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方法論記事

人間から退化的な Tenocyte を取得するためのプロトコル

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DOI：

10.3791/57634

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2018年6月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine, 2Department of Pathology, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Kyung Hee University School of Medicine, 3Department of Physiology, CHA University School of Medicine, 4Department of Rehabilitation, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

In vitro変性線の使用は、障害への新しい治療の有効性を調査するときに不可欠です。ただし、ほとんどの研究は動物モデルのみまたは健全な tenocyte を使用します。手術中に人間の退化的な線を分離する次のプロトコルを提案します。

要約

寛解、腱の変性に対応して開発して痛みの状態は身体活動と寿命向上のための開発された世界の上昇にあります。その普及にもかかわらず根本的な病因はまだはっきりしていないし、治療は一般に徴候を示す。最近では、成長因子、幹細胞、遺伝子治療など多くの治療オプションを変性腱の治癒力を高めることを期待して調べた。ただし、これらの調査の大半は動物モデルまたは健康な人間の線だけで行った。にもかかわらず、いくつかの研究は、病理の線を使用して、我々 の知識の限りで無い現在人間の退化的な線の入手方法を記述するプロトコル。本研究の目的は、人間の退化的な線を取得するための標準プロトコルを説明します。当初は、腱組織は、手術中に外側上顆炎患者から収穫されました。その後、生検採取した伸尺橈側手根ブレビス腱手術時の構造変化に対応するから。鈍い、灰色、砕けやすい、すべて収穫した腱の登場し、浮腫状になった健康なものから視覚的に異なる。線は、培養され、実験用します。一方、収穫された組織の半分は組織学的に分析した、寛解 (angiofibroblastic 異形成または過形成) の同じ特徴を共有彼らことが示されました。免疫細胞化学による二次分析確認モホークと tenomodulin の蛋白質のための肯定的な汚れを持つ細胞の大半と線を培養細胞にしました。線の退化的な天性の資質は、拡散の試金または qRT PCR を使用して健康な制御と細胞を比較することによって定量しました。退行性の tenocyte には、高い増殖率と過去のレポートを一致する寛解の類似の遺伝子発現パターンが表示されます。全体的にみて、この新しいプロトコルは、寛解の将来の研究のための便利なツールあります。

概要

寛解は、体のさまざまな部分で成長する慢性退行性筋骨格の条件です。最近では、寛解の症例数は、レクリエーション スポーツ、高められた平均余命1,2への参加の増加開発の世界で大きく増加しました。寛解の原因は多因子になると考え、これらの原因は、虚血、酸素フリーラジカル傷害、神経-規制3 への変更、内部マイクロの涙は、血管収縮と血管拡張神経支配間の不均衡 ,4,5,6,7,8。寛解のほとんどの治療は、その症状だけを和らげます。また、組織再生せず治療はリハビリテーションに必要な長い時間、医師9の臨床的課題を課す負傷した腱からの限られた応答を達成するため。

変性腱の治癒能力が欠如している現在の治療法の選択肢の無能さには代替治療戦略を探るに関心の鉛の研究者。最近、新しい研究は成長因子を用いた寛解腱の治癒的効果を高めるため多くの有望な結果を報告、幹細胞ベースの治療と遺伝子療法10、11,12。

文献レビューを通じて関与する研究材料の解析に基づく 2 つのカテゴリ分けることができることがわかった: 動物はラット、マウス、ウサギ; などモデル人体モデル。に関して動物モデル、現在は寛解を生成する 2 つの人気のある技術: 傷害または機械的にオーバー ロード モデルの化学的誘導。ただし、各動物モデルは、複雑な人間の寛解病理13,14の再現に限られていた。

ひと試料を使用してほとんどの論文の組織学的検討を行ったまたは体外実験による変性 tenocyte15,16,17,18ではなく健全な人間 tenocyte,19,20,21. 論文が少ない報告彼らが人間退化的な tenocyte を使用が、彼らは詳しく書いてありません人間22,23から変性 tenocyte を取得するためのプロトコル。この文脈では、それに注意してください人間の有効性や効果的な投与のため複雑なプロセスであり、病因は腱の変性、動物モデルまたは健康な組織/tenocyte のいずれかの成功結果が必ずしも予測しません。まだ完全に理解しました。

総称して、ドナーへの副作用を引き起こすことがなく人間のティッシュから変性 tenocyte を取得するための標準プロトコルを記述するため必要です。この資料は、人間の退化的な tenocyte を取得する方法のプロトコルを説明します。プロトコルを検証するため、収穫された組織は組織学的に分析しました。その後、培養細胞は、免疫細胞化学 (ICC)、リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR)、および実行可能性の試金を使用して変性 tenocyte として確認されました。

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プロトコル

ヘルシンキ宣言に従ってプロトコルを行いプロトコルは CHA 盆唐医療センター制度検討委員会によって承認されました。

1 患者から変性腱組織の収穫

  1. 医療の歴史を物理的な検査所見を使用してによって外側上顆炎の診断: 外側上顆; 近くに腱の起源上の圧痛手首関節の抵抗の拡張により誘発される痛み。
  2. 次の基準を使用して: 18 歳以上の;6 ヵ月以上の外側上顆炎の歴史非手術治療の難少なくとも 3 カ月を過ぎたコルチコステロイド、多血小板血漿、またはボツリヌス毒素の注射
  3. 次の除外: 妊娠中の女性。頚椎疾患、肘関節炎、リウマチ性疾患、肘、周辺神経のわなに掛ける事の症候群; 手術の既往がある患者患者の組織に寄付することを拒否します。
  4. 手術手技
    注:図 124を参照してください。
    1. イソフルランと気管内挿管による全身麻酔後テーブルに腕を置いて、止血します。腕全体と無菌手術シートとドレープに betadine エージェントを適用します。
    2. 第 15 手術用メス刃だけ前外側上顆と関節のレベルに近位で 3-5 cm 切開外側肘を公開します。
    3. 視覚的に伸尺橈側手根筋 (実験) および伸筋腱膜インターフェイスを識別し、分割切開 2-3 mm は、識別されたインターフェイスで第 15 手術用メス刃を持つ ECRL と伸筋腱の間の深度。
    4. 以下病的伸尺橈側手根筋ブレビス (ECRB) 起源をもたらす視界に直接前方に, 実験を抽出します。
    5. その特徴的な鈍い灰色色によって病理学的変性組織と通常浮腫と砕けやすい組織を視覚的に識別します。
    6. 識別後、慎重に鋭く号 15 手術メスとミニ ブレードを使用してすべての変性組織を切除します。
    7. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) にすぐに (約 1 cm3) 切除組織を埋め込み、約 10 mL の PBS に慎重に腱組織を除くすべての周囲の組織をできるだけ早く削除します。
    8. 外側上顆の骨性外骨腫症症例、外骨腫、rongeur を使用してを削除して、やすりで滑らか。複数のドリル穴を作る (直径 1.6 mm、約 6-8 穴) 血管供給を強化する前外側顆で。これはオプションです。
    9. 層非吸収性縫合糸を使用して傷を閉じます。
  5. 健康管理 tenocyte
    1. 前十字靱帯再建時に自動ハムスト リングや自動膝蓋骨腱の残りの腱から健康線を入手して次の実験25のコントロールとして使用します。
      注: 本研究で使用されるサンプル数は各グループで 3 つでした。

2. 組織学

  1. 化学の発煙のフードまたはそれと同等の中性緩衝 10% ホルマリンで収穫された組織の約半分を格納します。
  2. 組織をパラフィン ブロック (4-5 mL) に埋め込むし、4-5 μ m のセクションでセクションの歯肉。
  3. コントロールとヘマトキシリンとエオシン染色 (H & E) と 2.5 の pH でアルシアン ブルー染色変性腱からのセクションを染色します。H & E 染色自動染色機次のように実行します。
    1. キシレンを使用して deparaffinize (3 回、5 分、それぞれ)。
    2. 水 (100% アルコール、4 分 100% アルコール、3 分 95% アルコール、2 分; 70% アルコール、1 分; 水、2 分) に傾斜アルコールからメタンハイド レートします。
    3. 5 分 2 分の水でよく洗浄をヘマトキシリンで染色します。
    4. 1% アルコールに酸を区別する (1% 70% アルコールで HCl) 3 s の 3 分を水でよく洗う。
    5. 10 0.5% アンモニア浸漬による塩酸を中和する s、3 分水洗浄が続きます。
    6. 5 分の Eosion で染色します。
    7. アルコールによる脱水 (80% アルコール、30 の 100% アルコール 1 分、100% アルコール; 95% アルコール、1 分 2 分)。
    8. キシレンのクリア (3 時間、2 分、2 分、3 分、それぞれ)。
    9. カバー スライドをマウントします。
  4. Immunohistochemitry (IHC) 製造元の指示に従って結合ポリマーを絞り込む検出キットを用いたマイナーな修正を実行します。
    1. Deparaffinization キシレンを使用して後に、、100 ° C で 30 分間結合エピトープ検索ソリューションを使用して抗原検索手順を実行します。結合エピトープ検索ソリューションでは、基づくクエン酸バッファーと界面活性剤 (1 L、pH 5.9-6.1) も含まれています。
    2. 5 分間、過酸化水素とティッシュの孵化によって内因性ペルオキシダーゼを癒します。
    3. 血管内皮増殖因子 (VEGF) (1: 200)、tenomodulin (レバレッジ) またはモホーク (レバレッジ) に対して一次抗体と周囲温度 (21-22 ° C) で 15 分のセクションを孵化させなさい。
    4. 二次抗体のビオチン フリー高分子西洋わさびペルオキシダーゼ リンカー抗体の共役システムとタグ付けを実行します。
      1. 使用二次ウサギ抗マウス抗体をローカライズするのには Tris バッファー saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one ソリューションで 10% (v/v) 動物の血清中 igg 抗体をマウスします。
      2. ポリ HRP IgG 高分子抗家兎を使用 (< 25 μ G/ml) ウサギ抗体をローカライズするのには Tris バッファー saline/0.09% で 10% (v/v) 動物血清を含みます。
      3. 3, 3'-ジアミノベンジジン tetrahydrochloride 水和物茶色の沈殿物によって複合体を可視化する安定剤のソリューションを使用します。
      4. 対比染色に < 0.1% ヘマトキシリン (ブルー) 細胞核を視覚化します。
  5. H で染色スライドを観察すると、E、アルシアン青い汚れと IHC VEGF、tenomodulin、モホーク族の人に光学顕微鏡の下で、各スライドを 1 つ強拡大 (400 倍) での代表的な顕微鏡画像を得る。

3. Tenocyte 文化

  1. ティッシュの準備
    1. マイクロ剪刀、鉗子で徹底的にすべての周囲の組織を削除することによって腱のサンプルを準備します。
    2. PBS で洗浄し、小さな断片 (1 mm3程度以下) にミンチします。
    3. 1 h で 30 mL ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 37 ° C で 30 mg/ml のコラゲナーゼ II 補完のための組織を消化します。
    4. 100 μ m の細胞ストレーナーを細胞を通過します。
    5. ウシ胎児血清 (FBS) の 1 つの mL を追加することによりコラゲナーゼ II を非アクティブ化します。
    6. 5 分の 196 × g で遠心分離機します。
  2. 細胞培養
    1. 100 mm ディッシュに 3 x 10 の5セルをシードし、1 週間 10 %fbs と 1% 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で抗生物質抗真菌薬ソリューション DMEM で文化します。
    2. 80% の合流が発生するまで 3 日培養培地を変更します。4 つの通路まで健常者と変性細胞サンプルを文化し、実験に使用します。

4. 各種 (ICC)

  1. チェンバー スライドの 8 つの井戸に培養細胞 (2 x 10 の5セル) の 200 μ L を転送し、1 日新鮮なメディアの追加で合流するセルを育てなさい。
  2. PBS のセルを洗浄し、500 μ L/ウェル 4% のホルムアルデヒドを修正します。
  3. 0.5% とスライドを孵化させなさい膜の透過性の 10 分のための PBS のトリトン X-100。
  4. 0.05% と 1% ウシ血清アルブミンを PBS でブロック モヒカンと tenomodulin、トゥイーン 20 それぞれ。
  5. マウス抗モホーク モノクローナル抗体 (1: 100 希釈) と 4 ° C でヤギ抗 tenomodulin 抗体 (1: 100 希釈) 暗闇の中で一晩インキュベートします。
  6. (Alexa 555 アンチ山羊 (レバレッジ) tenomodulin; のための二次抗体を孵化します。モホーク族の人のアレクサ 488 抗マウス (レバレッジ)) 室温で 1 時間暗闇の中で。
  7. 蛍光取付中の 0.5 μ L をマウントします。
  8. 蛍光顕微鏡 (400 倍) を使用して分析します。

5. 拡散の試金

  1. 水溶性テトラゾリウム (WST)-1 を使用してセル目を測定します。
    1. 120 h、72、24 ウェルあたり 2 × 103セルの密度で 96 ウェル プレートに健康や変性細胞を播きます。
    2. インキュベーション後、各ウェルに 10% WST 1 溶液 10 μ L を追加します。
    3. 5% CO2の 37 ° C で 3 時間版を孵化させなさい。
    4. 450 の光学密度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。各サンプルのすべての時点で、少なくとも 3 回の測定値を取る。
  2. メジャー細胞の DNA 量 BrdU アッセイを用いたします。
    1. 健全な種子し、96 に変性細胞も 120 h、72、24 ウェルあたり 2 x 10 の3セルの密度でプレートします。
    2. インキュベーション後、各ウェルに 10 %brdu 溶液 10 μ L を追加します。
    3. 5% CO2の 37 ° C で 3 時間版を孵化させなさい。
    4. 固定/変化させるソリューションの 100 μ L/ウェルを追加 (60-70% エタノール、0.1-0.5% 水酸化ナトリウム) し、30 分間室温でプレートを維持します。
    5. 100 μ L/ウェルに備える 1 h 検出抗体溶液し室温でプレート x 1 を追加します。
    6. ソリューションを削除し、洗浄バッファー × 1 で 3 回プレートを洗ってください。
    7. 100 μ L/ウェル準備 1 x HRP 標識二次抗体のソリューションを追加し、30 分間室温でプレートを維持します。
    8. 3 回洗浄バッファー x 1 とソリューションと洗浄のプレートを取り外します。
    9. 50 %tmb 基板の 100 μ L を追加します。
    10. 室温で 30 分間インキュベートします。
    11. 停止液を 100 μ L を追加します。
    12. 450 の光学密度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。
      注: 測定値を取る少なくとも 3 回すべての時にポイント各サンプルの。

6. 統計解析

  1. 収集し、SPSS を使用してデータを分析します。
  2. 平均の平均 ± 標準誤差でデータを表してください。
  3. 使用マン-ホイットニーの U テスト。
  4. P値が 0.05 より小さい場合に統計的に有意な違いを考慮 (p < 0.05)。

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結果

組織学的解析では、外側上顆炎から収穫された組織が tendinopathic 腱の特性を持っていたことを明らかにしました。寛解変性腱の H & E セクションは、極性とまっすぐ、強くパック平行繊維構造の損失と組織を破壊されたコラーゲンのバンドルを明らかにしました。高い細胞型など典型的な紡錘形のない肥大核変性の病理組織学的所見は、サンプルで共通だった。また、変性腱のコラーゲンの束が比較的弱いエオシン H & E 染色、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンの物質を増加を示すアルシアン ブルーで染色して積極的に。

すべてのケースで血管がみられたし、繊維の間に埋め込まれたスペースを占める骨材は通常スリット状血管と比較されました。IHC 染色変性腱の細胞制御のものの否定的な反応と比較して VEGF に細胞質の顆粒陽性反応を示した。総称して、これらの知見を確認外側上顆炎から収穫された組織が変性組織変性 tenocyte 文化に適した (

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ディスカッション

先行研究の数は、コラゲナーゼや kartogenin 注入、トレッドミルを実行して、多くの26,27など異なるプロシージャを使用して慢性 tendinopathic 動物モデルを作成する方法を報告しています。数多くの研究は、これらの動物のモデルに基づいて有望な治療効果を示しが人間退化的な tenocyte を用いた実験重要になる寛解の分野で治療の効果を再現するために。この資料では、正常に収穫し、一貫して人間の退化的な線を文化プロトコルを設立しました。両方収穫腱組織、培養 tenocyte 変性腱と tenocyte7,28の一般的な特徴を示した。

我々 の経験で成功した組織収穫のため不可欠だ変性腱の形態学的変化を理解し、正確に手術中にその領域を記述します。変性組織は通常灰色または茶色色および組織の薄い、壊れやすい、および緩いテクスチャーで解体。プロト...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は、技術研究開発プロジェクトを通じて、韓国保健産業開発研究所 (KHIDI)、韓国の福祉・厚生省によって資金を供給された韓国医療からの助成金によって支えられた (許可番号: HI16C1559)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
メスキサンビオKS-Q0306-15No. 15
ミニブレードビーバー374769
ダルベッコ改変イーグルス培地 (DMEM)Gibco11995065
PBSGibco14190250
牛胎児血清 (FBS)Gibco16000044
50 mM アスコルビン酸-2-リン酸Sigma-AldrichA5960
抗生物質-抗真菌剤溶液Gibco15240062
4% ホルムアルデヒドバイオ溶液BP031
Triton X-100 シグマ-アルドリッチX100-100ml
BSARdtechC0082
TWEEN 20シグマ-アルドリッチP9416-100ml
MKX (C-5)サンタクルスバイオテクノロジーsc-515878
テノモジュリン (N-14)サンタクルーズsc-49325
蛍光実装媒体DAKOS3023
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)Thermo Fisher ScientificD1306
WST-1 同人堂 Molecular TechnologiesCK04
BrdU Cell Proliferation Assay KitCell Signaling Technology#6813
TRIzol ReagentInvitrogen15596018
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad170-8891
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4369016
GAPDHサーモフィッシャーサイエンティフィックHs02786624_g1
COL3A1サーモフィッシャーサイエンティフィックHs00943809_m1
ACTA2サーモフィッシャーサイエンティフィックHs00426835_g1
TAC1サーモフィッシャーサイエンティフィック
TACR1サーモフィッシャーサイエンティフィHs00185530_m1
PTGS2サーモフィッシャーサイエンティフィックHs00153133_m1
ACTBサーモフィッシャーサイエンティフィックHs99999903_m1
セルストレーナー (100 & micro;m) コーニング352360
100mm 培養皿サーモフィッシャー サイエンティフィック8188207
8 ウェル チャンバー スライドサーモフィッシャー サイエンティフィック154534
96 ウェル クリア フラットボトム ポリスチレン TC 処理マイクロプレートコーニング3596
ニコン エクリプス 50i 顕微鏡 Nikon
VERSA max マイクロプレートリーダー Molecular Devices
CFX96 Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad
ホルマリン溶液 中性緩衝液 10%Sigma-AldrichHT501128
ParaffinsLeica Biosystems3801340
Ethanol純正化学90303-2185
ヘマトキシリンDAKOCS70030-2
エオシンダコCS70130-2
アルシアンブルーダコAR16011-2
クエン酸シグマ・アルドリッチ251275
キシレン純生化学25165-0430
内因性ペルオキシダーゼ DAKOS200380-2
カナダバルサム純生化学23255-1210
ミクロトームブレードFEATHERA35
スライドガラスSUPERIOR1000612
カバーガラスMarienfeld-superior101050
VEGFSanta cruz biotechnologysc-7269
SPSS SoftwareIBMVer. 18.0
多目的遠心分離機LABOGENE1248R
バイオテクノロジー Hs00243225_m1ック 工業

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