報告書は、いくつかの分子 EndMT マーカーが腎臓移植¹⁷で移植腎機能障害の診断と予後予測のためのツールをすることができます説明します。EndMT 関連細胞シグナル伝達経路の変調は心筋線維化を含むいくつかの病気の条件を改善するために示されているし、^8,15をモデル動物に静脈グラフトの改造します。したがって、メカニズムを理解すること基になる EndMT は、EndMT をターゲット診断と治療戦略を開発することが重要です。

EndMT は、細胞間の接合、渡り鳥の可能性の増加、VE カドヘリンなど血管内皮特異遺伝子のダウンレギュレーションと α-平滑筋アクチン (α SMA) を含む間葉系遺伝子の発現の損失によって特徴付けられます。さらに、EndMT と上皮間葉移行 (EMT)、間葉系細胞、上皮細胞に変換する同様のプロセス開発に貢献するかもしれない様々 なの細胞外マトリックス成分の変更された生産に関連付けられています。組織の線維化の^8,19。

最近では、EndMT のいくつかの生体外の研究は、EndMT^15,20の分子機構の詳細を解明しました。形質転換成長因子 (TGF) を含む様々 なシグナル伝達経路による EndMT-β、wnt シグナル、ワンランク上の¹と。中でも、TGF-β は EMT と EndMT の両方の誘導に重要な役割を果たしています。EndMT、短い露光では、不十分な²¹と思われる中様々 な血管内皮細胞の EndMT で TGF β の結果への露出を延長しました。ここで EndMT の誘導、どのマイル スヴェン 1 (MS-1) マウス膵微小血管内皮細胞を体外でEndMT TGF-β²⁰への長期暴露の後受ける簡単なプロトコルについて述べる。EndMT、形態学的変化、血管内皮マーカーのダウンレギュレーション、間葉系のマーカー、炎症性遺伝子、細胞骨格のアップレギュレーションの認刻極印の特徴を検討するこのモデルでは、複数のダウン ストリーム解析を実行できます。再編成とコラーゲンゲル収縮。

マイクロ Rna (Mirna) は ~ 22 nt 様々 な mRNA ターゲット^22,23の転写後遺伝子抑制の直接規制 Rna。シード シーケンスを介したターゲット認識による Mirna は標的遺伝子の数百人を抑制し、細胞の分化・増殖・運動など多様な細胞機能を調節します。これはまた、EMT と EndMT の規制の場合といくつかの miRNAs は EMT と EndMT^24,25の調節因子として報告されています。このレビューで提示した EndMT モデルは、簡単に EndMT の Mirna の役割をテストする miRNA 調節プロシージャと組み合わせることができます。現在レビューは MS 1 細胞における TGF β 誘導 EndMT を調査するための実験プロシージャを要約しも他の血管内皮細胞における TGF-β の EndMT 誘導条件の比較が含まれています。

プロトコル

1. EndMT の誘導

1. MS 1 細胞標準培養条件を維持し、密度を避けます。MS 1 セルのソースは、材料表の説明です。MS 1 細胞 10% 牛胎児血清 (FCS)、50 U/mL ペニシリン、50 μ g/mL ストレプトマイシンと最小必須培地-α (MEM-α) を使用します。
2. 10 cm 上を洗う MS 1 セル リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 皿し、プレートに 1.0 mL のトリプシンを追加します。37 ° C で 5 分間インキュベートします。
3. 9 mL の培地を使用してセルをデタッチします。15 mL チューブに細胞懸濁液を収集します。
4. 室温で 5 分間 300-400 x gで細胞懸濁液を遠心します。
5. 慎重に上澄みを除去し、予め温めておいた培地で細胞ペレットを中断します。
6. トリパン ブルー溶液と標準検定またはセルの自動カウンターを使用して実行可能なセルを数える。
7. 長い言葉の文化の cm²あたり 10 の³セル × 0.5 でコーティングされていない標準培養皿上にプレート MS 1 セルです。たとえば、プレート 5.0 x 10³セル/6 ウェルのプレートも文化.FCS の同じ濃度を含む同じ培地を使用します。MS 1 セル、TGF-β は FCS の使用と長期的文化 (少なくとも 48-72 時間) で EndMT を誘発します。
8. 24 h 後 TGF-β 2 (最終濃度 1 ng/mL) と内皮細胞を刺激します。
9. (5% CO₂、37 ° C) の加湿インキュベーターで培養細胞。形態学的変化に着目したときセルを毎日監視します。
10. 長期的文化の TGF-β 治療の 48 時間後 TGF β 2 を含む新鮮な予め温めておいた文化メディアとメディアを交換してください。
11. 下流の分析に進みます。通常、アクチン再編成を観察、治療の 24 時間後、TGF-β による治療の 48-72 時間後血管内皮マーカーのダウンレギュレーションと間葉系のマーカーの発現が観察されます。

2. 免疫細胞化学的解析

1. MS 1 細胞標準培養条件を維持します。
2. プレート MS 1 セル 4 にもよく (1.7 cm²) ごとの 10 の³セル × 1.0 で文化室スライドをセルします。スライドは、ゼラチンで塗装。ウェルあたり文化メディアの使用 0.5-1.0 mL。
3. 24 h 後 TGF-β 2 (最終濃度 1 ng/mL) と内皮細胞を刺激します。EndMT の岩の関与を解析するときは、TGF-β 治療に岩阻害剤の Y-27632 (10 μ M) 1 h 前を追加します。TGF-β シグナル伝達阻害の効果を評価する際は、TGF-β 受容体キナーゼ阻害剤が使用できます。
4. (5% CO₂、37 ° C) の加湿インキュベーターで培養細胞。アクチン再編成は、TGF-β 治療の 24 時間後 MS 1 細胞で観察されます。その他の変更は、治療の 48-72 時間後に明らかになります。72 h 文化、TGF-β 投与の 48 時間後 TGF-β を含む新鮮なメディアでメディアを交換してください。
5. F-アクチン染色
   1. TGF-β 治療の 24 時間後に、メディアを取り出し、1 × PBS、室温で 20 分間で 4% パラホルムアルデヒドとセルを修正 1 × PBS のセルをすすいでください。
   2. 0.2% トリトン X-100 室温で 5 分間、インキュベートします。
   3. 3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。
   4. タマゴテングタケ有機希釈からファロイジン tetramethylrhodamine B イソチオ シアン酸と孵化に室温で 1 時間ブロッキング バッファー。
   5. 3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。
   6. 室温で 5 分間シアニン核酸結合色素を持つ核を染色します。
   7. リンス スライドやマウント coverslips スライド メディアのマウントを使用してスライドの下向き。
   8. 共焦点顕微鏡で観察します。ファロイジンの蛍光性の検出の 543 nm レーザーと 560-615 nm の発光フィルターを使用します。633 nm レーザーと 650 を超える排出フィルターを使用して、染色性が核の nm。TGF-β による治療、時に厚いストレスファイバー形成過程を観察するでしょう。
6. VE カドヘリンと α SMA 染色
   1. TGF-β 治療の 72 時間後メディアを削除、50% メタノールとアセトン 50% セルを修正 (0.5-1.0 mL/ウェル) 5 分。
   2. すすぎ 3 回 1 × PBS のセル (0.5-1.0 mL の井戸あたり)。
   3. 製造元の推奨濃度によると暗闇の中で 4 ° C で一晩ブロック バッファーで一次抗体とインキュベートします。VE カドヘリン モノクローナル抗体 (BV13、1: 100 希釈)、Cy3 共役 α SMA モノクローナル抗体 (1A4、希釈 1: 200)²⁰を使用します。
   4. 3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。
   5. 製造元の推奨濃度によると暗闇の中で室温で 1 時間ブロッキング バッファーで VE カドヘリン抗体緑色素結合の二次抗体と細胞を孵化させなさい。
   6. 3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。
   7. 室温で 5 分間シアニン核酸結合色素を持つ核を染色します。
   8. リンス スライドやマウント coverslips スライド メディアのマウントを使用してスライドの下向き。
   9. 共焦点顕微鏡で観察します。543 nm レーザーと 560-615 nm の発光フィルターを α SMA (Cy3) の検出のために使用します。488 nm レーザーと 505-550 nm の発光フィルターを使用して、VE カドヘリンの発見のため。通常は、TGF-β 治療による治療、時に VE カドヘリン信号が小さくなり、α SMA 信号の増加が観察されます。

3. 三次元コラーゲン ゲル収縮アッセイ

1. コラーゲン ゲル収縮アッセイ前 72 h の TGF-β なしで MS 1 細胞の培養を実行します。
2. 型を準備私コラーゲンゲル氷の上。ミックス冷たいコラーゲン溶液、濃縮 10 倍 MEM 媒体、0.05 N 水酸化ナトリウム、2.2% NaHCO₃、および 200 mM HEPES pH 7.4 8:1 を含むコラーゲン希釈バッファー: 1 比。
3. ミックスのコントロールや TGF β 治療の血管内皮細胞懸濁液 (1.0 x 10⁶セル/200 μ L) の 200 mL とコラーゲン ゲル溶液の 800 μ l。TGF-β の扱われたサンプルは TGF-β 2 を追加 (1 ng/mL) 細胞懸濁液を。
4. 12 も培養プレートの各ウェルに 1.0 mL の混合物を追加し、37 ° C で 30-60 分のためのインキュベーターで固化することができます。
5. 糊では、MEM α 10 %fcs、50 U/mL ペニシリン、50 μ g/mL ストレプトマイシンを含むゲルをフロートに 1.0 mL をオーバーレイします。TGF-β の扱われたサンプルは TGF-β 2 を追加 (1 ng/mL) メディアに。
   注: TGF-β の扱われたサンプル追加 TGF-β ゲルと培地の両方に。
6. 48 h の 37 ° C でフローティングのゲルを孵化させなさい。
7. スキャナーを使用してプレートの底からゲルの画像をスキャンします。また、ゲル、ゲル上の固定距離でデジタル カメラを使用しての画像を記録します。
8. ImageJ を用いた画素数に基づくゲル表面領域を定量化します。フリーハンド選択範囲または選択ツールを使用してゲルを選択またはゲルを使用して選択"画像 |調整 |色のしきい値」ツールをクリックし、ゲルを使用して領域を決定する"分析 |メジャー"コマンドです。

4. miRNA 活動によってロックされた核酸を用いた miRNA 阻害剤の阻害

1. MS 1 細胞標準培養条件を維持します。
2. ロックされた核酸 (LNA) miRNA 阻害剤、合成マイクロ Rna 二重鎖または製造元の指示に従ってリポフェクション試薬を用いる Sirna (20 または 50 nM) を transfect します。詳細および LNA miRNA 阻害剤、合成 miRNA デュープレックスと Sirna のソースは、以前レポート^26,27に記載されました。MS 1 セルの製造元の指示に基づく標準的な導入手順は LNA miRNA 阻害剤、合成マイクロ Rna 二重鎖や Sirna の導入のために働きます。
3. 16-48 時間後に、TGF-β 2 (最終濃度 1 ng/mL) と内皮細胞を刺激します。
4. RNA 発現解析 (定量的 RT-PCR と RNA シーケンス (seq RNA) 解析)、免疫組織化学的解析、レポーターアッセイなど各種の下流の分析に進みます。下流の分析は、以前レポート^20,26,27に記載されています。

結果

TGF β は様々 な血管内皮細胞の EndMT の強力な誘導です。MS 1 細胞における TGF-β の 24 時間投与、F-アクチン染色アクチン ストレス線維 (図 1 a)²⁰の再編成を示しています。ROCK 阻害剤の Y-27632 の前処理は、アクチン再編成²⁰の誘導を阻害します。MS 1 血管内皮細胞は、古典的な石畳のような形態から TGF-β 治療 (図 1 b) に間葉系紡錘状の形態に変更します。TGF β 処理細胞は、細胞間の接触を失います。48-72 時間 TGF-β の投与、免疫細胞化学的解析は VE カドヘリンの発現の低下と α SMA (図 1) の発現の増加を示しています。TGF-β は、大幅に治療 (数字 1と1E

ディスカッション

それは 24 時間活性化 Ras および TGF-β 治療による MS 1 セルで EndMT である TGF-β 単独でこの短い期間²¹EndMT を誘導するために失敗したことが報告されています。一貫して、TGF-β 大幅に誘導 EndMT 長い治療 (48-72 h) 後 MS 1 セル²⁰を見ました。ひと臍帯など様々 な血管内皮細胞における TGF-β (2-6 日) との長期治療静脈内皮細胞 (株) ひと皮膚微小血管内皮細胞 (HCMEC)、冠動脈内皮細胞 (後、EndMT は、何度も観察されています。HCEC)、マウス肺血管内皮細胞 (MLEC)、ラット脳血管内皮細胞 (BEC)、ウシ大動脈血管内皮細胞 (BAEC)、不死化ウシ網膜微小血管内皮細胞 (iBREC)、およびヒツジ大動脈弁血管内皮細胞^{8, 18,29,}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MS-1細胞	American Type Culture Collection	CRL-2279
MEM-alpha	Thermo Fisher Scientific	32571036
TGF-beta2	R&D	302-B2-002
4ウェルLab-Tek IIチャンバースライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	154526
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Blocking One	nacalai tesque	03953-95
ファロイジン-テトラメチルローダミン B イソチオシアネート	Sigma-Aldrich	P1951
TOTO-3 ヨウ化物	サーモフィッシャーサイエンティフィック	T3604
VE カドヘリンモノクローナル抗体 (BV13)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14-1441-82
α-SMACy3モノクローナル抗体 (1A4)	Sigma-Aldrich	C6198
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスIgG (H+L)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-11001
カバースリップ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	174934
コラーゲン溶液	新田ゼラチン Inc.	Cellmatrix I-P
コラーゲン希釈バッファー	ニッタゼラチン(株)	Cellmatrix I-P
LNA miRNA阻害剤	EXIQON	miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex	Qiagen	miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778030
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027