紹介でバイスペシフィック抗体 GPC3 S Fab プロトコル大腸菌。精製 GPC3 S Fab GPC3 陽性肝癌細胞に対して強力な細胞毒性があります。
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この記事について
サマリー
要約
このプロトコルでは、建設、バイスペシフィック抗体 (bsAb) GPC3 S 工場の機能性研究をについて説明します。bsAbs は彼らの 2 つの異なる腕を介して 2 つの異なるエピトープを認識できます。bsAbs を積極的に直接腫瘍細胞を殺すために免疫細胞を募集する能力について研究されています。現在、bsAbs の大半は Fc 含む bsAbs または Fc 領域なし小さい bsAb デリバティブとして組換え蛋白の形で生産されています。本研究では GPC3-S-ファブ、抗体フラグメント (Fab) に基づいてバイスペシフィック抗体は抗 gpc3 由来抗体 GC33 抗 CD16 単一ドメイン抗体の Fab をリンクによって設計されました。GPC3 S 工場は、大腸菌で発現し、2 つの親和性クロマトグラフィーで精製できます。精製 GPC3 S 工場は具体的にバインドし、肝臓癌治療における GPC3 S 工場の潜在的なアプリケーションを示唆しているナチュラル キラー細胞を募集して GPC3 陽性肝癌細胞を殺します。
概要
モノクローナル抗体はがん治療1今広く使用されています。抗体の柔軟性のため様々 な抗体基づかせていたフォーマットを積極的に検討しています。BsAbs は、モノクローナル抗体と比較して、2 つの異なるターゲット同時にかつ効率的にトリガーをターゲットし、腫瘍細胞2を殺す免疫エフェクター細胞の募集を認識し、それらを有効にする 2 つの異なる抗原結合モジュールがあります。
現在の組換え bsAb 形式は一般的に 2 つのクラスを割り当てることができます: Fc 含む bsAbs と Fc 領域なし bsAbs。主に哺乳類細胞で生成される Fc 含む形式と比較して、bsAbs なし Fc 領域より小さいサイズの利点がある微生物式システムでより容易に作り出される、腫瘍組織をより効率的に浸透することができます3。
Fc 領域なし bsAbs 一般的単一鎖可変断片 (scFvs) や Fab3などの個々 のバインディング部分をリンクすることによって形成されています。安定ドメインなし bsAbs scFv フラグメントに基づいて、多くの場合は熱安定性、低溶解度、または集計4、
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プロトコル
人間の血のコレクションを含むプロシージャをすべては、太陽 Yat Sen 大学倫理委員会で承認されました。
1. GPC3 S 工場デザイン戦略
- アンチ GPC3 (ヒト GC3313) を抗 CD16 VHH14 (図 1) の工場にリンクして GPC3 S 工場を設計します。
- 合成し、以前に報告された12として pET26b と pET21a のベクトルに VH CH1-CD16 VHH と VL CL のクローンします。
2. 変換と文化
- 追加 100 100 VH-CH1-CD16 (図 1 a) を含む pET26b の ng 主務 BL21 の 100 μ L に VL CL (図 1 a) を含む pET21a の ng (DE3) 細胞。よく混ぜると氷 45 90 s、転送、42 ° C の水浴中 30 分加温の上を孵化し、氷上 3-5 分の間孵化させなさい。
- BL21 を含むチューブにホストゲノ....
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結果
GPC3 S 工場浄化
GPC3 S 工場から精製した大腸菌2 段階アフィニ ティー精製で最初 Ni-国税庁-アガロース、IgG CH1 の親和性の浄化が続くと.2 段階の親和性の浄化後 GPC3 S 工場は 1:1 (図 2 a) に近い 2 つのチェーンとの同質性を精製しました。VH CH1 CD16 VHH と VL CL ポリペプチドの存在は、別個の C 末端タグで識別できる反彼 VL CL 約 25 kDa と反フラグ VH-CH1-VHH 約 38 kDa (図 2 b)。2 段階の親和性の浄化後 ~1.2 mg タンパク質は SB 文化の 1 L から入手できます。さらに精製 GPC3 S Fab を特徴付ける、ゲルろ過を行った。標準的なマーカー (
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ディスカッション
本研究で提案する bsAbs の書式を新規作成するための戦略 GPC3-S-ファブをターゲットに GPC3 陽性腫瘍細胞 NK 細胞を募集することができます。S 工場はすてきな自然に基づいて抗 CD16 VHH11,12を追加することによって形式。BsAbs 含む Fc 領域と比べると、GPC3 S Fab 簡単に大規模な細菌のペリプラズムで製造することができます。
プロトコルで説明されている発現と精製方法を使用すると、機能的な可溶性 GPC3-S-ファブ大量に得た。ペリプラズム発現を促進する、信号シーケンス pelB大腸菌17ペリプラズムに分泌を直接に N 末端に追加されました。細胞質とは対照的細胞と外側の膜の間ペリプラズム空間におけるより酸化環境タンパク質フォールディングとアセンブリのいくつかの重要な蛋白質が装備され従って訂正フォールディングを促進して16
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
この作品は、R & D 計画の広東省 (中国) (2016A050503028) によって財政的に支えられました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 振とうインキュベーター | サーモフィッシャー | MAXQ 4000 | |
| 振とうインキュベーター | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| 遠心分離 | Cence | GL-10MD | |
| 遠心分離機 | ベックマン・コールター | Avanti j-26S XPI | |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | 5810R | |
| 紫外線分光光度計 | サーモフィッシャー | Nanodrop | |
| 分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置 | Mini-PROTEAN®テトラ | バイオ・ラッド | |
| トランスブロット装置 | Criterion | Bio-rad | |
| イメージングシステム | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein 液体クロマトグラム | GE Healthcare AKTA | avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | 5702R | |
| エンビジョンプレートリーダー | TECAN | Infinite F50 | |
| アンチHisタグ | eBioscience | 14-6657-82 | |
| アンチフラッグタグ | Σ | F1804 | |
| アンチヒューマン(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| 抗マウス IgG HRP リンク抗体 | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 アフィニティー樹脂 | サーモフィッシャー | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| マグネット | ステムセル | 18000 | |
| CCK8 キット | 同人堂 | CK04 | |
| DMEM | ギブコ | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | ギブコ | C11875500CP | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | シグマ | F2442 | |
| トリプシン | ギブコ | 15050-057 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | 細胞培養 |
| 標準マーカー | Sigma Aldrich | MWGF200 | ゲルろ過 |
| イソプロピル-b-D-チオ-ガラクトピラノシド (IPTG) | VWR 化学薬品 | VWRC0487-100G | |
| 透析チューブ | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| クナナマイシン | VWR | VWRC0408-100G | |
| アンピシリン | VWR | VWRC0339-100G | |
| トリプトン | サーモフィッシャー | LP0042B | |
| 酵母エキス | サーモフィッシャー | LP0021B | |
| NaCl | サンゴンバイオテクノロジー A100241 | ||
| トリズマベース | シグマアルドリッチ | T6791-1KG | |
| シ | グマアルドリッチ | V900106 | |
| グリシン | アラジン | A110752-500g | |
| KCl | アラジン | P112134-500g | |
| MgCl | シグマ アルドリッチ | V900020 | |
| 寒天 | サンゴン バイオテクノロジー | A505255-0250 | |
| リン酸カリウム、一塩基性無水物 (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| リン酸ナトリウム、二塩基性、無水 (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-メルカプトエタノール | VWR | 60-24-2 | |
| フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| リゾチーム | Sigma アルドリッチ | L6876-25G | |
| クーマシー ブリリアントブルー R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| ブロモフェノールブルー | サンゴンバイオテック | A500922-25G | |
| 牛血清アルブミン (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| グリセロール | Σ Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm プラスチック皿 | コーニング | 430167 | |
| 25cm2 フラスコ | コーニング | 430639 | |
| 96 ウェル 細胞培養クラスター | コーニング | 3599 | |
| ショ糖 | サンゴン バイオテック | A610498-0005 | |
| CHO | 中国科学院のタイプカルチャーコレクション | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | 中国科学院のタイプカルチャーコレクション | SCSP-528 | |
| HepG2 | 中国科学院のタイプカルチャーコレクション | TCHu 72 | |
| Huh7 | 中国科学院のタイプカルチャーコレクション | TCHu182 | |
| Hep3B | 中国科学院のタイプカルチャーコレクション | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
参考文献
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl ....
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再版と許可
