Method Article

GPC3 ターゲット バイスペシフィック抗体、GPC3 S Fab 強力な細胞毒性を持つ

DOI:

10.3791/57588

⸱

July 12th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, 2Center for Cellular & Structural Biology, Sun Yat-Sen University

In This Article

Summary

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紹介でバイスペシフィック抗体 GPC3 S Fab プロトコル大腸菌。精製 GPC3 S Fab GPC3 陽性肝癌細胞に対して強力な細胞毒性があります。

Abstract

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このプロトコルでは、建設、バイスペシフィック抗体 (bsAb) GPC3 S 工場の機能性研究をについて説明します。bsAbs は彼らの 2 つの異なる腕を介して 2 つの異なるエピトープを認識できます。bsAbs を積極的に直接腫瘍細胞を殺すために免疫細胞を募集する能力について研究されています。現在、bsAbs の大半は Fc 含む bsAbs または Fc 領域なし小さい bsAb デリバティブとして組換え蛋白の形で生産されています。本研究では GPC3-S-ファブ、抗体フラグメント (Fab) に基づいてバイスペシフィック抗体は抗 gpc3 由来抗体 GC33 抗 CD16 単一ドメイン抗体の Fab をリンクによって設計されました。GPC3 S 工場は、大腸菌で発現し、2 つの親和性クロマトグラフィーで精製できます。精製 GPC3 S 工場は具体的にバインドし、肝臓癌治療における GPC3 S 工場の潜在的なアプリケーションを示唆しているナチュラル キラー細胞を募集して GPC3 陽性肝癌細胞を殺します。

Introduction

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モノクローナル抗体はがん治療1今広く使用されています。抗体の柔軟性のため様々 な抗体基づかせていたフォーマットを積極的に検討しています。BsAbs は、モノクローナル抗体と比較して、2 つの異なるターゲット同時にかつ効率的にトリガーをターゲットし、腫瘍細胞2を殺す免疫エフェクター細胞の募集を認識し、それらを有効にする 2 つの異なる抗原結合モジュールがあります。

現在の組換え bsAb 形式は一般的に 2 つのクラスを割り当てることができます: Fc 含む bsAbs と Fc 領域なし bsAbs。主に哺乳類細胞で生成される Fc 含む形式と比較して、bsAbs なし Fc 領域より小さいサイズの利点がある微生物式システムでより容易に作り出される、腫瘍組織をより効率的に浸透することができます3。

Fc 領域なし bsAbs 一般的単一鎖可変断片 (scFvs) や Fab3などの個々 のバインディング部分をリンクすることによって形成されています。安定ドメインなし bsAbs scFv フラグメントに基づいて、多くの場合は熱安定性、低溶解度、または集計4、

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Protocol

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人間の血のコレクションを含むプロシージャをすべては、太陽 Yat Sen 大学倫理委員会で承認されました。

1. GPC3 S 工場デザイン戦略

  1. アンチ GPC3 (ヒト GC3313) を抗 CD16 VHH14 (図 1) の工場にリンクして GPC3 S 工場を設計します。
  2. 合成し、以前に報告された12として pET26b と pET21a のベクトルに VH CH1-CD16 VHH と VL CL のクローンします。

2. 変換と文化

  1. 追加 100 100 VH-CH1-CD16 (図 1 a) を含む pET26b の ng 主務 BL21 の 100 μ L に VL CL (図 1 a) を含む pET21a の ng (DE3) 細胞。よく混ぜると氷 45 90 s、転送、42 ° C の水浴中 30 分加温の上を孵化し、氷上 3-5 分の間孵化させなさい。
  2. BL21 を含むチューブにホストゲノ....

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Results

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GPC3 S 工場浄化

GPC3 S 工場から精製した大腸菌2 段階アフィニ ティー精製で最初 Ni-国税庁-アガロース、IgG CH1 の親和性の浄化が続くと.2 段階の親和性の浄化後 GPC3 S 工場は 1:1 (図 2 a) に近い 2 つのチェーンとの同質性を精製しました。VH CH1 CD16 VHH と VL CL ポリペプチドの存在は、別個の C 末端タグで識別できる反彼 VL CL 約 25 kDa と反フラグ VH-CH1-VHH 約 38 kDa (図 2 b)。2 段階の親和性の浄化後 ~1.2 mg タンパク質は SB 文化の 1 L から入手できます。さらに精製 GPC3 S Fab を特徴付ける、ゲルろ過を行った。標準的なマーカー (

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Discussion

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本研究で提案する bsAbs の書式を新規作成するための戦略 GPC3-S-ファブをターゲットに GPC3 陽性腫瘍細胞 NK 細胞を募集することができます。S 工場はすてきな自然に基づいて抗 CD16 VHH11,12を追加することによって形式。BsAbs 含む Fc 領域と比べると、GPC3 S Fab 簡単に大規模な細菌のペリプラズムで製造することができます。

プロトコルで説明されている発現と精製方法を使用すると、機能的な可溶性 GPC3-S-ファブ大量に得た。ペリプラズム発現を促進する、信号シーケンス pelB大腸菌17ペリプラズムに分泌を直接に N 末端に追加されました。細胞質とは対照的細胞と外側の膜の間ペリプラズム空間におけるより酸化環境タンパク質フォールディングとアセンブリのいくつかの重要な蛋白質が装備され従って訂正フォールディングを促進して16

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Disclosures

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著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

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この作品は、R & D 計画の広東省 (中国) (2016A050503028) によって財政的に支えられました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
振とうインキュベーターサーモフィッシャーMAXQ 4000
振とうインキュベーターZhichengZWYR-D2402
遠心分離CenceGL-10MD
遠心分離機ベックマン・コールターAvanti j-26S XPI
遠心分離機エッペンドルフ5810R
紫外線分光光度計サーモフィッシャーNanodrop
分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置Mini-PROTEAN®テトラバイオ・ラッド
トランスブロット装置CriterionBio-rad
イメージングシステムBio-radchemidoc tm XRS+
Fast Protein 液体クロマトグラムGE Healthcare AKTAavant
GF columnGE Healthcare28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Flow CytometerBeckman CoulterFC500
遠心分離機エッペンドルフ5702R
エンビジョンプレートリーダーTECANInfinite F50
アンチHisタグeBioscience14-6657-82
アンチフラッグタグΣF1804
アンチヒューマン(H&L)-488A11013Invitrogen
抗マウス IgG HRP リンク抗体Cell Signaling7076S
Ni-NTA-AgaroseTribioscienceTBS9202-100
IgG-CH1 アフィニティー樹脂サーモフィッシャー194320005
Ficoll-Plaque PlusGE Healthcare17-1440-03
NK cell enrichment kitStemcell19055
マグネットステムセル18000
CCK8 キット同人堂CK04
DMEMギブコC11995500CP
RPMI-1640ギブコC11875500CP
ウシ胎児血清 (FBS)シグマF2442
トリプシンギブコ15050-057
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122細胞培養
標準マーカーSigma AldrichMWGF200ゲルろ過
イソプロピル-b-D-チオ-ガラクトピラノシド (IPTG)VWR 化学薬品VWRC0487-100G
透析チューブSigma AldrichD0655-100FT
クナナマイシンVWRVWRC0408-100G
アンピシリンVWRVWRC0339-100G
トリプトンサーモフィッシャーLP0042B
酵母エキスサーモフィッシャーLP0021B
NaClサンゴンバイオテクノロジー A100241
トリズマベースシグマアルドリッチT6791-1KG
シグマアルドリッチV900106
グリシンアラジンA110752-500g
KClアラジンP112134-500g
MgClシグマ アルドリッチV900020
寒天サンゴン バイオテクノロジーA505255-0250
リン酸カリウム、一塩基性無水物 (KH2PO4)VWR7778-77-0
リン酸ナトリウム、二塩基性、無水 (Na2HPO4)VWR7558-79-4
2-メルカプトエタノールVWR60-24-2
フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)VWR329-98-6
リゾチームSigma アルドリッチL6876-25G
クーマシー ブリリアントブルー R250VWRVWRC0472-50G
ブロモフェノールブルーサンゴンバイオテックA500922-25G
牛血清アルブミン (BSA)VWRVWRC0332-100G
グリセロールΣ AldrichV900122
100mm x 20mm プラスチック皿コーニング430167
25cm2 フラスココーニング430639
96 ウェル 細胞培養クラスターコーニング3599
ショ糖サンゴン バイオテックA610498-0005
CHO中国科学院のタイプカルチャーコレクションGNHa 3
MHCC-97H中国科学院のタイプカルチャーコレクションSCSP-528
HepG2中国科学院のタイプカルチャーコレクションTCHu 72
Huh7中国科学院のタイプカルチャーコレクションTCHu182
Hep3B中国科学院のタイプカルチャーコレクションTCHu106
NK92ATCCCRL2408
機 ・

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
  2. Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl ....

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Bispecific AntibodyGPC3 S FabE coli ExpressionNickel NTA PurificationNatural Killer CellsCytotoxicity AssayPeriplasmic FractionPBMC IsolationGPC3 BindingAffinity Chromatography

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