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方法論記事

リポ多糖の腸粘膜バリアー違反の後微生物由来製品の入り口を模倣するマウスに注射

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⸱

DOI:

10.3791/57610

⸱

2018年5月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital of Basel

この記事について

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サマリー

ここで腸の障壁の違反の後細菌由来化合物の入り口を模倣するためのプロトコルが表示されます。リポ多糖の低致死線量は全身投与後 24 時間の監視されたマウスに注入しました。プロ炎症性サイトカインの発現は大腸、肝臓、脾臓でいくつかの時点で決定されます。

要約

腸管の上皮バリアは通常容認または無視される細菌叢からホストを切り離します。この障壁の違反は、ホスト、ホストの循環および炎症性腸疾患 (IBD) の患者に見られる無秩序の炎症につながる内部器官へのアクセスに細菌や細菌由来製品の入り口に結果を腸上皮透過性亢進によって特徴付けられます。

ホストに細菌由来化合物の入り口を模倣するには、エンドトキシン血症モデルのどのリポポリサッカライド (LPS)、グラム陰性菌の外側の細胞壁の成分で採用されている、マウスに注入しました。本研究では LPS の致死線量は腹腔内投与し、マウスその後 8 h 病スコアを使用して調査しました。さらに、炎症性サイトカインIl6、 Il1b、および日のレベルを異なる時点で qPCR 脾臓、肝臓、結腸で行った式は、lps を投稿します。このモデルは、微生物や体表面の障壁の違反によって引き起こされる細菌由来製品の侵入の後の免疫反応の調査を含む研究の役に立つかもしれない。

概要

人間の腸は、進化の過程でホストと相互に有益な関係を開発したが、内細菌叢を形成する微生物の大規模なコンソーシアムと植民地化します。この関係でホスト、細菌はビタミン、栄養素の消化や、微生物叢が1に存在する、ホスト病原体からの保護を提供しますが、微生物叢のため確保するニッチ市場に提供します。このホストと、細菌の有益な関係が妨げられるとき炎症性腸疾患 (IBD) などの病気は成長できます。IBD は、クローン病 (CD) と潰瘍性大腸炎 (UC) の 2 つの主要な形式は、遺伝と環境要因によって引き起こされる腸の多因子性の慢性炎症性疾患です。IBD の 2 つの形式の間の類似点にもかかわらず、彼らは場所や炎症性変更の性質の特定の相違によって特徴付けられます。CD は、UC は、非貫壁性とコロンに制限されている可能性がある消化管のどの部分に拡張できます再発貫壁性の炎症性疾患です。さらに、ヌクレオチド結合のオリゴメリゼーション ドメインを含む蛋白質 2 (NOD2) ムラミルジペプチド (MDP) 最もグラム陽性および陰性菌の細胞壁成分を認識するパターン認識受容 (PRR) の変異は、します。CD2に関連付けられています。なお、エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)、リステリアやレンサ球菌や自社製品すべてを見つけられたマクロファージ内バリア3に違反した後、ホストを入力した CD 患者の。細菌や自社製品 CD の開発中にホストを入力、免疫システムは循環抗細菌抗体4の生産につながる反応を開発しています。多分、IBD の病因における微生物叢の役割のための最も説得力のある証拠は、マウスモデルから生じています。動物は抗生物質と扱われたとき、またはマウス (GF) の無菌状態で保たれるとき、病気の重症度はほとんどの大腸炎モデルなどで減る IL-10-/-マウスの GF 設備5,6の大腸炎を発症しません。さらに、大腸炎はまた不均衡な構成によって特徴付けられる、dysbiosis7と呼ばれる豊かさの減少細菌叢の組成を妨げます。IBD の結果は、ホストに微生物や微生物由来製品の入り口につながることができます消化管の透過性が亢進することができます。

動物では、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) のアプリケーションは上皮バリア8の透過性亢進につながる腸上皮の違反を誘発します。ポータルの LPS 濃度が DSS 大腸炎9動物に昇格されます。興味深いことに、欠けている、C 型レクチン受容体細胞内の特定の接着分子-3 動物 nonintegrin をつかんで関連の相同物 1 (記号 R1) から保護されます DSS 大腸炎と LPS 誘導性エンドトキシン血症10。さらにホストに発信、細菌や細菌の派生製品が血管障害11、大小の腸がある腹膜、腸間膜リンパ節や肝12を渡す必要が。このシステムの複雑さを減らすためには、定義された細菌由来の化合物が使用されました。LP、腹腔や静脈の後のエンドトキシン血症をおこす注射13はインターロイキンIl6の式とインナーリードボンディングと組合への応答におけるサイトカイン日の勉強をマウスに注入されました。

LPS は、病原体関連分子パターン (種緑化) 脂質 A で構成されるグラム陰性菌の細胞壁成分として表現される (LPS の構造の主な種緑化)、コア オリゴ糖、O 側鎖14。Toll 様受容体 4 (TLR4) 上皮細胞、マクロファージ、樹状細胞によって表現される組合15、適切なバインド用共受容体を必要とするを認識します。急性期タンパク質 LPS 結合タンパク質 (LBP) 転送分化 14 のクラスターに LPS (CD14) 一種アンカー型膜タンパク質複合体を形成する組合にバインドします。CD14 さらに TLR4 の細胞外ドメインに関連付けられているリンパ球抗原 96 またはまたとして知られている MD-2 LP を往復します。LPS の MD 2 の結合を容易に下流シグナリング経路14、骨髄性分化プライマリを含むをアクティブに細胞内のアダプターの分子を募集する構造変化を誘発する TLR4/MD-2 の二量体化応答遺伝子 88 (MyD88) - 依存経路と TIR ドメインを含むアダプター誘導インターフェロン-β (TRIF) - 依存経路16。TLR4 の lp レコードの認識は、NF-κ B の経路をアクティブにし、tnf α、IL-6、および il-117などの炎症性サイトカインの発現を誘導します。

特に、動物、動物に与えられた組合の濃度が注入される組合動物とダイエットの遺伝的背景が考慮されるが。組合の高濃度は、敗血症性ショック、低血圧と複数の臓器障害によって特徴づけられる、最終的に死の18に。マウスは、人間と比較して組合に敏感 2 4 ng/kg 体重 (BW) LPS 濃度がサイトカイン ストーム19を誘導することができます。マウス、マウス範囲 10-25 mg/kg BW20使用マウス株に応じてからの半分の死を誘導する致命的な線量 (LD50)。致命的な線量 50% (LD50) は、一般的に使用されるマウス系統、C57Bl/6 および BALB/c 10 mg/kg BW です。対照的に、C3h/hej および C57BL/10ScCr 系統による LPS エンドトキシン血症、 Tlr421の突然変異が原因ですから保護されます。したがって、Tlr4 欠損マウスは LPS22注射する hyporesponsive です。化における PARP1-/-マウス23などの他の遺伝子組み換えマウス線 LPS 誘導性有毒な衝撃に耐性があります。

説明マウス モデルはここ、体の表面の障壁の違反の後組合の普及の結果を模倣するように全身管理組合の致死線量を使用します。選択した LPS 濃度 (2 mg/kg BW) C56Bl/6 マウスの死亡率が、炎症性サイトカインの放出を誘発しなかった。

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プロトコル

マウスは飼育され、特定条件下で病原体フリー (SPF) 動物実験施設でバーゼル大学 (バーゼル、スイス連邦共和国) 生物医学の続けた。スイス連邦および州の規則 (動物のプロトコル番号 2816 [カントンのバーゼル ・ シュタット]) に従ってすべてのマウス実験を行った。

1. 組合溶液の調製

  1. 無菌条件下での大腸菌0111:B4 から精製した LPS の在庫を開き、5 mg/mL の濃度に水でそれを再構成します。
  2. 作業濃度 0.2 μ g/μ L の滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と組合の株式を希釈します。

2 LPS のマウスの腹腔内投与

  1. 層流空気流中における 30 G 針で 0.5 mL シリンジでソリューションの作業組合を吸い出しなさい。
  2. 注入される LP の量を計算して女性の c57bl/6 マウス (10 週齢 6) の重量を量る: 10 μ L (2 μ g)/g 体重。
    注: たとえば、マウスの重さ 20 g、20 g × 10 μ L = 200 μ L LPS 注入するソリューション ニーズの作業します。
  3. 優しく、しっかりとマウスを処理し、1 つの手で動物を抑制します。動物が普通に呼吸するが、ないにツイストし、拘束中にできることを確認します。
  4. 注射用腹部を公開する床に向かって少しマウスの鼻を傾けます。正中線から左右低腹部の腹部と噴射場所の正中線を探します。LP ではなく i. p. PBS をマウスに注入します。
  5. 無料の手で適切なボリューム (ステップ 2.2 で計算されたボリューム) を注入作業ソリューション lps。針が入ったことで腹膜としてそれ以外の場合、腹部の筋肉層への誤注入が発生するかどうかを確認します。まだ、行っていない針で深すぎるその地区の内部器官の負傷を避けるために腹腔内に。
  6. 1 檻あたり最大 5 マウスをケージに動物を慎重に戻ります。

3. モニター、マウス

  1. 発生とエンドトキシン血症の重症度の 8 h の注入後注射とすべての 2 h の時に動物を監視します。そのため、以前に公開された原稿24から適応されているスコア シート (表 1) を使用します。
  2. 次のパラメーターを表 1 に示すスコア LPS 注入マウス
    1. 通常滑らかになる毛皮の外観を確認します。毛皮に波立たせられた、先の尖ったまたはふくらんでいる毛皮の不快感や痛みを示すが表示される場合は、1、2、または 3 でスコアします。
    2. マウスの動作を確認します。
      注: マウス通常移動自由に食べて、飲んで、登山、全体のケージの周り、抑制または制限された活動は、痛みの兆候かもしれない。
    3. 意識のレベルをチェックします。
      注: マウスは非常に好奇心が強く、彼らは通常周辺を調査してケージの周りに移動します。不足または減らされた動きは、痛みや不快感にお勧めできます。
    4. 目をチェックします。
      注: 完全に開いて目が健康なマウスに期待されているが、おそらく分泌物と、部分的または完全に閉じた目は痛みの指標をすることができます。
    5. 呼吸率をチェックします。
      注: 健康なマウスに通常が通常、急速な呼吸率、減らされた呼吸の不快感の徴候である可能性があります)。
    6. 呼吸の質をチェックします。
      注: 不自然な呼吸やあえぐことがなく、痛みのサインです。

4 リボ核酸 (RNA) の抽出と均質化のため組織サンプリング

  1. コレクション/均質化管の準備: 1.4 mm セラミック球が充填された追加 1 mL シングル ステップ RNA 分離試薬 2 mL チューブに。
  2. 適切な時点で ((0 h) 前に 2 h、4 h と 8 h LPS 投与後) 後急激に麻酔薬の過剰摂取 (イソフルラン) とマウスを安楽死させるし、解剖を進めます。
  3. 皮膚と筋層のはさみのペアを使用内部の臓器を腹腔内を公開するカットします。
  4. 慎重に脾臓、肝臓と大腸の解剖、脂肪から臓器をきれい、氷の上の PBS でそれらを保ちます。
  5. ハサミやメスを使用して各器官からの小さい部分 (約 0.5 cm 長い) をカットします。
    注: 常に各マウス (肝、近位または遠位結腸部の同じ葉) の器官のおよそ同じ部分からの部分を取ることが重要です。
  6. まもなく紙組織片の組織を乾燥し、RNA 分離試薬に完全に没頭していることを確かめるコレクション/均質化管に配置。
  7. 高速卓上ホモジナイザーで組織をホモジナイズしてください。脾臓、肝臓、結腸、速度 6.00 で均質化の 1 サイクルを使用して、30 のような軟部組織の s。
  8. 室温で 5 分間のサンプルをインキュベートします。
  9. 慎重にチューブを置き、液体窒素凍結をスナップを組織ライセート。RNA の隔離まで-80 ° C にて凍結スナップインを格納します。

5 組織から RNA の抽出

注: アルコール、クロロホルム、分離試薬 RNA は、有害物質として考慮されます。化学のフードの下で RNA の抽出を実行します。RNase フリーの環境を維持するために認定の RNase フリー試薬と装置を使用します。

  1. 相分離
    1. 氷の上凍結組織ライセートを解凍します。
    2. 左が残りの組織粒子をペレットへの 4 ° C で 5 分間 1,000 x g のサンプルを遠心します。
    3. 新しいヌクレアーゼ フリー 1.5 mL チューブに上清を転送します。
    4. 200 μ L の冷たいクロロホルム 1 mL RNA 分離試薬ごとに追加、10-15 秒の手によって積極的に振る。
    5. 室温で 2-3 分間インキュベートします。
    6. 12 で遠心分離機、4 ° C で 15 分間 000 x g
      注: 3 つのフェーズが含まれます今サンプル: 赤フェノール クロロホルム相、相間、上部の無色の水相を下げます。上層の水相に RNA があります。
    7. 新しいヌクレアーゼ フリー 1.5 mL チューブに上層の水相 (総量の 50%) と転送を収集します。
  2. RNA の沈殿物
    1. 1 mL RNA 分離試薬あたり 0.5 mL 冷たいイソプロパノールを追加、5-6 回チューブを反転して軽く混ぜます。
    2. 室温で 10-15 分間インキュベートします。
    3. 4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離
      注: RNA の餌は、この段階で表示する必要があります。
  3. RNA の餌の洗浄
    1. ペレットを乱すことがなく、イソプロパノールを含む上清を完全に削除します。
    2. 初期の換散に使用される 1 mL RNA 分離試薬あたり 1 mL 冷たい 75% エタノールの餌を洗浄します。
    3. 渦サンプルを簡単に。
    4. 4 ° C で 5 分間遠心する 7,500 (または 12,000) × g のサンプル
  4. RNA を溶解
    1. ペレットを乱すことがなく清エタノールを完全に削除します。
    2. 室温で RNA の餌を風乾する 3-5 分の化学のフードの下で開かれたチューブのまま (乾燥しないでください以上その場合は RNA を分解することは困難であるので)。
    3. 上下慎重にピペットで 20-50 μ L ヌクレアーゼ フリー水に RNA ペレットを溶解します。
    4. さらに RNA のソリューションを改善するために 10-15 分の 55 ° C にサンプルをインキュベートします。
      注: この段階で RNA はさらに詳しい分析まで-80 ° C で保存できます。

6. 残りの DNA の消化力

  1. 分光光度計で分光光度計に (2 μ l) に硫酸をピペッティングによる RNA 濃度を測定し、推奨の濃度を調整します。
  2. Max で DNA を汚染の消化を開始します。50 μ L ヌクレアーゼ フリー水で 10 μ g の RNA。
  3. DNase 私のバッファーと 1 μ L rDNase 上下サンプルと軽くピペッティングによるミックス当り x 10 の 0.1 のボリュームを追加します。
  4. 37 ° c 20-30 分間インキュベートします。
  5. 渦 DNase 不活化試薬ピペットとよく混合サンプルに 0.1 のボリュームを追加します。
  6. 時々 手で混ぜ、室温で 5 分間インキュベートします。
  7. 1.5 分 10,000 × g で遠心分離機します。
  8. 無料の DNA の RNA を含む新しいヌクレアーゼ フリー チューブに上清を転送します。
  9. 分光光度計による RNA 濃度と品質を測定します。

7. 逆のトランスクリプション

  1. 逆のトランスクリプションのため市販のデオキシリボ核酸の cDNA の逆のトランスクリプション (RT) キットを使用します。
    注: ここでは、RNA の 2 μ g まで取り消すことができます転写。
  2. 2 μ g RNA が含まれたボリュームを計算します。新しい PCR チューブに 2 μ g RNA のピペットします。
  3. ヌクレアーゼ フリー水を 10 μ L の最終巻に PCR チューブにサンプルに追加します。
  4. 表 2に記載されている次のコンポーネントを混合することによってマスター ミックス 2 x を準備します。
  5. 20 μ L の総ボリュームのマスター ミックス × 1 を入手する 10 μ l RNA に 10 μ L 2 × マスター ミックスを追加します。
  6. ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブとスピン ・ ダウン サンプルを簡単に閉じます。
  7. PCR たちにサンプルを配置し、表 3の設定を設定します。
  8. さらに分析のための-20 ° C で生成された cDNA を格納します。

8. 量的な PCR (qPCR)

  1. 市販キットと qPCR 反応を実行します。
  2. 自己設計し、テンプレートの cDNA の異なる濃度の使用前に、イントロンにまたがるプライマーをテストします。標準曲線を作成することによってプライマーの有効性を分析し、高効率と正しい融解曲線のプライマーを使用します。
    メモ: この実験で使用されるプライマーの配列は、表 2に表示されます。
  3. 表 4に示された反応セットアップで 384 ウェル プレートでの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 反応を準備します。
  4. すべてのソリューションを保ち、反応混合物は準備ができたときに濡れるプレートを防ぐためにアルミ箔を使って氷の上プレート。
  5. トリプリケートのすべての反応を実行します。
  6. 表 5に記載されている設定を使用してたちに PCR 反応を行います。
  7. トリプリケートからすべての反応の平均 Ct 値を計算します。Glycerinealdehyde-3-リン酸脱水素酵素の発現レベルにすべてのターゲット遺伝子を正規化 (Gapdh) 2^(-ΔCt) を計算することによって家計の遺伝子。
    注: すべてのターゲット遺伝子平均 ct > 35 が検出限界の下にあると考えられていた。

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結果

ホストの腸粘膜バリアー違反の後に発生する細菌または細菌由来製品の入学後結果を模倣、組合は致死用量 (2 μ g/g 体重) の c57bl/6 マウスに注入されました。すべての単一のマウスだった監視し、エンドトキシン血症の発生、マウスの外観、動物、目の条件と呼吸速度と品質 (表 1) の活動を含むスコア シートに記載されているパラメーターを持つ得点.動物は、LPS 投与後 6 に 10 h をピークし、24 h (図 1) 以内に回復の病気の臨床徴候を示しました。個々 のマウスは、lps 投与後犠牲に 2 h、4 h、8 h をしました。組織の部分は、脾臓、肝臓、結腸から収集されました。RNA はこれらの器官から分離し、逆 cDNA に転写されます。CDNA は、qPCR 用プライマーでIl6 (図 2 a) Il1b (図 2 b

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ディスカッション

このプロトコルは、微生物由来製品による侵入の後で発生する免疫学的プロセスを模倣します。プロトコルの中で重要なステップは、マウスの線、マウスの衛生状態、エンドトキシン血症の発生し、実験終了の時点の動物の監視, lps 投与量の選択です。最も重要なは、マウス系統の遺伝的背景が考慮されます。異なるマウス系統 LPS に対する感受性があります。たとえば、C3h/hej および C57BL/10ScCr マウスの LPS に耐性のエンドトキシン血症21,25を誘発しました。さらに、動物の衛生状態 LPS エンドトキシン血症の進行に影響があります。特定の病原体フリー (SPF) 動物は最もよく使用されます。これらのマウスは、病原体の定義済みリストから無料ですがこれらの動物の完全な細菌叢の組成は26,27を知られていません。(つまり、細菌叢を抱いていない) 無菌無菌または無菌動物が SPF マウス

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAK1081
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,AppliedBiosystems, Foster City, CA, USA4368813
RNase-Free DNase Set,Qiagen, Hilden, Germany79254
LPS Escherichia coli O111:B4Invivogen, San Diego, CA, USA.tlrl-eblps
Omnican 50 Single-use insulin syringeB. Braun Melsungen, Melsungen, Germany9151125
Bioanalyzer 2100Agilent Technologie, Santa Clara, USA該当
Centrifuge 5430Eppendorf, Hamburg, Germany該当なし
Centrifuge Mikro 220RHettich, Kirchlengern, Germany該当なし
解剖ツールAesculap, Tuttlingen, Germany該当なし
Fast-Prep-24 5G Sample Preparation SystemM.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA該当
NanoDrop ND-1000NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA該当なし
TRI ReagentZymo Research, Irvine, CA, USAR2050-1
なしなし

参考文献

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訂正


Formal Correction: Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach
Posted by JoVE Editors on 8/04/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

One of the authors' names was corrected from:

Katarina Raduolovic

to:

Katarina Radulovic

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