方法論記事

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

DOI：

10.3791/57615

⸱

2018年7月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 2Systems Biology Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University, 3Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

この記事について

サマリー

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顕微鏡の有機体のゲノムのシーケンス処理中に汚染大きい問題に残る。ここでは、汚染のリスクを最小限に抑えるため全ゲノム増幅 DNA のわずか 50 pg を単一の標本からクマムシのゲノムをシーケンス処理する方法を示します。

要約

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クマムシは、乾燥とすることができますに直面するときと呼ばれる乾燥耐性を元の状態に返すときに水が供給されて ametabolic 状態顕微鏡動物です。時々 これらの動物の遺伝子の水平伝達の範囲についてたとえば、誤った解釈につながるクマムシ リスク細菌汚染など顕微鏡動物のゲノム配列を決定。ここでは、我々 は単一の標本からHypsibius dujardiniクマムシのゲノムを配列する超低入力メソッドを提供します。50 の効率的な抽出と厳密な洗浄および汚染物質の除外を用いて 〜 200 pg 単一の個人からのゲノム DNA、DNA シーケンシング装置でシーケンス化されたライブラリを構築しました。これらのライブラリは、高い再現性で、公平をされ他h. dujardiniのゲノム シーケンスされた読み取りのインフォマティクス解析は汚染の最小限の量を示した。このメソッドは、以前の方法を使用していないシーケンスが難のクマムシに適用できます。

概要

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クマムシは、乾燥に直面するとき、乾燥耐性と呼ばれる ametabolic 状態を入力することができます顕微鏡動物です。彼らは水1,2の吸収による回復します。Ametabolic 状態ではクマムシが極端な温度3高圧4、5ガンマ線、x 線、紫外線光6の高用量を含む様々 な極限環境に耐えることができます。7,8、および宇宙空間9。ゲノムデータは乾燥耐性の分子機構の研究のために不可欠な基礎です。

クマムシのゲノムをシーケンス処理する前の試みは、細菌汚染10、11,12,13,14の兆候を示しています。このような小さな生物からゲノム配列決定多数の動物を必要とし、細菌汚染になりやすいです。したがって、我々 は既に15汚染のリスクを最小限に抑えるため、クマムシの単一の標本から超低入力メソッドを使用してシーケンス プロトコルを確立されています。これらのデータを使用して、さらに実施した高品質の順序とH. dujardini16,17のゲノムの再構築。ここで述べるこの(図 1tardigrade 一個人からゲノム配列決定法)。このシーケンスの結果の検証は本稿の焦点を越えて、私たちの以前のレポート16で既に、徹底的に議論されています。

このメソッドは、2 つの部分で構成されています: 最低汚染可能と DNA のピクトグラム レベルの質の高い抽出単一クマムシの分離。海中でもは飢えたと抗生物質と同様に、水ですすぎ、任意の細菌汚染の除去を確実に 500 倍の倍率での顕微鏡で観察しました。以前の推定値と測定、クマムシの単一の個人にゲノム DNA の16、凍結融解のサイクルによってまたは手動の均質化によって、キチン質の外骨格を割れによって抽出される約 50 200 pg が含まれていることを示しています。この DNA は、図書館の建設に提出し、DNA シーケンシング装置でシーケンス処理します。追加情報分析は、以前の tardigrade シーケンス プロジェクトと比較して汚染の低レベルと同様、高品質のシーケンスを示しています。

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プロトコル

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1. 準備

  1. 90 mm プラスチック製培養皿で 10 mL、1% ペニシリン/ストレプトマイシン DW のとカクテルの溶媒として蒸留水 (DW) を使用して 2% の agarose のゲルを準備します。ゲルは 18 ° C で設定インキュベーターで 2 〜 3 週間に保存できます。
    注: は、低温は agarose のゲル、ゲルと、クマムシをトラップできる培養皿の壁の非常に小さいギャップの結果を縮小するための 10 の ° C の下のゲルの任意のストレージを避けてください。

2. 試料調製及び汚染物質の排除

  1. 単一のクマムシを収集、準備された寒天プレート上に配置、それを洗う - 任意の残りの粒子を除去する社殿と 3 x x 2。
  2. 腸から任意の余分な食品を削除する 24 h 18-22 ° C でクマムシを孵化させなさい。
  3. ペニシリン/ストレプトマイシンの抗生物質細菌汚染を削除し、浄化した動物 P10 ピペットを使用してきれいなスライド ガラス上に 2-6 h に飢えたクマムシを配置します。
  4. 500 倍の倍率での顕微鏡下でクマムシを観察し、残存細菌がないことを確認します。
    注: 顕微鏡の高倍率は望ましいが、光学顕微鏡はまたなく観察を適用するされることがあります。
  5. 最大液 5 μ L の P10 のピペットを使用して個々 の収集、低結合ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブに入れます、できるだけ余分な水分を削除します。
    注: マイクロ チューブ、PCR チューブ ・ ピペット チップ必要がありますすべて低結合する DNA の損失を最小限に。
    注: を行う急速な乾燥、できるだけ均質化または動物の死は、ゲノム DNA を損傷する可能性が大きく。

3. 均質化と DNA の抽出

  1. 次の方法のいずれかでそのゲノム DNA (gDNA) を取得する動物を均質化します。
    注: (列と基づくビーズ) 他のキットはこの非常に低い入力で効果がないため DNA 抽出手順の材料表に示されている指定されたキットを使用するが重要です。ゲノムの換散バッファーを使用する β-メルカプトエタノール前に 0.5% と指定しました。
    1. 凍結融解サイクル18動物をホモジナイズしてください。
      1. 手順 2.5 の直後、クマムシを含む PCR チューブに換散バッファーの 100 μ L を追加します。
      2. 37 ° C に加温熱ブロックに移動 10 分、10 分と、液体窒素で PCR チューブを配置2 x この手順を繰り返します。
        注: 均質化は不十分であるまたは手動粉砕後に実行できる場合は、この手順を繰り返すことができます。
    2. 手動で動物をつぶします。
      1. 直後、顕微鏡下のステップ 2.5、PCR の管の壁に動物を押すことによってピペットの P10 の先端を持つ個人を粉砕し、すぐに換散バッファーの 100 μ L を追加します。
        注: 海中でもすることができます簡単にスリップし、非効率的な破砕 gDNA を抽出に失敗になりますので、顕微鏡の下でこのプロシージャを観察するが重要です。換散バッファー有機体に侵入することができますので、tardigrade のキューティクルが壊れていることを確認します。
  2. 管に発生する換散のため室温で 30 分間インキュベートします。
    注: 最低 30 分、効率的な換散のため必要ですが、孵化は長くすることができます。
  3. きれいな 1.5 mL 低結合マイクロ チューブに溶解混合物の全集 (100 μ L) を転送します。
  4. 均質化のために使用された、空、今低結合 PCR チューブに換散バッファーの 100 μ l 添加し混合物を分注後、ステップ 3.3 で使用される 1.5 mL 低結合マイクロ チューブに転送。2 x この手順を繰り返します。
  5. ステップ 3.4 のように低結合 PCR チューブに換散バッファーの 300 μ L を追加し、ピペッティングした後低バインディングの 1.5 mL マイクロ チューブに混合物を移動します。1.5 mL 低結合マイクロ チューブは、このステップの後 600 μ L の混合物を含める必要があります。
    注: この手順は、サンプルを複数回洗浄することにより PCR チューブ壁にバインドされた gDNA の損失を最小限に抑えることです。
  6. コレクションの管に置かスピン列に溶解混合物の 600 μ L の合計を追加し、1 分 10,000 × g で遠心分離します。
  7. 1 分の 10,000 × g で遠心し、列に流れを再適用されます。
    注: この手順は確実に重要な gDNA のほとんどが列にバインドされています。
  8. スピン列に洗浄バッファーの 500 μ l 添加しきれいな 1.5 mL のマイクロ チューブにスピン列 1 分転送 10,000 x g で遠心分離機します。
  9. 10 mM トリス-HCl、pH 8.5、スピンの列、5 分待って、室温での 20 μ L を適用し、1 分の 10,000 × g で遠心分離機します。
    注: ライブラリの準備酵素と干渉するため、溶出バッファーは、EDTA を含んでいないする必要があります。
  10. スピンの列と常温静置後の 5 分後のフローに再適用、10,000 × g で 1 分間遠心します。
    注: この手順は、列にバインドされた gDNA の最大溶出するために重要です。

4. 図書館建設シーケンス

  1. DNA の断片化
    1. DNA 断片化の 15 μ L マイクロ チューブに gDNA 溶離液の 15 μ L を転送し、1 分卓上遠心機を使用して管を遠心分離します。
      注: 指定したマイクロ チューブ材料の表に示すように低入力に最適です。低ボリューム超音波と断片化は危険で、これは DNA の非常に低濃度のため酵素断片化で置換することはできません。
    2. 550 gDNA をフラグメント bp。
      注: を用いて 550 bp 設定は次のとおり: 入射ピークパワー 30 W、デューティー比を = = 20%、バーストあたりのサイクル数 = 50、治療時間 = 23 s。
    3. 徹底的なピペッティングした後クリーン低結合 PCR チューブに断片化された DNA の混合物の 10 μ L を転送します。
      注: 実験をここで停止することができます。4 ° C または-20 ° C で DNA を保持します。
  2. 図書館建設のシーケンス
    注: 入力 DNA の低い量のため、次の手順でテーブルの材料で指定されたキットを使用するが絶対に重要です。
    1. テンプレートの準備バッファーの 2 μ L とテンプレート準備酵素の 1 μ L を加えて徹底的にピペットでそれらをミックスします。
    2. 以下の条件でサーマルサイクラーにテンプレート準備反応を実行: 25 分、20 分、4 ° C ホールド 101-105 ° C で加熱蓋に 55 ° C の 22 ° C反応が完了するは、次の手順に進みます。
    3. テンプレート作製の反応生成物にライブラリ合成バッファーの 1 μ L とライブラリ合成酵素の 1 μ L を追加し、(4 ° C ホールド) と 40 分の 22 ° C で混合物を孵化させなさい。反応が完了するは、次の手順に進みます。
    4. ライブラリ増幅マスター ミックス (ライブラリ増幅バッファーの 25 μ L、ライブラリ増幅酵素の 1 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 4 μ L) の 30 μ L とインデックスの試薬の 5 μ L を追加します。
    5. ピペットを徹底的にミックスのすべてと卓上遠心分離機で簡単に混合物を遠心分離機します。
    6. 表 1に示した条件で PCR を行います。
温度時間サイクル
72 ° C3 分
85 ° C2 分
98 ° C2 分
98 ° C20 秒4 サイクル
67 ° C20 秒
72 ° C40 秒
98 ° C20 秒16 サイクル
72 ° C50 秒
4 ° Cホールド

表 1: PCR の条件。

  1. PCR の製品の浄化
    注: この手順は、他の浄化方法と代替可能します。分光光度計を使用して生成される DNA の純度を確認する別の方法を使用する場合を確認します。260/280 と 260 の吸光度比/230 1.8 上両方する必要があります。
    1. 磁気ビーズを 50 μ l 添加、ピペットのソリューションは、10 x、簡単に卓上遠心機で遠心力場それ。
    2. 常温で 2 分のためのソリューションを孵化させなさい。
    3. 5 分、マグネット スタンドにそれを孵化させなさいまたはソリューションが完全になるまでをオフにし、上清を除去します。
    4. マグネット スタンドに低結合 PCR チューブに作りたての 80% エタノール 200 μ L を追加、30 s と削除上清を待ちます。2 x この手順を繰り返します。ビーズが不可でした。
    5. 簡単に卓上遠心と低結合 PCR チューブを遠心し、マグネット スタンドに任意の余分なエタノールを削除します。ビーズを風乾、オーバードライを避けてください。
    6. 10 mm トリス-HCl、pH 8.5 15 μ L でビーズを再懸濁します徹底的に磁気ビーズが均一に分散されるようにソリューションをピペット、簡単なの遠心分離後、室温で 2 分の管を孵化させなさい、2、マグネット スタンドにインキュベートソリューションがクリアされるまでの分。
      注: シーケンスの化学と干渉するため、溶出バッファーは、EDTA を含んでいない必要があります。
    7. 新しい低結合 PCR チューブ、ペレットを乱すことがなく、培養上清を転送します。
      注: 実験をここで停止することができます。4 ° c または-20 ° C、長期に渡る保存 DNA を保持します。

5. 品質チェック、定量化、および DNA のシーケンス

注: 品質チェックは DNA の低い量のためにこの工程の前に行わない。

  1. DNA ライブラリのサイズ分布の検証
    注: サイズ分布のデジタル レポートと他の高感度電気泳動システムを使用できます。
    1. 電気泳動バッファー試薬を戻り、ゲルのカートリッジ (25 1,000 bp の範囲で) 部屋の温度にします。
    2. 配列ライブラリの 1 μ L を電気泳動バッファー試薬の 3 μ L を追加し、渦と 1 分の徹底的にそれらをミックスし、簡単に卓上遠心分離機、遠心分離機のそれら。
    3. 電気泳動を行い、関連ソフトウェアのライブラリ サイズ分布を検証します。主なフラグメント ピークは、1,000 に約 300 から広く及ぶべき bp。
  2. DNA の定量化
    他の蛍光ベースのメソッドまたは量的な PCR 注: を使用することができますが、それはシーケンス ライブラリを定量化するために十分に正確ではないと、吸光光度法を避けてください。
    1. ソリューション バッファーの 796 μ L と蛍光試薬の 4 μ L を追加し、徹底的にそれらをミックスします。2 つの測定管に取り組んで解決策の 190 μ L と 1 つの試験管に 197 μ L を調剤します。
    2. 作業ソリューションの 190 μ L を含む各試験管に DNA 既知濃度基準の 10 μ L と準備作業ソリューションの 197 μ L を含むアッセイ チューブ ライブラリの 3 μ L を追加します。
    3. 渦管を簡単に卓上遠心分離の遠心分離機のそれらと。3 μ の設定で、蛍光光度計を用いた DNA を定量化します。
  3. Dna ライブラリ
    注: シーケンス処理プラットフォームは、指定されたライブラリ構築キットと互換性があります。
    1. 製造元のプロトコルに基づいて配列ライブラリを準備します。
    2. シーケンス楽器に試薬カセットとフロー セルを設定し、次の製造元のプロトコル情報を実行シーケンスを入力します。
    3. シーケンスを実行します。
      注: 2 つのシーケンスの実行を行った: 4 つのサンプルを 1 つの実行の多重化と同様、1 つのサンプル/実行します。

6. 計算解析

  1. ベース呼び出しと、必要な場合は、読み取りをデマルチプレックスします。
  2. FastQC19シーケンス データの品質を検証します。
    注: 得られたデータのより詳細な検証、当社の以前のレポート16を参照してください。

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結果

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汚染物質の除外:

このプロトコルには、海中でも、汚染を最小限に抑えるために抗生物質治療と殺菌の徹底した洗浄が含まれます。また、これらのプロセスの完全性を確保するため、視覚的なチェック プロセスが含まれます。検証 (ステップ 2.4 プロトコルの) 中に作られた顕微鏡イメージは図 2に示します。500 倍の倍率で観察するとは、個々 のクマムシを動かす小さな粒子として細菌細胞を見ることができます。

DNA ライブラリの品質の検証:

構築された Seq DNA ライブラリの総量は約 109.5...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細菌汚染は、微生物のゲノム配列決定に脅威を与えます。Tardigrade ゲノムに関する先行研究を広範な情報学研究の方法12,20を使用して汚染をフィルター処理、一方我々 は汚染のリスクを最小限に抑えるために単一の個人からゲノムをシーケンスです。個々 緩歩動物ゲノム DNA16の約 50-200 pg が含まれているキチン質の外骨格の厚い層で包み込まれているので、汚染物質や高品質の DNA の抽出の排除、このプロトコルでは重要なポイントです。既存のクマムシ文化は、無菌ではありません、それらは、多くの汚染物質の表面だけでなく、自分の腸内に食物残渣野生のキャリーから収集します。以前クマムシのゲノム プロジェクトは、1 つサンプル12,14結果、細菌汚染による影響を受ける可能性が高いことを意味としてまとめて 10,000-100,000 人をシーケンスしました。彼...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者はゲノム配列決定でテクニカル サポートのため希阿部、希高井菜穂子石井をありがちましょう。この作業によって支えられた費日本社会のための科学振興会研究員、科研費科研費若手 (No.22681029)、科研費科研費研究 (B)、第 17 H 03620、日本学術振興会からので、基本的な科学研究プロジェクト、住友財団 (No.140340) から、山形県・鶴岡市から研究資金によって部分的に助成。クロレラクマムシをフィードするために使用されたベルフォートは、クロレラ工業 (株)

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SZ61 顕微鏡OLYMPUS
BactoAgarDifco Laboratories214010
ペニシリン ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Gibco by life technologies15140-148
VHX-5000 SystemKeyence
0.2mL シリコーンコーティングチューブBio Medical ScienceBC-bmb20200
Quick-DNAMicroprep KitZYMO ResearchD3021このキットの使用は絶対的に重要です。ステップ 3.1
1.5 mL マイクロチューブグライナー バイオワン616-201参照 4.1.1
高速冷蔵マイクロ遠心分離機タカラトミーMX-307
コバリス M220コバリス Inc.
ThruPLEX DNA-Seq kitRubicon GenomicsCAT. NO. R400406このキットの使用は絶対的に重要です。ステップ 4.2
Thermal CyclerBioer TechnologyTC-96GHbC
AMPure XP reagentBECKMAN COULTER Life ScienceA63881
EthanolWako054-027335
EB bufferQIAGEN19086
2200 TapeStationAgilentG2965AA 
D1000 試薬Agilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
Qubit dsDNA BR バッファー/試薬ThermoFisher ScientificQ32850
Cubee Mini-CentrifugeRecenttecGenereachR5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3Illumina Inc.MS-102-3003
MiSeq シーケンサーイルミナ株式会社SY-410-1003
4482277

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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