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方法論記事

マウスの遠位人工肛門、転用 c57bl/6 マウス大腸炎の新たなモデル

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DOI:

10.3791/57616

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2018年7月12日

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1Department of General Surgery, Visceral, Thoracic and Vascular Surgery, Universitätsmedizin Greifswald, 2Institute of Pathology, Universitätsmedizin Greifswald

この記事について

サマリー

マウスの遠位人工肛門は、人間転換大腸炎、糞便のストリームから除外コロン セグメントで主にリンパ球性大腸炎のマウスモデルを提供します。

要約

転用性大腸炎 (DC) は、転用の生存の結果として糞便のストリームから除外腸セグメントを持つ患者で発生する頻繁に臨床状態です。この病気の病因は不明確なままですが、古典的な炎症性腸疾患クローン病と潰瘍性大腸炎などの違いが表示されます。この病気の開発につながる病態生理学的メカニズムを解読する研究は、深刻な適切なマウスモデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは、免疫システムの役割と DC の開発でマイクロバイとの相互作用の研究を容易にする DC のマウスモデルを生成します。このモデルは c57bl/6 動物を使用して、コロンの遠位部分は遠位人工肛門を作成する、除外された腸のセグメントで炎症を軽度から中等度の開発をトリガーし、人間の特徴病変を再現によって、糞便のストリームから除外します。中程度の全身性炎症反応と DC。ラット モデルと対照をなして C57BL/6 の背景に遺伝子組換えマウス モデルの多数があります。これらの動物モデルの組み合わせにより、個々 のサイトカイン、ケモカイン、または (例えばインターロイキン (IL)-17; 生理活性分子の受容体の潜在的な役割スフィンゴシン-1-リン酸受容体 4 CXCR5 と CCR7、ケモカイン受容体、ケモカイン CXCL13 IL-10) DC の病因に評価されます。C57BL/6 背景にコンジェニック マウス系統の可用性は主として DC の病因に関与する細胞の種類の役割を確立する転送実験を促進します。最後に、モデルは粘膜免疫の影響を受けると以外-影響を受ける腸セグメントにローカル介入 (例えば、ローカル マイクロバイまたは局所抗炎症療法の変更) の影響を評価する機会を提供していますとの全身免疫恒常性。

概要

近年では、非感染性大腸炎エンティティから古典的な炎症性腸疾患 (IBDs; 別の相当な数i.e。、Crohn 病や大腸炎潰瘍性) ヒトの病理組織学的および臨床的に特徴づけられています。これらの大腸炎のフォームの開発につながる病態生理学的メカニズム理解されていません完全に部分的に適切な動物モデルが不足しているため。転用性大腸炎は、これらの最近記述されているエンティティの 1 つです。用語は、Glotzer1によって 1980 年に鋳造されたが類似した表現型の最初の説明は、Morson2によって 1972 年に与えられました。病気が 50% から流用、腸瘻患者の 91% の開発し、その臨床強度変化3,4。アメリカ合衆国で約 120,000 の人工肛門患者の年間発生率を考えると、この病気の実体は、重要な健康問題を構成します。

このプロトコルの開発の全体的な目標は、人間 DC に見られるような大腸炎トリガーに依存していると、人間の病気の主な病理組織学的特徴を再現したマウスモデル DC を提供することでした。我々 のモデルの大腸炎誘発は遺伝子組み換え動物 (例えばIL-7 トランスジェニック マウス、N-カドヘリン支配的否定的なマウス、または TGFβ-/-マウス)、他のマウス大腸炎モデルと対照をなして不要の応用化学刺激物質 (例えば、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) - 誘導大腸炎やトリニトロ スルホン酸 (TNBS) - 誘発大腸炎)、または (CD45RB の高速転送のように免疫欠損マウスにおける特定のセル人口の転送大腸炎モデル) (レビュー、5を参照してください)。他のモデルとは対照的 DC モデルのままの免疫システムにより免疫機構の評価、DC 開発に携わる。除外された腸重積に粘膜の炎症の制限により腸管の他の免疫の区画内免疫恒常性に、消化管の他の部分の粘膜免疫にその反響の (など、パイエル板のパッチと mesenteriale リンパ節) と全体の生物の免疫恒常性。最後に、我々 のモデルは、消化の抗原と同様、両方のローカル マイクロバイ通常ローカル環境の変化から発生した局所の炎症性刺激を制御するメカニズムを調査するために適切なツールを構成します。

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プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、獣医当局 (Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Fischerei メクレンブルク = フォアポンメルン州、Landwirtschaft (LALLF M-V)) によって承認されています。

1. 術前のケア、動物の準備

  1. 動物施設の到着, 動物 (C57Bl/6) を同じようなサイズのグループに分割、各グループを一緒に、ケージ、グループを実験を通じて一定に保ちます。
    注: は、同じ性別の動物を使用します。結果は、雄マウスが得られました。
    注: オスの動物を使用する階層を確立できるように、彼らは 7 週齢時に一緒に開始ケージ グループ場合を最小限に抑える積極的な行動のリスク実験中。
  2. 術前に少なくとも 1 週間は高エネルギーに切り替える (> 14 MJ/kg) と高蛋白質 (> 20%) すべての必須微量元素とビタミンを含むフィード (詳細については、資料の一覧を参照してください)。
    注: 手術が実行されるすべてのマウスの重量を量る、少なくとも 25 g を保証します。
  3. 87 mg/kg (i. p.) ケタミンおよび塩酸キシラジン 13 mg/kg (i. p.) の腹腔内投与による麻酔と鎮痛を誘発します。マウスは、機械的刺激、例えばつま先ピッチ、モーターの応答なしを許容するまで待機します。
  4. 安定操作中の位置と体の熱の圧倒的な損失を回避する保証操作デスクに配置熱アンダーレイの仰臥位でテープで麻酔マウスを保護します。
    メモ: 熱アンダーレイが必要表面温度は 36 の ° C ~ 40 ° C;手術室の温度は 21 ° c. にする必要があります。

2. 遠位結腸の操作

  1. 腹部の毛を剃る。手術を開始する前に、iodophor 3 回 70% アルコールを使用して術野を消毒します。無菌を保証する [操作] フィールドにドレープします。
  2. 腹部の筋肉と白線に沿って腹膜を切開によって 15 mm 正中開腹を行うアルバ、血液の損失を最小限に抑える。
  3. 2 つの DeBakey 非外科的鉗子を使用、盲腸、回腸末端と昇順と横行結腸を腹膜腔から慎重に引き出します。
    注: 腸間膜構造への損傷を防ぐために腸の機械操作を厳密に制限するように気をつけてください。
  4. 盲腸のポール、上行結腸、小腸 (図 1 a と 1 b) を特定します。
    注: 上行結腸の正しい認識は、人工肛門の正しい配置のための基礎です。回盲部の解剖学があいまいな場合、パイエル板の存在が、小腸を識別し、形成された便の存在を特徴付けるコロン。
  5. 将来の人工肛門の位置を決定するのにには、定規を使用します。する必要があります配置する 20 mm 遠位結腸の回盲弁の遠位。
  6. 右上の象限に腹部壁で 2 番目 3 mm 切開を行います。この切開ループを歪曲しないように注意して、ループを形成する以前に識別されたコロン セグメントを引き出します。
  7. 結腸間膜 22 ゲージ フレキシブル静脈カニューレを慎重に渡します。腸間膜の血管の構造を損傷しないように注意してください。
  8. 腸を腹腔内に戻ります。
  9. シンプルなステッチと (例えば、polyglactin 910 または polyfil 4 0 1/2 c) 吸収性縫合糸を使用して肌にフレキシブル チューブの両端を修正します。
  10. 術中を閉じる前に 0.5 mL 0.9% 生理食塩水の腹腔内注入による輸液蘇生を実行します。
  11. (例えば、 polyglactin 910 または polyfil 4 0 1/2 c) 吸収性縫合糸を用いた連続縫合と腹膜、筋層を閉じます。(例えば、polyglactin 910 または polyfil 4 0 1/2 c) 吸収性縫合糸を用いた連続縫合と皮膚を閉じます。
  12. 高級シザーを使用して小計離断を実行して外在化した大腸ループを開きます。腸間膜をすべて避けてください。完全にコロンをトランセクトないです。
  13. 腹膜に 3 つのシングル全層ステッチを使用して各人工肛門開口部を修正し、monofil、吸収性縫合糸を使用して皮膚 (例えば、polydioxanone または monofil 6 0 3/8 s)。機能的なエンド-人工肛門は、求心性のループと粘液瘻は、遠心性のループはこの時点で (図 1 c) 明確に分離します。
    注: 流体と熱損失を制限する 20 分未満は、手術時間がする必要があります。
  14. 後外科を仕上げ消毒機器メーカーの指示に従って超音波風呂でアルデヒド無料で消毒液を使用しています。

3. 偽操作 (Colotomy)

  1. 1.1 の手順に従います。through 2.4。
  2. 将来の colotomy の位置を決定するのにには、定規を使用します。Colotomy には、実験群で人工肛門と回盲弁から同じ距離を位置づける必要があります。
  3. コロンを開く少なくとも 2/3 高級はさみを使用して円周。
  4. すぐ単独のレイヤーと colotomy、全層中断 monofil 吸収性縫合糸で縫合 (例えばpolydioxanone、monofil 6 0 3/8 s)。
    注: 操作時間は実験外科医、流体、熱損失を制限するために 20 分未満をする必要があります。
  5. 2.10 の手順に従います。、2.11。2.14。

4. 術後のケア

  1. 動物を檻に戻ります。37 ° c (例えば、赤外線ランプで) よく調律された雰囲気を提供してマウスが完全に目を覚ましまで。その後、(21 ° C; 30% ± 10% 相対湿度)、温度と湿度調整の環境でマウスを維持します。食品や飲料水への無料アクセスを許可します。流体吸収しやすく、水に浸した動物飼料を提供します。
  2. 0.1 mg/kg 本体重量ブプレノルフィンを注入することにより術後鎮痛を開始サウスカロライナ動物は機械的刺激に対する応答を表示するとき。呼吸抑制を回避するように注意します。
  3. 最初の術後 1 週間の間に継続的な鎮痛の mg/ml 1 つトラマドールと飲料水を補足します。
  4. ために水分摂取量減少を補うためにモビリティを縮小した、最初の術後 1 週間の間に檻の中の固体を飲むパッドを供給します。
  5. 最初の週、最初の月の残りの部分の間に 1 日おき、クラインオートらに記載されている疾患重症度スコアを使用して 2 番目の月の間に 3 日おきに毎日動物と動物行動のスコアを比較検討します。6。

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結果

手術は忍容実験 (人工肛門) と偽 (colotomy) グループの両方。手術および周術期管理が正しく実行されると、周術期死亡率は 10% を超えてはなりません。最初の術後 1 週間実験と偽の両方のグループで有意な体重減少が見られます。偽のグループの動物達成術後四日の方の通常の重量のどん底が実験群で後 1 日が発生します。体重減少は初期体重の 21.7% に達し, 実験群でより顕著で。対照的に、偽動物は彼らの初期のボディ重量 (図 2)6の 10.8% を失います。体重は最初の術後 1 週間の体重のどん底後は、両方の実験グループですが実験群で遅い斜面、絶えず します。徴候と (すなわち、血性分泌または実験も偽グループ6に発生する液体腸の動き) 重篤な腸炎の症状です。最初の 60 日間の総死亡率術後です約 40% 人工肛門グループと colotomy グループの約 10%ほとんどの死は (実験群で 61...

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ディスカッション

確実にこのプロトコルで発表した DC のマウスモデルを再現 (例えば、炎症を起こして腸セグメント、ショートニング、クリプト、削減の粘膜下組織にリンパ濾胞のde novo開発人間の DC の病理組織学的特徴炎のゴブレット細胞数)。この利点は別として、このモデルは非常に類似したトリガー因子によって誘導される、という場合に最も影響を受ける人間の中等度軽度からの臨床経過を提示します。

再現性のある結果と許容周術期致死性を得るためには、顕微鏡技術でいくつかの練習が必要です。ただし、人工肛門と偽の両方の操作 (colotomy) は非常に低周術期死亡率と実行できます (< 10%)。いくつかの操作は、非常に重要な: 1) コロンそしてターミナル回腸を識別します。回盲部の解剖学が不明の場合は、コロンで形成された便の存在感と回腸パイエル板の存在によって識別できます。2) 人工肛門ループを exteriorizing するときは、腸間膜はゆがんでない機械的腸閉塞と腸間膜虚血を回避を保証します。3) フレキシブル チューブで腸間膜の穴をあけるときは、容器無料部門を選...

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開示事項

すべての著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
操作材料
熱下敷き、6ワットThermoLux、Witte + Sutor GmbH461265
エタノール70%(メチルエチルケトン付き)グライフスヴァルト
アプリケーター、片面小さな綿の頭、木製の棒、長さ150 mmCentramedGmbH、ドイツ8308370手術現場の消毒
用 はさみAesculap(BRAUN)BC064R
非外傷性DeBakey鉗子Aesculap(BRAUN)OC021R
ニードルホルダーAesculap(BRAUN)BM012R
Vasofix Safety i.v.カニューレ22GBraun Melsungen AG、ドイツ4268091S-01
VICRYL Plus 4-0バイオレット編組;V-5 17 m 1/2c;70 cmエチコン株式会社
PDS II 6-0モノフィル;V-18 13 mm 3/8c;70 cmエチコン株式会社Z991H
BD Plastipak 1 mL (滅菌内部針付きシリンジ)BD Medical305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin)ANTISEPTICA, Germany18824-01超音波浴
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ケタミン塩酸塩)Selectavet, Dr.Otto Fischer GmbH9089.01.0087 mg/kg i.p.
キシラセル、20 mg/mL (塩酸キシラジン)selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH400300.00.0013 mg/kg i.p.
>NaCl 0.9%Braun Melsungen AG, Germany6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine)Bayer, GermanyPZN: 014988700.1 mg/kg s.c.
トラマルドロップ、100 mg / mL(塩酸トラマドール)Grünenthal GmbH、ドイツ101168381 mg/mL 飲料水
Ceftriaxon-saar 2 g (セフトリアキソン) Cephasaar GmbH, GermanyPZN: 0884425225 mg/kg 体重 i.p.
metronidazole 5 mg/mLBraun Melsungen AG, GermanyPZN: 0554351512.5 mg/kg 体重 i.p.
>Food
ssniff M-Z Ereichssniff, Germany V1184-3
固形飲料Dehyprev Vit BIO、ポーチTripleATrading、オランダSDSHPV-75
機器
Nikon Eclipse Ci-LNikon Instruments Europe BV、ドイツ光学顕微鏡
VetScan HM 5 Abaxis、米国770-9000医血液学分析装置50 µl 静脈EDTA-血
バンデリン SONOREX (超音波浴)バンデリンエレクトロニクス、ドイツRK 100 H手術器具の消毒
Software
NIS-Element BR4 softwareNikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6GraphPad Software, Inc.
大学病院の薬局木製VCP994H獣

参考文献

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. , Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
  4. Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
  5. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  6. Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13(2017).
  7. Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
  8. Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
  9. Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
  10. Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
  11. Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
  12. Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
  13. Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
  14. Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
  15. Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
  16. Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
  17. Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
  18. Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
  19. Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
  20. Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
  21. Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
  22. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
  23. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).

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